Ketnooi.com vì sự nghiệp giáo dục

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HUỲNH NGỌC NGHIÊM THỤY

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM αGLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC Ở
AN GIANG VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT
CHẤT CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC
Oroxylum indicum (L.) Kurz
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 62 44 29 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS.Nguyễn Thị Thanh Mai

Thành phố Hồ Chí Minh-2011


Ketnooi.com vì sự nghiệp giáo dục

Lời cảm ơn
Xin chân thành tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Mai, người cô đã
định hướng, truyền thụ những kinh nghiệm quý báo
cho tôi, người đã tạo những điều kiện thuận lợi nhất
giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Cán bộ Nguyễn Xuân Hải, người luôn nhiệt
tình giúp đỡ tôi trong lúc thực nghiệm, giải đoán cấu
trúc cũng như trình bày khóa luận.

2.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzym .................................................. 8
2.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất nền [S] ......................................... 9
2.3.3. Ảnh hưởng của chất ức chế ...................................................... 12
2.3.3.1. Ức chế cạnh tranh ....................................................... 12
2.3.3.2. Ức chế kháng cạnh tranh ............................................ 14
2.3.3.3. Ức chế không cạnh tranh ............................................ 16


Ketnooi.com vì sự nghiệp giáo dục

- 6-

2.3.3.4. Uc chS h6n tp ........................................................... 18


2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................... 20
2.3.5. Ảnh hưởng của pH ................................................................... 20
2.4. Giới thiệu về enzym α-glucosidase ...................................................... 21
2.5.Tác nhân ức chế enzym α-glucosidase ................................................. 22
2.5.1. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase từ tổng hợp ........... 22
2.5.2. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cô lập tự nhiên ...... 25
3. TỔNG QUAN VỀ CÂY NÚC NÁC ................................................................. 30
3.1. Tên gọi ...................................................................................................... 30
3.2. Mô tả thực vật ........................................................................................... 31
3.3. Phân bố ..................................................................................................... 32
3.4. Dược tính .................................................................................................. 33
3.5. Thành phần hóa học ................................................................................... 33
3.5.1. Các hợp chất cô lập từ lá .................................................................. 33
3.5.2. Các hợp chất cô lập từ quả ............................................................... 34
3.5.3. Các hợp chất cô lập từ hạt ................................................................ 35

2.3.4.Xác định hằng số ức chế Ki ..................................................... 57
3. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ THÂN CÂY NÚC NÁC ................................. 59
3.1. Ly trích cao thô ...................................................................................... 59
3.2. Cô lập hợp chất ...................................................................................... 60
3.2.1.Cô lập chất từ phân đoạn A ....................................................... 60
3.2.2.Cô lập chất từ phân đoạn B ....................................................... 61
3.2.3.Cô lập chất từ phân đoạn C và D ............................................... 61
KẾT QUẢ
1. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA 40
CÂY THUỐC AN GIANG .............................................................................. 65
1.1. Kết quả điều chế cao thô ................................................................. 65
1.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của 40 mẫu cây . 66
2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT ỨC CHẾ ENZYM αGLUCOSIDASE CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC .................................................. 69
2.1. Cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất ............................................... 69
2.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất ............................................................. 72
2.2.1. Hợp chất (1) ..................................................................... 72
2.2.2. Hợp chất (2) ..................................................................... 74


2.2.3. Hợp chất (3) ..................................................................... 77
2.2.4. Hợp chất (4) ..................................................................... 80
2.2.5. Hợp chất (5) ..................................................................... 81
2.2.6. Hợp chất (6) ..................................................................... 84
2.2.7. Hợp chất (7) ..................................................................... 87
2.2.8. Hợp chất (8) ..................................................................... 90
2.2.9. Hợp chất (9) ..................................................................... 91
2.2.10. Hợp chất (10) ................................................................. 92
2.2.11. Hợp chất (11) ................................................................. 94
2.2.12. Hợp chất (12) ................................................................. 96
2.3. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất cô lập được ................................ 98

Bảng 3.6: Bảng số liệu phổ H-NMR (500 MHz), C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (1) trong dung môi cloroform-d1 .................................. 73
1

13

Bảng 3.7: Bảng so sánh phổ H-NMR, C-NMR của hợp chất (1) trong dung môi
cloroform-d1 và hợp chất oroxylin A trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 ............ 74
1

13

Bảng 3.8: Bảng số liệu phổ H-NMR (500 MHz), C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (2) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 ...................... 76
1

13

Bảng 3.9: Bảng so sánh phổ H-NMR, C-NMR của hợp chất (2) trong dung môi
dimetyl sulfoxid-d6 và hợp chất oroxylosid trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 .. 76
1

13

Bảng 3.10: Bảng số liệu phổ H-NMR (500 MHz), C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (3) trong dung môi aceton-d6 ....................................... 78
1

13


13

Bảng 3.16: Bảng so sánh phổ H-NMR, C-NMR của hợp chất (6) trong dung môi
aceton-d6 và hợp chất balanophonin trong dung môi cloroform-d1 ....................... 86
1

13

Bảng 3.17: Bảng số liệu phổ H-NMR (500 MHz), C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (7) trong dung môi aceton-d6 ....................................... 89
1

13

Bảng 3.18: Bảng so sánh phổ H-NMR, C-NMR của hợp chất (7) trong dung môi
aceton-d6 và hợp chất 2-(1-hydroxymetyletyl)-4H,9H-naphto[2,3-b]furan-4,9-dion
trong dung môi cloroform-d1 ................................................................................ 89
1

13

Bảng 3.19: Bảng so sánh phổ H-NMR, C-NMR của hợp chất (8) trong dung môi
dimetyl sulfoxid-d6 và hợp chất acid salicylic trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 91
1

13

Bảng 3.20: Bảng so sánh phổ H-NMR, C-NMR của hợp chất (9) trong dung môi
aceton-d6 và hợp chất acid p-hydroxybenzoic trong dung môi aceton-d6 .............. 92
1


Bảng 3.28: Kết quả mật độ quang theo sự thay đổi nồng độ chất nền và chất ức chế
............................................................................................................................ 101
Bảng 3.39: Bảng xử lý số liệu mẫu control và mẫu ức chế .................................. 102
Bảng 3.30: Giá trị Kht/Vht ứng với các nồng độ ức chế khác nhau ........................ 103


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Phân loại bệnh tiếu đường ..................................................................... . 2
Hình 1.2: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] .......................................... . 9
Hình 1.3: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất nền ............................... 11
Hình 1.4: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo LineweaverBurk ..................................................................................................................... 11
Hình 1.5: Kiểu ức chế cạnh tranh .......................................................................... 12
Hình 1.6: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo LineweaverBurk khi có ức chế cạnh tranh .............................................................................. 13
Hình 1.7: Đồ thị biểu diễn Kct theo [I] khi có chất ức chế cạnh tranh để xác định Ki
.............................................................................................................................. 14
Hình 1.8: Kiểu ức chế kháng cạnh tranh ................................................................ 14
Hình 1.9: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo LineweaverBurk khi có ức chế kháng cạnh tranh .................................................................... 15
Hình 1.10: Đồ thị biểu diễn 1/Vkct và 1/Kkct theo [I] khi có chất ức chế kháng cạnh
tranh để xác định Ki .............................................................................................. 16
Hình 1.11: Kiểu ức chế không cạnh tranh ............................................................. 16
Hình 1.12: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo
Lineweaver-Burk khi có ức chế không cạnh tranh ................................................ 17
Hình 1.13: Đồ thị biểu diễn 1/Vkoct theo [I] khi có chất ức chế không cạnh tranh để
xác định Ki ........................................................................................................... 18
Hình 1.14: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo
Lineweaver-Burk khi có ức chế hỗn tạp ................................................................ 19
Hình 1.15: Đồ thị biểu diễn Kht/Vht theo [I] khi có chất ức chế hỗn tạp để xác định
Ki .......................................................................................................................... 19
Hình 1.16: Hợp chất disaccarit ức chế enzym α-glucosidase ................................ 22



Hình 3.14: Cấu trúc của hợp chất (7) ..................................................................... 87
Hình 3.15: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (7) ....................................88
Hình 3.16: Cấu trúc của hợp chất (8) ......................................................................90
Hình 3.17: Cấu trúc của hợp chất (9) .......................................................................91
Hình 3.18: Cấu trúc của hợp chất (10) .............................................................. ......92
Hình 3.19: Cấu trúc của hợp chất (11) ....................................................................94
Hình 3.20: Cấu trúc của hợp chất (12) ....................................................................96
Hình 3.21: Một số tương quan HMBC của hợp chất (12) ........................................97
Hình 3.22: Đồ thị biểu diễn mật độ quang theo thời gian .................................. ..100
Hình 3.23: Đồ thị biểu diễn mật độ quang theo nồng độ chất nền .........................101
Hình 3.24: Đồ thị biểu diễn 1/V0 theo 1/[S] với các nồng độ ức chế khác nhau.... ..102
Hình 3.25: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của Kht/Vht vào nồng độ chất ức chế ... ...103


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phản ứng xúc tác enzym trường hợp có 1 chất nền.................... 9
Sơ đồ 1.2: Sơ đồ chuyển hóa đường trong cơ thể .............................................. 21
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế cao thô ...................................................................... 49
Sơ đồ 2.2: Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase ......................... 51
Sơ đồ 2.3: Quy trình khảo sát thời gian phản ứng .............................................. 54
Sơ đồ 2.4: Quy trình ly trích cao từ thân cây núc nác......................................... 59
Sơ đồ 2.5: Quy trình cô lập chất từ phân đoạn A................................................ 62
Sơ đồ 2.6: Quy trình cô lập chất từ phân đoạn B................................................ 63
Sơ đồ 3.1: Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase các cây thuốc có IC50 50-100 μM
-1

mL .................................................................................................................. 68



1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
1.1. Khái niệm [5]
Bệnh đái tháo đường (hay còn gọi là tiểu đường) là một bệnh nguy hiểm đặc
trưng bằng mức đường (glucose) trong máu cao, nguyên nhân là do thiếu insulin có
kèm hoặc không kèm theo kháng insulin với các mức độ khác nhau.
Những người mắc bệnh không những có lượng đường trong máu cao, mà cả
trong nước tiểu nữa. Chính vì thế mà bệnh đái tháo đường có tên gọi chuyên môn là
Diabetes mellitus, theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là mật ong.

1.2. Phân loại

[5]

Một cách tổng quát, bệnh đái tháo đường được chia làm 2 loại chính: loại 1
và loại 2.

1.2.1. Bệnh đái tháo đường loại 1
Bệnh đái tháo đường loại 1 thường xảy ra ở trẻ em từ 10 tuổi trở lên và
chiếm 10% trong số các trường hợp bị bệnh. Nguyên nhân là do cơ thể không sản
xuất được insulin vì hệ thống miễn dịch của cơ thể nhầm lẫn đã tấn công vào các tế
bào của tuyến tụy làm cho tuyến tụy không sản xuất ra insulin. Khi không có
insulin, tế bào sẽ không chuyển hóa được glucose làm cho lượng glucose trong máu
tăng cao.

1.2.2. Bệnh đái tháo đường loại 2
Bệnh thường xảy ra ở người trên 50 tuổi, chiếm khoảng gần 90 % trong tổng
số trường hợp bị đái tháo đường. Đối với những người bị đái tháo đường loại 2, mặc
dù cơ thể vẫn sản xuất được insulin nhưng các tế bào không hoặc kém nhạy cảm với
sự có mặt của insulin. Lượng đường trong máu do không được chuyển hóa thành

1.3. Tác hại

[5]

1.3.1. Các biến chứng cấp tính
Một số biến chứng cấp tính có thể xảy ra khi đường huyết quá cao hay quá
thấp, nếu không được điều trị sớm sẽ đe dọa đến tính mạng của nạn nhân. Các biến
chứng này bao gồm các loại sau:
Hạ đường huyết (hypoglycemia): bệnh nhân tiêm insulin sẽ gặp hiện
tượng đường huyết hạ thấp quá mức do lượng insulin cần thiết cho cơ thể quá cao.
Hạ đường huyết có thể được điều trị nhanh chóng bằng cách nạp đường vào cơ thể,
ngược lại có thể dẫn tới ngất xỉu.
Tăng lượng ceton trong máu: trong quá trình thủy phân chất béo sẽ tạo
ra sản phẩm phụ là ceton. Cơ thể không thể tích trữ lượng ceton quá lớn nên sẽ tìm
cách thải chúng ra ngoài qua nước tiểu. Khi quá nhiều ceton được tạo ra thì cơ thể
không thể thải hết tất cả qua nước tiểu mà tích tụ trong máu gây tăng lượng ceton
trong máu. Đây là biến chứng rất nghiêm trọng do thiếu hormon insulin và chủ yếu
xuất hiện ở bệnh nhân bị tiểu đường loại 1.
Tăng áp lực thẩm thấu: bệnh nhân đái tháo đường không được điều trị
sẽ mất rất nhiều dịch do đi tiểu nhiều, gây ra tình trạng cô đặc máu làm áp lực thẩm
thấu trong máu tăng cao. Biến chứng này thường gặp ở bệnh nhân đái tháo đường
loại 2 và có thể gây tử vong nếu không được điều trị.
Tăng acid lactic trong máu: là do sự tích tụ acid lactic trong cơ thể,nếu
có quá nhiều acid lactic trong cơ thể thì độ cân bằng sẽ bị phá vỡ. Biến chứng này
rất hiếm gặp và chủ yếu xuất hiện ở bệnh nhân bị tiểu đường loại 2.


-4-

1.3.2. Các biến chứng mãn tính

-5-

hai dạng chính tùy theo tác dụng nhanh hay chậm: dạng tác dụng nhanh dùng ngay
trước bữa ăn để tăng lượng insulin trong cơ thể phù hợp với lượng carbohydrat sắp
nhập vào, dạng tác dụng chậm dùng vào buổi tối để giữ lượng đường trong máu
không tăng vọt trong nhiều giờ vào hôm sau.
Hiện nay, việc uống insulin dạng viên là không thể vì insulin trong môi
trường dạ dày sẽ bị phân hủy. Do đó, các nhà khoa học đang nghiên cứu bọc insulin
trong một vỏ nang thích hợp để thuốc có thể qua được dạ dày, giải phóng ra trong
ruột non và ngấm vào máu. Thời gian gần đây, ta thấy xuất hiện insulin dưới dạng
bột, nó được đưa vào máu bằng đường phổi. Qua nhiều năm nghiên cứu, người ta
phát hiện được dạng thuốc bột này có hiệu quả rất cao.
Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 2: phụ thuộc vào tình trạng của
bệnh nhân, phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường
hoạt động. Chỉ bệnh nhân đái tháo đường loại 2 mới dùng thuốc uống kết hợp với
những chất đặc hiệu nhằm làm giảm lượng đường huyết. Bệnh nhân có thể dùng
riêng thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháp tiêm insulin.
Thuốc sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 chủ yếu chia 3 nhóm:
 Nhóm thuốc thúc tụy tạng tiết thêm insulin như nhóm sulfonylurea:
glyburide (Micronase, DiaBeta, Glynase), glipizide (Glucotrol, Glucotrol XL),
glimepiride (Amaryl); và nhóm meglitinide: repaglinide (Pradin).
 Nhóm thuốc giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn như nhóm
biguanide: metformin (Glucophage, Glucophage XR, Metformin XR); nhóm
thiazolidinedione: glitazone, rosiglitazone (Avandia), pioglitazone (Actos).
 Nhóm ngăn ruột bớt hấp thu chất đường khi ăn bằng chất ức chế
enzym α-glucosidase: acarbose (Precose, Glucobay), miglitol (Glyset).
Phương pháp ức chế enzym α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường loại
2 được ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu



sự không cân bằng trong chuyển hóa. Có nhiều loại thuốc ức chế enzym, chúng
cũng được sử dụng như là chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu. Không phải tất cả các phân
tử liên kết với enzym đều là chất ức chế enzym, những chất hoạt hóa liên kết với
các enzym và làm tăng hoạt tính enzym mà chúng liên kết.


-7-

Sự liên kết của một chất ức chế có thể ngăn chặn một chất nền đi vào tâm
hoạt động của enzym và gây trở ngại cho các phản ứng xúc tác của enzym đó. Chất
ức chế có thể liên kết với enzym thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Chất ức
chế không thuận nghịch thường phản ứng với enzym và thay đổi nó về mặt hóa học.
Những chất ức chế đó làm thay đổi dư lượng các acid amin quan trọng cần thiết cho
hoạt động của enzym. Ngược lại, chất ức chế thuận nghịch liên kết không đồng hóa
trị và theo những kiểu khác nhau tùy thuộc vào liên kết chất ức chế-enzym, phức
enzym-chất nền, hoặc cả hai.
Chất ức chế thuận nghịch liên kết với enzym bằng các tương tác không đồng
hóa trị chẳng hạn như liên kết hydrogen, tương tác kị nước và liên kết ion. Nhiều
liên kết yếu giữa các chất ức chế và tâm hoạt tính mạnh mẽ và đặc biệt. Ngược lại,
đối với các chất nền và chất ức chế không thuận nghịch, các chất ức chế thuận
nghịch thường không trải qua phản ứng hóa học khi liên kết với enzym và có thể dễ
dàng loại bỏ bằng cách pha loãng hoặc thẩm tách.
Có 4 kiểu của ức chế enzym thuận nghịch, chúng được phân chia dựa theo
tác động của sự thay đổi nồng độ chất nền của enzym trên chất ức chế:
 Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition): chất nền và chất ức chế
không liên kết với enzym cùng một lúc. Điều này có thể là do chất ức chế có
ái lực với tâm hoạt động của một loại enzym nên xảy ra sự cạnh tranh giữa
chất nền và chất ức chế cạnh tranh vào tâm hoạt động của enzym. Đây là loại
ức chế có thể được khắc phục bằng nồng độ đủ cao của chất nền bởi vì những
chất ức chế cạnh tranh thường có cấu trúc tương tự như cấu trúc của chất nền

học thông thường mà còn ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng thông qua tác dụng của
chúng đối với cấu trúc phân tử enzym.

2.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzym
Trong điều kiện dư thừa chất nền, nghĩa là [S] >> [E] thì tốc độ phản ứng
phụ thuộc vào [E], v = K[E] có dạng y = ax. Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách
đo vận tốc phản ứng do enzym đó xúc tác.
Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất ức chế hay hoạt hóa thì
vận tốc phản ứng do enzym xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó.


-9-

Hình 1.2: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]

2.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất nền [S]
Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chỉ một chất nền S, E xúc tác tạo
thành một sản phẩm P

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phản ứng xúc tác enzym trường hợp có 1 chất nền

Phức ES gọi là phức Michaelis- Menten.
Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.
Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES tạo thành E và S.
Gọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm).
v1 = k1[E][S]
v-1 = k-1[ES]
v2 = k2[ES]
Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:
k-1[ES] + k2[ES] = k1[E][S]