ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
HUỲNH NGỌC NGHIÊM THỤY
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM a-
GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC Ở
AN GIANG VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT
CHẤT CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC
Oroxylum indicum (L.) Kurz
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 62 44 29 01
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS.Nguyễn Thị Thanh Mai
Thành phố Hồ Chí Minh-2011
Xin chân thành tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Mai, người cô đã định
hướng, truyền thụ những kinh nghiệm quý báo cho tôi,
người đã tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn
thành luận văn này.
Cán bộ Nguyễn Xuân Hải, người luôn nhiệt tình
giúp đỡ tôi trong lúc thực nghiệm, giải đoán cấu trúc
cũng như trình bày khóa luận.
Cán bộ Đặng Hoàng Phú, người đã hỗ trợ tôi rất
nhiều khi thực nghiệm.
Cảm ơn gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên,
chia sẻ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con thực hiện
đề tài.
Thành phố Hồ Chí Minh 9-2011.
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG DANH
MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC

max
và K
m
20
Sự phân loại khoa học của cây núc nác 30
Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài 45
Thể tích các hóa chất trong quy trình thử hoạt tính 52
Thể tích các dung dịch khảo sát nồng độ chất nền 55
Tóm tắt dạng đồ thị các kiểu ức chế 55
Thể tích các dung dịch nghiên cứu động học 57
Tóm tắt cách xác định K; các kiểu ức chế 57
Bảng hiệu suất cao trích được của các mẫu cây thuốc nghiên cứu 65
Kết quả thử hoạt tính của chất đối chứng dương 66
Kết quả thử hoạt tính của 40 mẫu cây thuốc An Giang 66
Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase của các cao phân đoạn
20. Bảng 3.12: Bảng so sánh phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR của hợp chất (4) trong dung môi
21.
22.
23 Bản
g 3.26: Kết quả đo mật độ quang theo thời gian khảo sát 99
24. Bảng 3.27: Thể tích các dung dịch nền và giá trị mật độ quang đo được tương ứng
25
100
26. Bảng 3.28: Kết quả mật độ quang theo sự thay đổi nồng độ chất nền và chất ức chế
27
101

chất ức chế enzym a-glucosidase mới từ nhiều nguồn khác nhau.
43. Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính
ức chế enzym a-glucosidase, cũng như cô lập được nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính
ức chế mạnh. Trong khi đó, Việt Nam có nguồn cây thuốc dồi dào, phong phú, và trong dân
gian ta từ lâu đã lưu truyền nhiều bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường bằng cây cỏ, thế
nhưng chỉ có một vài nghiên cứu về vấn đề này. Tại sao ta không tìm hiểu xem trong nguồn
cây thuốc ấy, liệu có cây thuốc nào có hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase? Từ đó có thể
cô lập được những hợp chất mới có khả năng điều trị bệnh đái tháo đường từ thiên nhiên,
đóng góp cho sự phát triển của ngành hóa dược nước ta.
44.
45.
46. TỔNG QUAN
1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
1.1. Khái niệm
[5]
47. Bệnh đái tháo đường (hay còn gọi là tiểu đường) là một bệnh nguy hiểm đặc
trưng bằng mức đường (glucose) trong máu cao, nguyên nhân là do thiếu insulin có kèm
hoặc không kèm theo kháng insulin với các mức độ khác nhau.
48. Những người mắc bệnh không những có lượng đường trong máu cao, mà cả
trong nước tiểu nữa. Chính vì thế mà bệnh đái tháo đường có tên gọi chuyên môn là
Diabetes mellitus, theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là mật ong.
1.2. Phân loại
[5]
49. Một cách tổng quát, bệnh đái tháo đường được chia làm 2 loại chính: loại 1
và loại 2.
1.2.1. Bệnh đái tháo đường loại 1
50. Bệnh đái tháo đường loại 1 thường xảy ra ở trẻ em từ 10 tuổi trở lên và chiếm
10% trong số các trường hợp bị bệnh. Nguyên nhân là do cơ thể không sản xuất được insulin
vì hệ thống miễn dịch của cơ thể nhầm lẫn đã tấn công vào các tế bào của tuyến tụy làm cho
tuyến tụy không sản xuất ra insulin. Khi không có insulin, tế bào sẽ không chuyển hóa được

mang thai và sẽ biến mất sau khi sinh. Phụ nữ mắc bệnh đái tháo đường thai kì có nhiều khả
năng phát triển thành đái tháo đường loại 2.
1.3. Tác hại
[5]
1.3.1. Các biến chứng cấp tính
57. Một số biến chứng cấp tính có thể xảy ra khi đường huyết quá cao hay quá
thấp, nếu không được điều trị sớm sẽ đe dọa đến tính mạng của nạn nhân. Các biến chứng
này bao gồm các loại sau:
58. Hạ đường huyết (hypoglycemia): bệnh nhân tiêm insulin sẽ gặp hiện
tượng đường huyết hạ thấp quá mức do lượng insulin cần thiết cho cơ thể quá cao. Hạ đường
huyết có thể được điều trị nhanh chóng bằng cách nạp đường vào cơ thể, ngược lại có thể
dẫn tới ngất xỉu.
59. Tăng lượng ceton trong máu: trong quá trình thủy phân chất béo sẽ
tạo ra sản phẩm phụ là ceton. Cơ thể không thể tích trữ lượng ceton quá lớn nên sẽ tìm cách
thải chúng ra ngoài qua nước tiểu. Khi quá nhiều ceton được tạo ra thì cơ thể không thể thải
hết tất cả qua nước tiểu mà tích tụ trong máu gây tăng lượng ceton trong máu. Đây là biến
chứng rất nghiêm trọng do thiếu hormon insulin và chủ yếu xuất hiện ở bệnh nhân bị tiểu
đường loại 1.
60. Tăng áp lực thẩm thấu: bệnh nhân đái tháo đường không được điều
trị sẽ mất rất nhiều dịch do đi tiểu nhiều, gây ra tình trạng cô đặc máu làm áp lực thẩm thấu
trong máu tăng cao. Biến chứng này thường gặp ở bệnh nhân đái tháo đường loại 2 và có thể
gây tử vong nếu không được điều trị.
61. Tăng acid lactic trong máu: là do sự tích tụ acid lactic trong cơ
thể,nếu có quá nhiều acid lactic trong cơ thể thì độ cân bằng sẽ bị
phá vỡ. Biến chứng này rất hiếm gặp và chủ yếu xuất hiện ở bệnh
nhân bị tiểu đường loại 2.
-
1
3 -
1.3.2. Các biến chứng mãn tính

nhập vào, dạng tác dụng chậm dùng vào buổi tối để giữ lượng đường trong máu không tăng
vọt trong nhiều giờ vào hôm sau.
69. Hiện nay, việc uống insulin dạng viên là không thể vì insulin trong môi
trường dạ dày sẽ bị phân hủy. Do đó, các nhà khoa học đang nghiên cứu bọc insulin trong
một vỏ nang thích hợp để thuốc có thể qua được dạ dày, giải phóng ra trong ruột non và
ngấm vào máu. Thời gian gần đây, ta thấy xuất hiện insulin dưới dạng bột, nó được đưa vào
máu bằng đường phổi. Qua nhiều năm nghiên cứu, người ta phát hiện được dạng thuốc bột
này có hiệu quả rất cao.
70. Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 2: phụ thuộc vào tình trạng của
bệnh nhân, phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường hoạt động.
Chỉ bệnh nhân đái tháo đường loại 2 mới dùng thuốc uống kết hợp với những chất đặc hiệu
nhằm làm giảm lượng đường huyết. Bệnh nhân có thể dùng riêng thuốc viên hoặc kết hợp
với phương pháp tiêm insulin.
71. Thuốc sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 chủ yếu chia 3 nhóm:
• Nhóm thuốc thúc tụy tạng tiết thêm insulin như nhóm sulfonylurea: glyburide
(Micronase, DiaBeta, Glynase), glipizide (Glucotrol, Glucotrol XL), glimepiride
(Amaryl); và nhóm meglitinide: repaglinide (Pradin).
• Nhóm thuốc giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn như nhóm biguanide: metformin
(Glucophage, Glucophage XR, Metformin XR); nhóm thiazolidinedione: glitazone,
rosiglitazone (Avandia), pioglitazone (Actos).
• Nhóm ngăn ruột bớt hấp thu chất đường khi ăn bằng chất ức chế enzym a-glucosidase:
acarbose (Precose, Glucobay), miglitol (Glyset).
72. Phương pháp ức chế enzym a-glucosidase trong điều trị đái tháo đường loại 2 được
ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu
-
1
5 -
73. hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của
insulin cũng như kích thích sự sản sinh insulin như các phương pháp khác.
74. 2. ENZYM «-GLUCOSIDASE

lại, chất ức chế thuận nghịch liên kết không đồng hóa trị và theo những kiểu khác nhau tùy
thuộc vào liên kết chất ức chế-enzym, phức enzym-chất nền, hoặc cả hai.
82. Chất ức chế thuận nghịch liên kết với enzym bằng các tương tác không đồng
hóa trị chẳng hạn như liên kết hydrogen, tương tác kị nước và liên kết ion. Nhiều liên kết
yếu giữa các chất ức chế và tâm hoạt tính mạnh mẽ và đặc biệt. Ngược lại, đối với các chất
nền và chất ức chế không thuận nghịch, các chất ức chế thuận nghịch thường không trải qua
phản ứng hóa học khi liên kết với enzym và có thể dễ dàng loại bỏ bằng cách pha loãng hoặc
thẩm tách.
83. Có 4 kiểu của ức chế enzym thuận nghịch, chúng được phân chia dựa theo tác
động của sự thay đổi nồng độ chất nền của enzym trên chất ức chế:
• Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition): chất nền và chất ức chế không liên kết với
enzym cùng một lúc. Điều này có thể là do chất ức chế có ái lực với tâm hoạt động
của một loại enzym nên xảy ra sự cạnh tranh giữa chất nền và chất ức chế cạnh tranh
vào tâm hoạt động của enzym. Đây là loại ức chế có thể được khắc phục bằng nồng độ
đủ cao của chất nền bởi vì những chất ức chế cạnh tranh thường có cấu trúc tương tự
như cấu trúc của chất nền thật.
• Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition): chất ức chế chỉ
84. chỉ kết hợp với phức enzym-chất nền mà không kết hợp với enzym tự do.
85. Đây là một dạng ức chế mà các liên kết của chất ức chế với enzym làm giảm
86. hoạt tính của nó nhưng không ảnh hưởng đến liên kết của enzym-chất nền.
Kết quả là mức độ của sự ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế.
• Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition): chất ức chế kết hợp với
enzym ở vị trí khác với vị trí kết hợp của chất nền tạo thành phức enzym-chất nền-
chất ức chế không bị chuyển hóa tiếp. Như vậy, enzym có thể đồng thời kết hợp cả
-
1
7 -
chất ức chế và chất nền. Chất nền và chất ức chế không cạnh tranh với nhau để kết
hợp với enzym và cũng không thể loại trừ tác dụng kìm hãm bằng cách tăng nồng độ
chất nền.

là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.
95. Gọi v
-1
là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES tạo thành E và S.
Gọi v
2
là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm).
96. v1 =
k1[E][S] v
-1
= k
-1
[ES] v2
= k2[ES]
97. Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:
3.
4. Hình 1.2: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào
[E]
5.
6. Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phản ứng xúc tác enzym trường hợp có 1 chất nền
-
1
9 -
98. k-1[ES] + k2[ES] =
k1[E][S] (1)
99. (k-1+k2)[ES] = k1[E][S] (2)
-
2
0 -
100. Gọi E

110. k
2
[ E o ][ S ]
111. K m — [ S ]
112. Qua đây ta thấy nồng độ enzym càng cao thì vận tốc phản ứng enzym càng
lớn. Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzym liên kết với chất nền, nghĩa là:
113. Vmax= k2[Eo] (5)
114. (với V
max
là vận tốc phản ứng cực đại khi toàn bộ khi toàn bộ E kết hợp với S
tạo thành phức ES).
115. Thay (5) vào phương trình (4) ta được:
116. [ S ]
117. Km — [S ]
118. Phương trình (*) gọi là phương trình Michaelis Menten.
119. K
m
là hằng số Michaelis đặc trưng cho mỗi enzym, đặc trưng cho cho ái lực
của enzym với chất nền, Km càng nhỏ thì ái lực của chất nền với enzym càng lớn, tốc độ
phản ứng càng cao vì vận tốc cực đại Vmax đạt ở giá trị nồng độ chất nền càng thấp.
[ ES ]
=
(4)
V„
=
7. (*)
o max
- 21
-
120. Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis là ở chỗ nó chính là giá trị của nồng

thì V
o =
1/2
Vmax
125. Năm 1934, Lineweaver và Burk, trên cơ sở của phương trình (5) đã nghịch
đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối với việc nghiên cứu ức
hãm enzym. Phương trình (*) sẽ trở thành:
8.
9. Hình 1.3: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ
chất nền.
- 22
-
126. Phương trình này gọi là phương trình Lineweaver - Burk
— = x - 4 - + — (**)
V Vm a x [S] Vm a x
Hình 1.4: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng
vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-Burk
- 23
-
2.3.3. Ảnh hưởng của chất ức chế
127. Chất ức chế là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzym không còn
khả năng xúc tác biến chất nền thành sản phẩm.
2.3.3.1. Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)
128. Trong trường hợp ức chế cạnh tranh, chất nền và chất ức chế cạnh tranh nhau
để tác dụng lên trung tâm hoạt động của enzym.
129. E + s - —
E S — - E + p +
130. I
131. ' K,
132. E l

max
147. Người ta thấy ức chế như vậy phần lớn giữa chất ức chế và chất nền có sự
tương đồng về mặt hóa học. Ví dụ: acid malic có cấu trúc gần giống với acid succinic nên ức
chế cạnh tranh enzym succinatdehydrogenase, là enzym xúc tác cho sự biến đổi acid
succinic thành acid fumaric.
148. Trường hợp đặc biệt của ức chế cạnh tranh là ức chế bằng sản phẩm. Trường
hợp này xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzym và choán vị trí hoạt động
ở phân tử enzym.
149. Xác định K
i
của kiểu ức chế cạnh tranh
150. Đối với kiểu ức chế cạnh tranh, ta có: K
c t
= K
m
[1 + — ] hay:
151.
K
i
152. K ct = ^ [ I ] + K m
153.
K
i
154. Lập đồ thị K
ct
theo [I], vẽ đường thẳng biểu diễn K
ct
theo [I] sẽ cắt trục hoành
tại - K (khi K
ct