ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
HUỲNH NGỌC NGHIÊM
THỤY
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM
α-
GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC
Ở
AN GIANG VÀ THÀNH PHẦN CÁC
HOẠT
CHẤT CỦA THÂN CÂY NÚC
NÁC
Oroxylum indicum (L.)
Kurz
Thành phố Hồ Chí
Minh-2011 Lời cảm ơnXin chân thành tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Mai, người cô đã
định hướng, truyền thụ những kinh nghiệm quý báo
cho tôi, người đã tạo những điều kiện thuận lợi nhất
giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Cán bộ Nguyễn Xuân Hải, người luôn nhiệt
tình giúp đỡ tôi trong lúc thực nghiệm, giải đoán cấu
1.1. Khái niệm
1
1.2. Phân loại
1
1.2.1. Bệnh đái tháo đường loại 1
1
1.2.2. Bệnh đái tháo đường loại 2
1
1.3. Tác hại
3
1.3.1. Các biến chứng cấp tính
3
1.3.2. Các biến chứng mãn tính
4
1.4. Phương pháp điều trị
2.3.3.1. Ức chế cạnh tranh
12
2.3.3.2. Ức chế kháng cạnh tranh
14
2.3.3.3. Ức chế không cạnh tranh
16
-
6
-
2.3.3.4. Uc chS h6n
tp 18
2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 20
2.3.5. Ảnh hưởng của pH 20
2.4. Giới thiệu về enzym α-glucosidase 21
33
3.5.2. Các hợp chất cô lập từ quả
34
3.5.3. Các hợp chất cô lập từ hạt
35
3.5.4. Các hợp chất cô lập từ vỏ thân
36
3.5.5. Các hợp chất cô lập từ vỏ rễ
37
3.6. Hoạt tính sinh học
40
3.6.1. Kháng khuẩn
40
3.6.2. Chống lại tác nhân gây đột biến
40
44
2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 20
2.3.5. Ảnh hưởng của pH 20
2.4. Giới thiệu về enzym α-glucosidase 21
2.5.Tác nhân ức chế enzym α-glucosidase 22
2.5.1. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase từ tổng hợp 22
2.5.2. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cô lập tự nhiên 25
3. TỔNG QUAN VỀ CÂY NÚC NÁC 30
2.1. Điều chế cao thô
44
2.1.1. Nguyên liệu 442.1.2.Ly trích
2.3.1.Khảo sát thời gian phản ứng 542.3.2.Khảo sát nồng độ chất nền 552.3.3.Xác định kiểu ức chế 552.3.4.Xác định hằng số ức chế K
i 573. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ THÂN CÂY NÚC NÁC
59
3.1. Ly trích cao thô
65
1.1. Kết quả điều chế cao thô
65
1.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của 40 mẫu cây
.
66
2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT ỨC CHẾ ENZYM α-
GLUCOSIDASE CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC
69
2.1. Cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất
69
2.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất
72
2.2.1. Hợp chất (1)
72
2.2.2. Hợp chất (2)
100
2.4.3. Xác định kiểu ức chế
101
2.4.4. Xác định K
i
103
KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
2.2.3. Hợp chất (3) 77
2.2.4. Hợp chất (4) 80
2.2.5. Hợp chất (5) 81
2.2.6. Hợp chất (6) 84
2.2.7. Hợp chất (7) 87
2.2.8. Hợp chất (8) 90
2.2.9. Hợp chất (9) 91
55
Bảng 2.4: Tóm tắt dạng đồ thị các kiểu ức chế
55
Bảng 2.5: Thể tích các dung dịch nghiên cứu động học
57
Bảng 2.6: Tóm tắt cách xác định K
i
các kiểu ức chế
57
Bảng 3.1: Bảng hiệu suất cao trích được của các mẫu cây thuốc nghiên cứu
65
Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính của chất đối chứng dương
66
Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính của 40 mẫu cây thuốc An Giang
66
Bảng 3.4: Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao phân đoạn
thô
13
C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (2) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d
6
76
Bảng 3.9: Bảng so sánh phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR của hợp chất (2) trong dung môi
dimetyl sulfoxid-d
6
và hợp chất oroxylosid trong dung môi dimetyl sulfoxid-d
6
76
Bảng 3.10: Bảng số liệu phổ
1
H-NMR (500 MHz),
13
C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (3) trong dung môi aceton-d
6
78
Bảng 3.11: Bảng so sánh phổ
1
86
Bảng 3.17: Bảng số liệu phổ
1
H-NMR (500 MHz),
13
C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (7) trong dung môi aceton-d
6
89
Bảng 3.18: Bảng so sánh phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR của hợp chất (7) trong dung môi
aceton-d
6
và hợp chất 2-(1-hydroxymetyletyl)-4H,9H-naphto[2,3-b]furan-4,9-dion
trong dung môi cloroform-d
1
89
Bảng 3.19: Bảng so sánh phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR của hợp chất (8) trong dung môi
H-NMR,
13
C-NMR của hợp chất (11) trong dung môi
cloroform-d
1
và hợp chất isovanillin trong dung môi cloroform-d
1
95
Bảng 3.23: Bảng số liệu phổ
1
H-NMR (500 MHz),
13
C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (12) trong dung môi aceton-d
6
97
Bảng 3.24: Bảng so sánh phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR của hợp chất (12) trong dung môi
aceton-d
6
và hợp chất β-hydroxypropiovanillon trong dung môi cloroform-d
1
13
C-NMR của hợp chất (5
) trong dung môi
aceton-d
6
và hợp chất ficusal trong dung môi aceton-d
6
84
Bảng 3.26: Kết quả đo mật độ quang theo thời gian khảo sát
99
Bảng 3.27: Thể tích các dung dịch nền và giá trị mật độ quang đo được tương ứng
100
Bảng 3.28: Kết quả mật độ quang theo sự thay đổi nồng độ chất nền và chất ức chế 101
Bảng 3.39: Bảng xử lý số liệu mẫu control và mẫu ức chế
102
Bảng 3.30: Giá trị K
Hình 1.4: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-
Burk
11
Hình 1.5: Kiểu ức chế cạnh tranh
12
Hình 1.6: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-
Burk khi có ức chế cạnh tranh
13
Hình 1.7: Đồ thị biểu diễn K
ct
theo [I] khi có chất ức chế cạnh tranh để xác định K
i
14
Hình 1.8: Kiểu ức chế kháng cạnh
tranh
14
Hình 1.9: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-
Burk khi có ức chế kháng cạnh tranh
15
19
Hình 1.15: Đồ thị biểu diễn K
ht
/V
ht
theo [I] khi có chất ức chế hỗn tạp để xác định
K
i
19
Hình 1.16: Hợp chất disaccarit ức chế enzym α-glucosidase
22
Hình 1.17: Các hợp chất iminosugar ức chế enzym α-glucosidase
23
Hình 1.18: Các hợp chất carbasugar và pseudoaminosugar ức chế enzym α-
glucosidase
24
Hình 1.19: Các hợp chất thiosugar ức chế enzym
α-glucosidase
24
Hình 1.27: Các hợp chất cô lập từ vỏ rễ cây núc nác
39
Hình 2.1: Cấu trúc của acarbose
52
Hình 2.2: Cấu trúc của acid tannic
52
Hình 2.3: Đường biểu diễn phương trình
Lineweaver-Burk 54
Hình 3.1: Cấu trúc các hợp chất cô lập được từ thân cây núc nác
71
Hình 3.2: Cấu trúc của hợp chất (1)
72
Hình 3.3: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (1)
73
83
Hình 3.12: Cấu trúc của hợp chất (6)
84
Hình 3.13: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (6)
85
Hình 3.14: Cấu trúc của hợp chất
(
7
)
87
Hình 3.15: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (7) 88
Hình 3.16: Cấu trúc của hợp chất (8) 90
Hình 3.17: Cấu trúc của hợp chất
(
9
)
91
Hình 3.18: Cấu trúc của hợp chất (10)
DANH MỤC CÁC SƠ
ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phản ứng xúc tác enzym trường hợp có 1 chất
nền
9
Sơ đồ 1.2: Sơ đồ chuyển hóa đường trong cơ thể
21
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế cao
thô 49
Sơ đồ 2.2: Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym
α-glucosidase 51
ĐẦU
Bệnh đái tháo đường với các biến chứng nguy hiểm như bệnh tim mạch, tai
biến mạch máu não, mù lòa, suy thận, đoạn chi đã trở thành nguyên nhân gây tử
vong thứ tư ở các nước đang phát triển. Trên thế giới cứ mỗi 10 giây đồng hồ lại có
một người chết vì những biến chứng của bệnh đái tháo đường cũng như có hai
trường hợp mới được chẩn đoán. Vì vậy, việc nghiên cứu các phương pháp điều trị
bệnh đái tháo đường đang được các nhà khoa học quan tâm.
Trong các hướng điều trị bệnh đái tháo đường loại 2, hướng điều trị bằng
cách ức chế hoạt động của enzym α-glucosidase hiện đang được các nhà nghiên cứu
quan tâm vì có cơ chế đơn giản, an toàn. Tuy nhiên, những loại thuốc ức chế enzym
α-glucosidase đang sử dụng vẫn có nhiều tác dụng phụ, nên nhằm hạn chế những
tác dụng phụ và đưa thêm nhiều lựa chọn cho việc điều trị bệnh đái tháo đường, cần
phải nghiên cứu thêm các chất ức chế enzym α-glucosidase mới từ nhiều nguồn
khác nhau.
Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về
hoạt
tính
ức chế enzym α-glucosidase, cũng như cô lập được nhiều hợp chất thiên nhiên
có hoạt tính ức chế mạnh. Trong khi đó, Việt Nam có nguồn cây thuốc dồi dào,
phong phú, và trong dân gian ta từ lâu đã lưu truyền nhiều bài thuốc chữa bệnh đái
tháo đường bằng cây cỏ, thế nhưng chỉ có một vài nghiên cứu về vấn đề này.
Tại
sao
ta không tìm hiểu xem trong nguồn cây thuốc ấy, liệu có cây thuốc nào có hoạt
tính ức chế enzym α-glucosidase? Từ đó có thể cô lập được những hợp chất mới có
khả năng điều trị bệnh đái tháo đường từ thiên nhiên, đóng góp cho sự phát TỔNG QUAN
- 1 -
1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG 1.1. Khái niệm
[5]Bệnh đái tháo đường (hay còn gọi là tiểu đường) là một bệnh nguy hiểm đặc
trưng bằng mức đường (glucose) trong máu cao, nguyên nhân là do thiếu insulin có
kèm hoặc không kèm theo kháng insulin với các mức độ khác nhau.
Những người mắc bệnh không những có lượng đường trong máu cao, mà cả
trong nước tiểu nữa. Chính vì thế mà bệnh đái tháo đường có tên gọi chuyên môn là
Diabetes mellitus, theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là mật ong.
1.2. Phân loại
[5]
insulin lên và gây quá tải cho tuyến tụy. Theo thời gian, lượng insulin được tiết ra
dần dần giảm. Hình 1.1: Phân loại bệnh tiểu đường Bệnh đái tháo đường loại 2 còn có nguyên nhân tiềm ẩn trong cấu tạo gen,
điều này làm cho bệnh phát triển nhanh hơn. Nếu những người mang gen tiềm ẩn
được phát hiện sớm và có biện pháp phòng ngừa bằng cách ăn uống hợp lí thì bệnh
có thể không xuất hiện hoặc phát triển chậm, nhưng bệnh vẫn giữ ở dạng tiềm ẩn.
Trong trường hợp ngược lại, bệnh sẽ phát triển rất nhanh.
Ngoài ra, còn một vài trường hợp bệnh đái tháo đường khác như đái tháo
đường đôi và đái tháo đường thai kì. Đái tháo đƣờng đôi: Bệnh nhân có cả đặc điểm của đái tháo đường loại 1 và
loại 2. Phần lớn bệnh nhân khi mới được chẩn đoán có những biểu hiện giống như
đái tháo đường loại 2 nhưng trong vòng vài năm sau bệnh nhân cần insulin để kiểm
soát đường huyết. Các chuyên gia cho rằng đái tháo đường đôi là dạng diễn tiến
chậm của đái tháo đường loại 1.
- 3 -
Đái tháo đƣờng thai kì: Đây là dạng đái tháo đường xảy ra ở một số phụ nữ
mang thai và sẽ biến mất sau khi sinh. Phụ nữ mắc bệnh đái tháo đường thai kì có
loại 2 và có thể gây tử vong nếu không được điều trị.
Tăng acid lactic trong máu: là do sự tích tụ acid lactic trong cơ thể,nếu
có quá nhiều acid lactic trong cơ thể thì độ cân bằng sẽ bị phá vỡ. Biến chứng này
rất hiếm gặp và chủ yếu xuất hiện ở bệnh nhân bị tiểu đường loại 2.
- 4 -
1.3.2. Các biến chứng mãn tính Tăng đường huyết lâu dài sẽ đưa đến những biến chứng sau: Bệnh võng mạc (retinopathy): biến chứng quan trọng nhất về mắt
với bệnh nhân đái tháo đường là bệnh võng mạc, có thể dẫn đến mù lòa. Đây là
nguyên nhân chính của các bệnh mù không bẩm sinh. Ngoài ra, điều này có thể dẫn
đến một số bệnh về mắt khác như cườm, liệt cơ vận nhãn.
Bệnh thận (nephropathy): biến chứng thận có thể dẫn đến khi mắc
bệnh tiểu đường là suy thận mãn tính. Bệnh nhân phải thường xuyên chạy thận nhân
tạo. Đây là nguyên nhân giải thích vì sao người mắc bệnh đái tháo đường thường
chiếm đa số trong những trường hợp lọc thận nhân tạo.
Bệnh thần kinh (neuropathy): Biến chứng thần kinh ngoại biên có thể
gặp phải với bệnh nhân đái tháo đường là tê và đau bàn tay, bàn chân, đôi khi làm
không tăng vọt trong nhiều giờ vào hôm sau.
Hiện nay, việc uống insulin dạng viên là không thể vì insulin trong môi
trường dạ dày sẽ bị phân hủy. Do đó, các nhà khoa học đang nghiên cứu bọc insulin
trong một vỏ nang thích hợp để thuốc có thể qua được dạ dày, giải phóng ra trong
ruột non và ngấm vào máu. Thời gian gần đây, ta thấy xuất hiện insulin dưới dạng
bột, nó được đưa vào máu bằng đường phổi. Qua nhiều năm nghiên cứu, người ta
phát hiện được dạng thuốc bột này có hiệu quả rất cao.
Phƣơng pháp điều trị đái tháo đƣờng loại 2: phụ thuộc vào tình trạng của
bệnh nhân, phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường
hoạt động. Chỉ bệnh nhân đái tháo đường loại 2 mới dùng thuốc uống kết hợp với
những chất đặc hiệu nhằm làm giảm lượng đường huyết. Bệnh nhân có thể dùng
riêng thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháp tiêm insulin.
Thuốc sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 chủ yếu chia 3 nhóm: Nhóm thuốc thúc tụy tạng tiết thêm insulin như
nhóm
sulfonylurea:
glyburide (Micronase, DiaBeta, Glynase), glipizide (Glucotrol, Glucotrol XL),
glimepiride (Amaryl); và nhóm meglitinide: repaglinide (Pradin).
Nhóm thuốc giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn
như
nhóm
biguanide: metformin (Glucophage, Glucophage XR, Metformin XR); nhóm
thiazolidinedione: glitazone, rosiglitazone (Avandia), pioglitazone (Actos).
suất, pH.
Như vậy, enzym là một loại protein xúc tác các phản ứng hóa học. Trong các
phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là chất nền, enzym sẽ
biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. Tất cả các quá trình trong tế bào đều
cần enzym. Enzym có tính chọn lọc rất cao đối với chất nền của nó. Hầu hết phản
ứng được xúc tác bởi enzym đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không được
xúc tác. Có trên 4000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym.
Hoạt tính của enzym chịu tác động bởi nhiều yếu tố. Tác nhân ức chế là các
phân tử làm giảm hoạt tính của enzym, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tử
làm tăng hoạt tính của enzym.
2.2. Chất ức chế enzym
[2]
Chất ức chế enzym là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzym xúc
tác. Hoạt động của một enzym có thể giết chết một mầm bệnh hoặc điều chỉnh lại
sự không cân bằng trong chuyển hóa. Có nhiều loại thuốc ức chế enzym, chúng
cũng được sử dụng như là chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu. Không phải tất cả các phân
tử liên kết với enzym đều là chất ức chế enzym, những chất hoạt hóa liên kết với
các enzym và làm tăng hoạt tính enzym mà chúng liên kết.
- 7 -
ái lực với tâm hoạt động của một loại enzym nên xảy ra sự cạnh tranh giữa
chất nền và chất ức chế cạnh tranh vào tâm hoạt động của enzym. Đây là loại
ức chế có thể được khắc phục bằng nồng độ đủ cao của chất nền bởi vì những
chất ức chế cạnh tranh thường có cấu trúc tương tự như cấu trúc của chất nền
thật.
Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition): chất ức
chế
chỉ
chỉ kết hợp với phức enzym-chất nền mà không kết hợp với enzym tự do.
Đây là một dạng ức chế mà các liên kết của chất ức chế với enzym làm giảm
Copyright: Tài liệu đại học ©