TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


PHAN THỊ THẢO

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH
LỞ LOÉT CỦA VI KHUẨN VIBRIO TRÊN CÁ NGỰA
(HIPPOCAMPUS SPP.) TẠI CÁC TRẠI NUÔI
Ở NHA TRANG
Nha Trang, năm 2013
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG



Để hoàn thành Luận văn tốt nghiệp, tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến
cô Văn Hồng Cầm, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi
trường, đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực
hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đặng Thúy Bình – Viện phó Viện Công nghệ
Sinh học và Môi trường, chủ nhiệm đề tài “Bảo tồn và lưu trữ nguồn gene các loài
ốc cối (Conus spp.), trai tai tượng (Tridacna spp.) và cá ngựa (Hippocampus spp.)
ven biển Nam Trung Bộ và Nam Bộ, Việt Nam” đã tạo điều kiện để tôi được thực
hiện các nghiên cứu trong mảng bệnh học trên cá ngựa của đề tài. Xin chân thành
cảm ơn ThS. Trương Thị Thu Thủy - cán bộ quản lý Phòng Vi sinh đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những
người luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn
giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và
thực hiện đồ án vừa qua. Xin chân thành cảm ơn!
Do bước đầu làm quen với môi trường nghiên cứu khoa học, kinh nghiệm
còn hạn chế nên có thể còn nhiều điều thiếu sót. Kính mong nhận được những ý
kiến đóng góp của quý thầy cô giáo và các bạn.

Nha Trang, tháng 6 năm 2013
Sinh viên thực hiện

Phan Thị Thảo
ii

DANH MỤC VIẾT TẮT

APW Alkaline Peptone Water
ATCC American Type Collection Culture
(Bộ sưu tập chủng chuẩn của Mỹ)

trên thế giới 11
1.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh trên cá ngựa (Hippocampus spp.) ở Việt
Nam 13
1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên động vật thủy sản 14
1.3 Mục tiêu của đề tài 15
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1 Đối tượng nghiên cứu 18
2.2 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 18
2.3 Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1 Phân lập vi sinh vật 18
2.3.2 Giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hóa 20
2.4 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được 21
2.5 Lập kháng sinh đồ 22
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1 Kết quả 23
3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn 23
3.1.2 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được 27
iv

3.1.3 Kháng sinh đồ 31
3.2 Thảo luận 34
3.2.1 Định danh vi khuẩn dựa trên các đặc điểm sinh hóa và 16S rDNA 34
3.2.2 Độc lực của các chủng phân lập được 35
3.2.3 Khả năng mẫn cảm với kháng sinh 36
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37
4.1 Kết luận 37
4.2 Kiến nghị 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
v


vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của 2 chủng vi khuẩn TNX-X1 và YR-X2 26
Bảng 3.2: Kết quả cảm nhiễm chủng TNX-X1 trên cá ngựa đen H. kuda 29
Bảng 3.3: Kết quả cảm nhiễm chủng YR-X2 trên cá ngựa đen H. kuda 30
Bảng 3.4: Kết quả xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của hai
chủng vi khuẩn TNX-X1 và YR-X2. 31
Bảng 3.5: Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA của TNX-X1 với các dữ trên
Genbank 33

1

LỜI MỞ ĐẦU

Cá ngựa (Hippocampus spp.) phân bố khắp các vùng nhiệt đới Ấn Độ - Thái
Bình Dương (Lourie và cs., 1999). Chúng thường sống ngụy trang trong các thảm
cỏ biển, rạn đá, rạn san hô. Từ lâu, cá ngựa được biết đến là nhóm động vật thủy sản
có giá trị cao trong y - dược học. Hằng năm, trên thế giới, có khoảng 20 triệu cá
ngựa được đánh bắt từ tự nhiên (Vincent, 1996) với mục đích: điều trị nhức mỏi,
viêm nhiễm, yếu sinh lý hoặc khó sinh nở (Ryan và Ray, 2004; Trương Sỹ Kỳ và
Đỗ Hữu Hoàng, 2006; Ryua và cs., 2010). Cá ngựa không chỉ dùng làm thuốc chữa


3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cá ngựa
1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố của cá ngựa
1.1.1.1 Đặc điểm sinh học
Cá ngựa thuộc bộ phụ cá Chìa Vôi, họ Syngnathidae, giống Hippocampus và
xuất hiện cách đây ít nhất 40 triệu năm (Fritzsche, 1980). Kích thước của các loài cá
này thay đổi khá lớn, loài nhỏ nhất H. minotaur (được tìm thấy ở Úc) chỉ dài 10 –
20mm, trong khi đó loài H. ingens ở Thái Bình Dương dài đến 300mm (Vincent,
1996). Cá ngựa có hình dáng kỳ lạ, đầu giống đầu ngựa, mõm hình ống, không có
răng, thân không có vảy, không có vây đuôi như các loài cá thông thường khác. Cơ
thể cá ngựa có nhiều vòng xương ở thân và đuôi. Cá thường bơi đứng, di chuyển
chậm. Do khả năng di chuyển chậm nên cá thường sống ngụy trang trong các thảm
cỏ biển, rạn đá, rạn san hô và có thể thay đổi màu sắc cơ thể theo môi trường sống
để trốn tránh kẻ thù. Đặc biệt, cá ngựa là loài duy nhất có con đực đẻ con. Do đó, cá
ngựa đực trưởng thành có túi ấp dưới phần bụng, cá ngựa cái không có túi này. Khi
buồng trứng đạt đến giai đoạn chín muồi thì cá cái chuyển trứng của mình vào túi
ấp trứng của con đực - nơi trứng được thụ tinh. Tùy thuộc vào loài và nhiệt độ nước
mà quá trình mang thai có thể kéo dài từ 10 ngày đến 6 tuần (Lourie và cs., 1999).
Cá ngựa con được sinh ra và sống độc lập, không nhận được sự chăm sóc từ cá bố
mẹ. Hầu hết các loài cá ngựa đẻ từ 100 - 200 cá ngựa con trong mỗi đợt sinh nở
(Vincent, 1996).

4 Hình 1.1: Cấu tạo của cá ngựa

Vây ngực
5

ngựa đốm trắng), H. ingens (cá ngựa Thái Bình Dương), H. reidi (cá ngựa Brazil); ở
châu Âu có H. hippocampus (cá ngựa mõm ngắn), H. ramulosus (cá ngựa mõm
dài), Hippocampus algiricus (cá ngựa Tây Phi) được tìm thấy ở bờ biển phía tây của
châu Phi và nhiều loài cá ngựa ở Ấn Độ - Thái Bình Dương như H. kelloggi (cá
ngựa thân trắng), H. borboriensis…
Vì cá ngựa thay đổi màu sắc rất linh hoạt để phù hợp với môi trường sống
nên việc xác định loài thường gặp nhiều khó khăn, vì thế chúng có tới 120 tên gọi
khác nhau. Vincent (1996) cho rằng cá ngựa có màu đen (tên thông thường của loài
H. kuda) là tên gọi chung cho ít nhất 10 loài riêng biệt và được dân gian dùng làm
thuốc chữa bệnh từ lâu.
Theo ITIS (Integrated Taxonomic Information System - Hệ thống phân loại
sinh vật quốc tế) cá ngựa được phân loại như sau :
Giới: Animalia (Động vật)
Ngành: Vertebrata (Động vật có xương sống)
Lớp: Osteichthyes (Cá xương)
Bộ: Gasterosteiformes
Họ: Syngnathidae (Cá chìa vôi)
Giống: Hippocampus (Cá ngựa)

Như đã nói trên, có khoảng 32 loài cá ngựa khác nhau. Tuy nhiên, trong nội
dung bài viết, tôi trình bày về việc phân lập vi khuẩn Vibrio gây bệnh lở loét trên 2
đối tượng chính: Hippocampus kuda (cá ngựa đen) và Hippocampus spinosissimus
(cá ngựa gai).
Cá ngựa đen (Hippocampus kuda)
Cá có màu đen hoặc nâu. Đôi khi cá có màu vàng và sự thay đổi màu và hiện
tượng này chỉ xảy ra đối với con cái. Chiều dài cá khai thác dao động từ 80 –
160mm (Trương Sĩ Kỳ, 2000).

1.1.1.2 Phân bố
Cá ngựa phân bố khắp nơi trên thế giới khoảng từ vĩ độ 45
0
Bắc – 45
0
Nam
(Project Seahorse, 1999). Cá ngựa sống chủ yếu ở vùng cỏ biển, rừng ngập mặn, rạn
san hô hoặc khu vực cửa sông của vùng biển nhiệt đới và ôn đới (Lourie và cs.,
1999). Hầu hết các loài phân bố trong khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương
(IndoPacific) (Vincent, 1996), từ trung tâm Baja California, phía bắc Mexico, qua
Guatemala, El Salvador, Panama, Columbia, Ecuador Pucusana, phía nam Peru, mở
rộng đến phía tây quần đảo Galapagos (Fritzsche, 1980).
Hầu hết cá ngựa được tìm thấy ở độ sâu từ 1 đến 15 mét. Phạm vi di chuyển
của cá ngựa trong môi trường sống tương đối nhỏ và có sự khác nhau giữa con đực
và con cái. Nghiên cứu loài cá ngựa Hippocampus whitei ở Úc cho thấy phạm vi cư
trú của con đực khoảng 1m
2
, con cái khoảng 100m
2
(Vincent, 1996).

Vùng phân bố của cá ngựa
(http://www.discoverlife.org/mp/20q?search=Hippocampus+kuda)
Hình 1.3: Bản đồ phân bố cá ngựa trên thế giới (Project Seahorse, 1999).
Cá ngựa thường sống ở độ mặn 30 - 34‰, nhiệt độ nước 25 - 32
0
C, trên
những rạn san hô hoặc những vùng có thảm thực vật lớn (như rong tảo, cỏ biển), độ
8


1.1.2.1 Lịch sử khai thác và sử dụng cá ngựa
Cá ngựa là loài có giá trị xuất khẩu cao. Theo người tiêu dùng, cá có màu
trắng hoặc màu vàng có chất lượng tốt hơn. Gần 77 quốc gia và vùng lãnh thổ có
các hoạt động buôn bán và kinh doanh cá ngựa (Project Seahorse, 2006; Salin và
Mohankumaran, 2006). Thông thường cá càng lớn giá càng cao, cá ngựa gai và cá
ngựa thân trắng có giá trị cao hơn các loài cá khác (Trương Sĩ Kỳ, 2000).
Trong những năm 1980, chỉ tính riêng ở châu Á, tiêu thụ hàng năm được
ước tính khoảng 45 tấn cá ngựa. Sử dụng cá ngựa với mục đích chữa bệnh tăng 10
lần và tiếp tục tăng từ 8 đến 10% trong mỗi năm sau đó (Vincent, 1996).
Các quốc gia như Trung Quốc, Đài Loan là các nhà nhập khẩu cá ngựa lớn
nhất. Năm 1992, Trung Quốc tiêu thụ khoảng 20 tấn cá ngựa khô. Năm 1994, Đài
Loan nhập khẩu khoảng 3.000.000 con cá ngựa (Seahorse culture, 1998). Theo báo
10

cáo của Vincent (1996), vào năm 1995, có ít nhất 20 triệu con cá ngựa khô đã được
giao dịch trên toàn thế giới. Các nhà xuất khẩu cá ngựa lớn nhất hàng năm là Ấn Độ
với sản lượng bán ít nhất là 1,3 triệu con cá ngựa; Philippines, Thái Lan với sản
lượng bán khoảng 3.000kg cá ngựa khô trên thị trường (Vincent, 1996).Tại
Australia, các dịch vụ kiểm tra ước tính rằng hơn 150.000 mẫu cá ngựa được xuất
khẩu trong khoảng thời gian từ tháng 7 năm 1995 đến tháng 1 năm 1997 (Robert
Hill, 1997).
Tại Việt Nam, nhìn chung cá ngựa tiêu dùng trong nội địa không lớn, chủ
yếu cá được xuất khẩu ra các khu vực như Trung Quốc, Đài Loan thông qua các
Công ty Xuất nhập khẩu Hải sản. Sản lượng xuất khẩu được ước tính ít nhất là 5 tấn
cá ngựa trong năm 1996. Các tỉnh miền Trung (từ Đà Nẵng đến Bình Thuận) sản
lượng khai thác cá ngựa khoảng 2 tấn khô/năm. Hiện nay, trên thị trường Việt Nam,
giá mỗi con cá ngựa đen khoảng 20.000 – 30.000 VNĐ tùy thuộc vào kích thước. Ở
HongKong, giá 1kg cá ngựa khô (chiều dài 150mm trở lên) có thể lên đến 1.200
USD (Trương Sĩ Kỳ, 2000).
1.1.2.2 Giá trị dƣợc liệu của cá ngựa

trọng đến việc nuôi cá ngựa (Truong, 1998; Lourie và cs., 1999).
Sự suy thoái môi trường sống, điều kiện quản lý không thích hợp là nguyên
nhân dẫn đến sự xuất hiện các tác nhân gây bệnh. Phần lớn bệnh do vi khuẩn gây ra
làm giảm mạnh số lượng loài trong thời gian qua (Sreepada và cs., 2002).
Trong số các vi khuẩn gây bệnh ở cá biển, Vibrio spp. là một trong những
nguyên nhân gây ra các thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế. Vi khuẩn này thường có
mặt trong môi trường biển và bùng phát dịch bệnh xảy ra khi cá tiếp xúc với tác
nhân gây bệnh hiện diện khi điều kiện môi trường bị suy thoái (Austin và Austin,
1993). Các nghiên cứu bệnh trên cá ngựa gần đây cho thấy Vibriosis gây chết với tỉ
lệ hơn 90% (Alcaide và cs., 2001). Ortigosa Moo và cs. (1989) cho rằng sự xuất
hiện của V. harveyi và V. mediterranei liên quan mật thiết với nhiệt độ. Vibrio được
phân lập từ nước biển tại Hàn Quốc trong tháng 8 khi nhiệt độ nước và nhu cầu oxy
hóa học (COD) cao, độ pH và độ mặn thấp (Kim và cs., 1990). Tỷ lệ phân lập được
12

chủng V. cholerae tăng khi nhiệt độ và lượng chất hữu cơ tăng (Redacliff và cs.,
1993).
Bệnh Vibriosis là bệnh do một số loài vi khuẩn như Vibrio
parahaemolyticus, V. algonolyticus, V. harveyi, V. vulnificus gây nên với các biểu
hiện mòn vây, cụt đuôi, lở loét, xuất hiện nhiều đốm xuất huyết trên bề mặt cơ thể,
xuất huyết dưới da và phần cơ. Bệnh xảy ra ở nhiều loài cá biển và cửa sông, chúng
thường xuất hiện khi môi trường nước xấu, cá bị sốc và thiếu dinh dưỡng (Glenn và
cs., 2007). Khi nhiễm Vibrio, cơ thể cá trở nên bạc màu, lờ đờ, chán ăn, có các vết
loét đỏ trên cơ thể (Bloch, 1790).
Theo nhiều báo cáo cho thấy rằng vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae xuất hiện
rất nhiều trong đường tiêu hóa của loài cá và giáp xác (Dempsey và cs., 1989;
Ringo và cs., 1995; Spanggaard và cs., 2000; Oxley và cs., 2002) và loài vi khuẩn
này cũng được phân lập từ đường ruột của cá ngựa H. guttulatus trong điều kiện
nuôi nhốt (Balcazar và cs., 2010).
Theo nghiên cứu của Alcaide và cs. (2001), Tendencia (2002), Bombardini

kháng yếu, rất dễ nhiễm bệnh do các tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn và
nấm(Vincent và Clifton-Hadley, 1989). Theo báo cáo của Trương Sĩ Kỳ (2000),
bệnh ở cá ngựa con 5 – 30 ngày tuổi thường gặp là do động vật nguyên sinh
Zoothamnium gây ra. Biểu hiện ban đầu là xuất hiện một vài cá thể Zoothamnium ở
đuôi. Sau đó chúng sinh sản thành tập đoàn, phủ đầy đuôi cá ngựa như những sợi
bông gòn làm cho cá mất khả năng bơi lội và kiếm ăn.
Đối với cá trưởng thành, đôi khi thấy xuất hiện bệnh đốm trắng, bệnh phát
sinh do nhiễm Ichthyophthinius mutifiliis. Khi nhiễm bệnh, cá thường xuất hiện các
đốm trắng trên thân và đuôi, cá bơi lội kém linh hoạt, thường ở trên mặt nước. Sau
vài ngày da cá bị phá hủy dần và làm cá chết (Trương Sĩ Kỳ, 2000).
Ngoài các tác nhân nêu trên, cá ngựa có thể bị nhiễm giun tròn, giun dẹp
hoặc các động vật ký sinh bên ngoài như Amyloodinium, Epistylis, Vorticella và
một số vi khuẩn gây bệnh như: Vibrio alginolyticus, V. anguillarius, …(Trương Sĩ
Kỳ, 2000).

14

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên động vật thủy sản
Bệnh do chi (genus) Vibrio gây ra thuộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales,
lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Họ Vibrionaceae có 6 chi, trong
đó chi Vibrio gồm nhiều loài gây bệnh nguy hiểm cho người và động vật (Phạm
Hồng Sơn, 2005). Đặc điểm chủ yếu của chi Vibrio là có dạng hình que hoặc hơi
uốn cong như dấu phẩy, kích thước 0,3-0,5 x 1,4-2,6µm. Hầu hết các chi Vibrio đều
phân bố trong môi trường nước mặn, thích hợp ở 20-40‰. Chúng không hình thành
bào tử (Ryan và Ray, 2004) và di động nhờ tiên mao đơn cực (Thompson và cs.,
2005). Chúng sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, liên
quan đến các động vật biển, một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật
biển. Vibrio spp. gây bệnh ở cả hai nhóm động vật thủy sản nước mặn và ngọt: cá,
giáp xác, nhuyễn thể. Những vi khuẩn này có thể là tác nhân chính hoặc tác nhân cơ
hội khi được kết hợp với một hoặc nhiều tác nhân khác. Nguyên nhân đầu tiên của

mang, gan tụy, lớp biểu bì, làm giảm sút sản lượng tôm nuôi. Trong đó, V. harveyi
được xác định là tác nhân gây bệnh phát sáng ở trai ngọc Pinctada maxima, tôm sú
Penaeus monodon (Lavilla-Pitogo và cs., 1990) và tôm he Nhật bản Penaeus
japonicus (Pass và cs., 1987; Lavilla-Pitogo và cs., 1990; Karunasagar và cs., 1994;
Leano và cs., 1998) và cá chẽm Lates calcarifer (Tendencia, 2002). Bệnh do nhóm
vi khuẩn phát sáng đã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở Philipines,
Ấn Độ và Indonesia.
Năm 1998, ở Tây Ban Nha, tác nhân gây chết hàng loạt cá ngựa đen
(Hippocampus kuda) và cá ngựa (Hippocampus sp.) được xác định là có liên quan
đến chủng vi khuẩn gây bệnh trên tôm và theo báo cáo của Alcaide và cs. (2001)
chủng vi khuẩn đó là V. harveyi.
1.3 Mục tiêu của đề tài
1.3.1 Mục tiêu nghiên cứu
Tại các trại nuôi cá ngựa ở (Ba Làng, Sông Lô – Nha Trang – Khánh Hòa),
tình trạng cá ngựa chết xảy ra càng nhiều và đã được ghi nhận trong thời gian
(8/2012 - 12/2012). Cá bệnh thường có các triệu chứng ban đầu như da nhợt nhạt,
cá bị cong đuôi, biếng ăn, bơi lờ đờ; sau đó xuất hiện các vết lở loét trên da, cổ,
mõm (Hình 1.6 và 1.7).

16 Hình 1.6: Cá ngựa đen (Hippocampus kuda) bị bệnh lở loét. Hình 1.7: Cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus)
bị bạc da và lở loét đuôi.
Với mục đích phân lập và xác định tác nhân gây bệnh lở loét trên cá ngựa
đen (Hippocampus kuda) và cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus). Xác định
khả năng gây bệnh và khả năng nhạy cảm với một số loại kháng sinh của chủng vi