ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN VĂN TÍNH
TỔNG HỢP CƠ CHẤT, CHẾ TẠO KÍT
VÀ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU ĐỂ
NHUỘM TẾ BÀO PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN
BỆNH UNG THƢ BẠCH CẦU NGƢỜI

Chuyên nHóa hữu cơ
Mã số:
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC ỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
Hƣớng dẫn 1: PGS.TSKH. Lƣu Văn Bôi
Hà Nội,2012

HÀ NỘI - 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN VĂN TÍNH

DANH MỤC CÁC HÌNH
iv
CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
v
MỞ ĐẦU
1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1. Tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
3
1.1.1. Phƣơng pháp một giai đoạn
3
1.1.2. Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit bằng phƣơng
pháp hai giai đoạn

5
1.2. Tính chất của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
6
1.2.1. Tính chất vật lý
6
1.2.2. Tính chất phổ
7
1.2.3. Tính chất hóa học
8
1.3. Ứng dụng của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
10
1.3.1. Ứng dụng để sản xuất phẩm màu
10
1.3.2. Sản xuất cơ chất để nhuộm tế bào bạch cầu
13

2.3.6. Pha chế kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời bằng các cơ chất
naphtol AS-OL -clopropionat tổng hợp đƣợc

42
2.3.7. Đánh giá thời gian ổn định của bộ kít
43
2.3.8. Ứng dụng bộ kít để chẩn đoán dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp
43
2.3.9. Nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính
44
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
47
3.1. Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
48
3.1.1. Tổng hợp các naphtol AS-X bằng phƣơng pháp truyền thống
48
3.1.2. Tổng hợp các naphtol AS-X bằng phƣơng pháp lò vi sóng
51
3.1.3. Tổng hợp 3-hiđroxi-[N-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxyl)]naphtalen
-2-cacboxamit

63
3.2. Tổng hợp 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat
73
3.3. Nghiên cứu nhuộm tế bào bạch cầu bằng các cơ chất tổng hợp đƣợc
95
3.3.1. Nghiên cứu tối ƣu hoá phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu
96
3.3.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng của cơ chất đến kết quả nhuộm
101

mại hóa

6
Bảng 1.2.
Một số phẩm màu từ naphtol AS
10
Bảng 1.3.
Mối tƣơng quan giữa độ tan và cấu trúc phẩm màu
12
Bảng 1.4.
Các lĩnh vực ứng dụng của phẩm màu naphtol AS
13
Bảng 1.5.
Bảng phân loại theo tiêu chuẩn FAB về nhuộm hóa học tế bào
19
Bảng 2.1.
Giá trị ri và Ri
38
Bảng 2.2.
Ma trận mã hóa đơn hình S
0

38
Bảng 2.3.
Ma trận mã hóa thay số đơn hình S
0

38
Bảng 2.4.
Lựa chọn mức gốc thực nghiệm

59
Bảng 3.6.
Ảnh hƣởng của hiệu ứng điện tử các nhóm thế lên độ chuyển dịch
hóa học của các proton OH và NH

61
Bảng 3.7.
Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và ESI-MS của
3-hiđroxi-N-( xiclohexyl/phenyl/1-naphtyl/1-antraxyl) naphtalen-
2-cacboxamit 70
Bảng 3.8.
Phổ
1
H-NMR của 3-hiđroxi-N-(xiclohexyl/phenyl/1-naphtyl/
1-antraxyl)naphtalen-2-cacboxamit

71
Bảng 3.9.
Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, số liệu phổ IR và ESI-
MS của các naphtol AS-X cloaxetat

79
Bảng 3.10.
Dữ liệu phổ
1
H-NMR của các naphtol AS-X cloaxetat
81

92
Bảng 3.16.
Phổ
1
H-NMR của các naphtol AS-D và naphtol AS-OL
cacboxylat

93
Bảng 3.17.
Lựa chọn mức gốc thực nghiệm
97
Bảng 3.18.
Kết quả nhuộm theo phƣơng pháp quy hoạch hóa thực nghiệm
đơn hình

97
Bảng 3.19.
Kết quả thí nghiệm lặp lại ở đỉnh tối ƣu
99
Bảng 3.20.
Tính đặc hiệu của 26 cơ chất naphtol AS-X cloaxetat và
α-clopropionat đối với phản ứng nhuộm esteraza các loại bạch
cầu máu ngoại vi 102
Bảng 3.21.
Điểm nhuộm của các este naphtol AS-X cloaxetat
102
Bảng 3.22.

118
Bảng 3.30.
Độ đặc hiệu của cơ chất naphtol AS-OL α-clopropionat và kít của
hãng Sigma đối với phản ứng nhuộm esteraza các loại bạch cầu
trong tủy.

120
Bảng 3.31.
Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời bằng kít naphtol
AS-OL α-clopropionat tổng hợp đƣợc và kít naphtol AS-D
cloaxetat hãng Sigma. 121

vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.
Tâm hoạt động của esteraza
14
Hình 1.2.
Phân tử esteraza
16
Hình 2.1.
Màn hình cài đặt chƣơng trình tính toán
44
Hình 2.2.
Màn hình cài đặt phƣơng pháp tính toán
45
Hình 2.3.

98
Hình 3.10.
Ảnh nhuộm enzym esteraza bạch cầu ở điều kiện tối ƣu hoá với
cơ chất naphtol AS-D cloaxetat (Sigma-Aldrich)

99
Hình 3.11.
Ảnh nhuộm esteraza bạch cầu bằng các cơ chất IIIa và IIIi
104
Hình 3.12.
Ảnh nhuộm esteraza bạch cầu bằng naphtol cơ chất Vc và Vg
106
Hình 3.13.
Kết quả nhuộm esteraza bạch cầu ngƣời bằng các cơ chất naphtol
AS-D và naphtol AS-OL cloaxetat và α-clopropionat

109
Hình 3.14.
Góc nhị diện của nhóm cacboxylat
111
Hình 3.15.
Biểu đồ biểu thị độ ổn định của bộ kít theo thời gian
119
Hình 3.16.
Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời bằng các cơ
chất naphtol AS-OL α-clopropionat tổng hợp đƣợc và naphtol
AS-D cloaxetat hãng Sigma. 122

Nhuộm Esteraza không đặc hiệu với chất ức chế là NaF.
FAB:
Hội các nhà Huyết học Anh-Pháp-Mỹ (French-American-British)
FPIA:
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Fluorescen Polary Immuno
Assay)
Glu:
Gly
Glutamine
Glycin
His:
Histidine
IUB:
Hiệp hội Hóa sinh quốc tế (International Union of Biochemistry)
L1
Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho đã biệt hóa (Acute lymphoblastic)
L2
Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho chƣa biệt hóa (Acute
lymphoblastic)
L3
Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại Burkitt (Acute
lymphoblastic)
M0
Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ biệt hóa tối thiểu (Minimally
differentiated acute myeloid).
M1
Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ không có tế bào trƣởng thành (Acute
myeloblastic without maturation).
9


Nhuộm photphataza axit.
PAS
Nhuộm glucozit bằng thuốc thử Periodic Axit Schiff.
PER
Nhuộm peroxydaza.
QSAR:
Mối tƣơng quan định lƣợng giữa hoạt tính và cấu trúc (Quantitaive
Structure-Activity Relationship)
SD
Nhuộm hạt mỡ bằng Sudan B
Ser:
Serine
SUDAN
Tên riêng của phẩm màu
THF
TetraHydroFuran
Tnc
Nhiệt độ nóng chảy
Ts
Nhiệt độ sôi
WHO:
Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

10

MỞ ĐẦU
Bệnh bạch cầu cấp là một nhóm bệnh của cơ quan tạo máu chiếm tỷ lệ
khoảng 38,5% các bệnh về máu [1]. Cũng nhƣ các bệnh ung thƣ khác, bệnh có xu
hƣớng ngày càng tăng do môi trƣờng ô nhiễm, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật
không có kiểm soát và hậu quả của các chất da cam dioxin do chiến tranh để lại [2].


Do việc nghiên cứu thiếu hệ thống nên chƣa xác định đƣợc mối tƣơng quan
giữa cấu trúc và hoạt tính, chƣa tìm đƣợc cơ chất có độ nhạy và độ đặc hiệu cao
nhất. Quá trình nhuộm chƣa đƣợc tối ƣu hóa gây khó khăn cho cán bộ thực hiện và
tốn kém cho bệnh nhân. Nƣớc ta chƣa sản xuất đƣợc cơ chất, phải nhập ngoại. Cơ
chất dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ > -20
0
C, là một trong những khó khăn lớn cho việc
vận chuyển và bảo quản. Những thách thức đó đã làm cho phƣơng pháp xét nghiệm
này chƣa đƣợc triển khai rộng rãi ở Việt Nam.
Vì vậy, đề tài nghiên cứu tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và tối ƣu hóa quy
trình nhuộm esteraza đặc hiệu để phân loại tế bào bạch cầu phục vụ việc khám và
điều trị bệnh ung thƣ máu có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế - xã hội sâu sắc.
Mục tiêu của đề tài là xây dựng phƣơng pháp mới, hiệu quả cao để tổng hợp
cơ chất; khảo sát một cách có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để
tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao; tối ƣu hóa các điều kiện
nhuộm và chế tạo kít nhuộm esteraza để phân loại tế bào phục vụ việc khám và điều
trị bệnh ung thƣ máu.
Nội dung nghiên cứu
1- Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên
liệu điều chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu ngƣời.
2- Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm
cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời.
3- Xác định cấu trúc của các hợp chất điều chế đƣợc bằng các phƣơng pháp vật lý
và hóa lý hiện đại (Phổ IR,
1
H-NMR và MS) và nghiên cứu mối tƣơng quan giữa
độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử cơ chất bằng phƣơng
pháp tính hóa lƣợng tử.
4- Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để

R
1
là các vòng thơm có các nhóm thế thƣờng ở vị trí octo- hoặc para-
Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit đƣợc ứng dụng rất
rộng rãi trong thực tiễn. Trong công nghiệp chúng đƣợc dùng làm nguyên liệu đầu
để sản xuất phẩm màu, đặc biệt là mực in. Do quy trình sản xuất đơn giản, gam màu
phong phú, độ bền cao, nên loại hợp chất này đã có lúc chiếm tỷ trọng rất lớn đối
với thị trƣờng phẩm màu thế giới. Vai trò của họ hợp chất này trở nên đặc biệt quan
trọng khi ngƣời ta sử dụng chúng làm nguyên liệu sản xuất cơ chất để nhuộm
esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu ngƣời. Do những ứng dụng quan trọng nhƣ vậy,
nên loại hợp chất này đã thu hút sự quan tâm to lớn của các nhà khoa học. Số công
trình công bố trong lĩnh vực này rất lớn và đa dạng. Trong khuôn khổ tổng quan này
chỉ đề cập các phƣơng pháp tổng hợp quan trọng, những tính chất hóa lý cơ bản và
một số ứng dụng phổ biến liên quan đến họ hợp chất này.
1.1. Tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
Theo tài liệu [45] ngƣời ta tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacbox-
amit chủ yếu theo phƣơng pháp trực tiếp một giai đoạn hoặc phƣơng pháp gián tiếp
hai giai đoạn.
1.1.1. Phƣơng pháp một giai đoạn
Phƣơng pháp này lần đầu tiên đƣợc Schopf là nhà hóa học ngƣời Đức dùng
để tổng hợp naphtol AS vào năm 1892 [45], dựa trên phản ứng ngƣng tụ giữa axit
3-hiđroxi-2-naphtoic với anilin có mặt PCl
3
. Phƣơng pháp này còn đƣợc dùng cho
tới ngày nay với một số cải tiến, thay vì dùng PCl
3
vừa làm tác nhân vừa làm dung
môi, ngƣời ta tiến hành phản ứng trong các dung môi để tăng hiệu suất sản phẩm
[11]. Đây còn đƣợc gọi là phƣơng pháp tổng hợp trực tiếp. Quá trình phản ứng đƣợc
mô tả trên sơ đồ 1.1.

N
N
H
R
R
70-80
0
C
Clobenzen (Xylen)

Phản ứng đƣợc thực hiện bằng cách khuấy hỗn hợp của anilin, axit 3-hiđroxi-
2-naphtoic và một lƣợng dƣ PCl
3
trong dung môi hữu cơ nhƣ clobenzen hoặc toluen
ở nhiệt độ thấp, thƣờng là dƣới 40
0
C, tốt nhất là từ 0
0
C đến 25
0
C. Khi phản ứng xảy
ra, nhiệt độ sẽ tự tăng lên trên 40
0
C. Để đuổi HCl ngƣời ta phải đun hỗn hợp ở nhiệt
độ 75
0
C đến 180
0
C trong thời gian vài giờ. Hiệu suất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-
2-cacboxamit đạt từ 60-70%.

hai giai đoạn
Ngoài phƣơng pháp một giai đoạn, 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
còn đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp gián tiếp hai giai đoạn [10, 33, 35].
Trong giai đoạn 1, ngƣời ta tiến hành phản ứng giữa axit 3-hiđroxi-
2-naphtoic với SOCl
2
để điều chế sản phẩm trung gian 3-hiđroxi-2-naphtoyl clorua.
Phản ứng đƣợc mô tả trên sơ đồ 1.3.
Sơ đồ 1.3
COOH
OH
SOCl
2
HCl, SO
2
COCl
OH

Ở giai đoạn 2, cho naphtoyl clorua tác dụng với anilin thế tạo ra sản phẩm
cuối là 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit. Quá trình phản ứng đƣợc mô tả
bằng sơ đồ 1.4.
Sơ đồ 1.4
COCl
OH
HCl
CONH
OH
anilin

Do naphtoyl clorua dễ phân huỷ trong không khí, nên phản ứng phải đƣợc

H
O
O
O
H
O
O
NMP
NH
2
X
O
H
N
H
O
X
1)
2)

X = H, p-F, p-Cl, o-C
2
H
5
; NMP = N-metyl pyroliđinon.
1.2. Tính chất của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
1.2.1. Tính chất vật lý
3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit là những chất rắn có nhiệt độ nóng
chảy ổn định và nhiệt độ sôi tƣơng đối cao [45], nhƣ có thể thấy trên bảng 1.1. Tùy
theo nhóm thế trong vòng benzen mà 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có

C)
Ts (
0
C)
Naphtol AS
H
H
H
H
247
494,0
Naphtol AS-D
CH
3

H
H
H
194
399,7
Naphtol AS-OL
OCH
3

H
H
H
162
421,0
Naphtol AS-LT

Phổ IR: Các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có ba dao động hóa trị
đặc trƣng có cƣờng độ mạnh [36]. Một dao động của nhóm νC=O amit ở vùng
1695-1700 cm
-1
, dao động thứ hai của nhóm νNH amit ở vùng ~3400 cm
-1
và thứ ba
là dao động của nhóm νOH ở ~3500 cm
-1
. Do trong phân tử của các 3-hiđroxi-
(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit chứa đồng thời nhóm OH và NHC=O có khả năng
tạo liên kết hiđro nội phân tử, nên tần số dao động các nhóm 
NH
và 
OH
có

thể giảm
xuống đáng kể.
Phổ MS: Vì cấu trúc phân tử không phức tạp, nên nhìn chung phổ MS của các
3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit tƣơng đối đơn giản. Dƣới tác dụng của
chùm điện tử, xác suất phân mảnh cao nhất sẽ xảy ra tại liên kết amit và phân tử sẽ
tạo thành hai gốc chính, sau đó tiếp tục phân huỷ tạo thành những mảnh nhỏ hơn.
Phổ MS của naphtol AS-D có 5 đỉnh chính, đỉnh thứ nhất có số khối m/z = 277
tƣơng ứng với ion phân tử chƣa phân mảnh. Dƣới tác dụng của chùm điện tử đã liên
kết amit bị cắt đứt tạo thành hai mảnh ion m/z = 171 và 106, sau đó mảnh ion với số
khối 171 tiếp tục phân huỷ tạo thành hai mảnh ion với m/z = 143 và 115 nhƣ sơ đồ
1.5 [66].
Sơ đồ 1.5
CONH

1.2.3. Tính chất hóa học
Các phân tử 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có chứa hai nhóm chức
chính là CO-NH và –OH. Là những phân tử có nhiều trung tâm phản ứng, chúng có
thể tham gia các chuyển hóa khác nhau. Trƣớc hết, nhóm hiđroxyl đẩy điện tử làm
dễ dàng cho phản ứng thế ái điện tử vào vòng naphtyl, đặc biệt là nguyên tử cacbon
C
4
. Thứ 2 là bản thân nhóm -OH dễ tham gia phản ứng este hóa. Thứ 3 là nhóm
amit có thể bị anion hóa trong môi trƣờng kiềm mạnh và bị axyl hóa bằng các tác
nhân axyl halogenua.
a) Phản ứng este hóa
Phản ứng este hóa trực tiếp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit bằng
các axit cacboxylic thƣờng cho hiệu suất thấp (40-50%). Vì vậy, để điều chế các
este của chúng ngƣời ta thƣờng tiến hành theo phƣơng pháp kinh điển Schotten-
Baumann đƣợc mô tả trong nhiều tài liệu hữu cơ cơ bản [4, 5, 107], tức là cho các
dẫn xuất naphtol tác dụng với clorua axit hoặc anhiđrit axit hữu cơ trong môi trƣờng
kiềm hoặc piridin nhƣ mô tả trên sơ đồ 1.6.
Sơ đồ 1.6
NH
OH
O
R
1
NH
O
O
R
1
R
2

NaOH, THF/0
0
C
RCHClCOCl
NH
O
OOCCHClR
X

Về nguyên tắc quá trình este hóa chia làm 2 giai đoạn. Ở giai đoạn 1, trong
môi trƣờng kiềm, nhóm hiđroxyl của 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit sẽ
chuyển hóa thành anion naphtolat; ở giai đoạn 2, anion naphtolat natri sẽ tác dụng
18

với cloaxyl clorua tạo thành sản phẩm este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cac-
boxylat (sơ đồ 1.8).
Sơ đồ 1.8
CONH
OH
X
NaOH 5N
X
CONH
ONa
1)
2)
CONH
ONa
X
RCHCOCl

Naphtol AS-D cloaxetat
…
b) Sự anion hóa trong môi trường kiềm mạnh
Hiệu suất este phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện tiến hành phản ứng. Thứ
nhất phải thực hiện ở nhiệt độ thấp để tránh phân huỷ sản phẩm este. Thứ hai là
nồng độ NaOH không quá cao (<5%). Nếu nồng độ NaOH > 5%, nhóm hiđroxyl sẽ
tấn công vào nhóm amít tạo ra đinatri aminnolat theo sơ đồ 1.9, muối này sẽ kết tủa
làm cho hiệu suất este giảm xuống [45].
Sơ đồ 1.9
NH
O
OH
X
NaOH, THF/60-90
0
C
N
O
ONa
X
Na

c) Phản ứng điazo hóa
Nhƣ đã nói ở trên, các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit dễ tham gia
phản ứng thế ái điện tử. Phản ứng đƣợc nghiên cứu tỷ mỷ và có ứng dụng thực tiễn
rộng rãi nhất là điazo hóa ở nguyên tử cacbon C
4
(sơ đồ 1.10).

19


Theo Herbst W [45] thì phản ứng này đƣợc A.Winter và các cộng sự tìm ra từ
năm 1911 và đƣợc dùng để sản xuất các phẩm màu azo nguồn gốc hữu cơ có ứng
dụng đặc biệt rộng rãi trên thực tế.
1.3. Ứng dụng của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
1.3.1. Ứng dụng để sản xuất phẩm màu
Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của các 3-hiđroxi-(N-thế)
naphtalen-2-cacboxamit là dùng làm tác nhân ghép đôi với các muối điazo để sản
xuất phẩm màu azo. Trong các loại phẩm màu sản xuất từ 3-hiđroxi-(N-thế)
naphtalen-2-cacboxamit thì nhóm naphtol AS thế là phổ biến nhất. Chúng rất phong
phú về chủng loại, chiếm lĩnh thị trƣờng phẩm nhuộm nửa đầu thế kỷ 20 nhờ có phổ
màu rộng từ vàng nhạt đến hồng, đỏ boocđô, đỏ son, nâu và tím Tùy theo cấu trúc
phẩm màu naphtol AS thế đƣợc chia làm 2 nhóm. Ở nhóm thứ nhất, tác nhân điazo
điều chế từ dẫn xuất cloanilin cho màu từ vàng đến đỏ tƣơi; còn từ dẫn xuất
clotoluiđin chủ yếu có màu đỏ ánh xanh; từ dẫn xuất nitrotoluiđin và nitroanisiđin
lại cho màu đỏ boocđô. Bảng 1.2 dƣới đây cho ta thấy màu sắc đa dạng của một số
phẩm màu đƣợc sản xuất từ naphtol AS [45, 115].
Bảng 1.2. Một số phẩm màu từ naphtol AS
R
2
R
5
N
R
4
N
OH O
NH
R
1

4
5
6
7
8
Nhóm thứ I
1
Cl
H
Cl
H
H
H
Đỏ
2
CH
3

Cl
H
CH
3

Cl
H
Đỏ ánh xanh
3
Cl
H
Cl

H
Đỏ boocdo
6
NO
2

Cl
H
OCH
3

H
H
Nâu sẫm
7
CH
3

H
NO
2

H
H
NO
2

Đỏ son
8
Cl


Naphtyl
Tím
Nhóm thứ II
12
H
CONH
2

H
OC
2
H
5
H
H
Đỏ
13
OCH
3

CONHC
6
H
5

H
H
H
NO

3

H
Cl
Đỏ ngọc
16
OCH
3

CONHC
6
H
5

H
CH
3

H
Cl
Hồng
17
Cl
CONH
2
H
NHCOCH
3
H
H


H
H
H
Tím
20
OCH
3

CONHC
6
H
5

CH
3

H
H
H
Tím
21

Sự phong phú của phẩm màu naphtol AS chính là ở chỗ chúng tồn tại ở ít
nhất là hai dạng tinh thể có thể chuyển hóa lẫn nhau. Các nhóm thế khác nhau trong
nhân aryl của muối điazo có ảnh hƣởng lớn đến tính chất của phẩm màu naphtol AS
thế. Ví dụ nhƣ xét về khả năng hòa tan, phẩm màu naphtol AS thế nhóm I thƣờng
tan kém hơn so với nhóm II. Sunfoamit và cacbonamit (nhóm II) tạo thành dung
dịch một cách nhanh chóng mặc dù cấu trúc của chúng đồ sộ hơn rất nhiều so với
những naphtol AS thế nhóm I.

OH O
NH1
Ít tan
3
N
N
OH O
NH
O
NH
2
O2
Tan
22

4
N
N
OH O
NH
O
O
NH
O

tan tốt trong dầu (dung môi hữu cơ) và có độ bền cao trong điều kiện khắc nghiệt.
1.3.2. Sản xuất cơ chất để nhuộm tế bào bạch cầu
Một ứng dụng quan trọng có tính đột phá của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-
2-cacboxamit là dùng làm tiền chất tổng hợp các este 3-(N-thế-cacbamoyl)
naphtalen-2-yl cacboxylat để làm cơ chất cho phản ứng nhuộm hóa học tế bào. Đặc
biệt trong phân loại thể bệnh bạch cầu cấp 3-(N-thế-cacbamoyl) naphtalen-2-yl
cacboxylat đƣợc sử dụng làm cơ chất cho phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu bạch
cầu ngƣời. Thực chất đây là một phản ứng thủy phân dƣới xúc tác của esteraza tạo
thành các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit tƣơng ứng. Hợp chất này sẽ
đƣợc ghép đôi với muối điazo để tạo thành phẩm màu azo tại các vùng có chứa
enzym trong bào tƣơng của tế bào. Phƣơng pháp nhuộm esteraza đặc hiệu giúp phân
loại thể bệnh dòng tủy với các dòng tế bào khác theo tiêu chuẩn FAB, phục vụ điều
trị bệnh ung thƣ máu.
1.3.2.1. Giới thiệu về esteraza trong tế bào bạch cầu
Theo phân loại của tiểu ban enzym (EC) thuộc Hội Hóa sinh quốc tế (IUB),
esteraza là một enzym hiđrolaza thuộc nhóm cacboxylesteraza (E.C.3.1.1.1) [101]
23

xúc tác các phản ứng thủy phân este cacboxylat thành axit và ancol, trong môi
trƣờng nƣớc đƣợc gọi là sự thủy phân:
Este cacboxylat + H
2
O ancol + cacboxylat
Trong tế bào bạch cầu ngƣời, esteraza đƣợc chia làm hai nhóm là esteraza
đặc hiệu và không đặc hiệu. Sở dĩ đƣợc gọi là esteraza đặc hiệu vì nó chỉ có trong
các tế bào dòng tủy từ nguyên tủy bào đến bạch cầu trung tính, các dòng tế bào khác
âm tính. Esteraza không đặc hiệu có ở nhiều loại tế bào khác nhau, nhƣ bạch cầu
mast, bạch cầu mono, bạch cầu trung tính nhƣng khi ức chế bằng NaF thì chỉ có
esteraza trong bạch cầu mono bị giảm hoạt tính, không hiện màu trong phản ứng
nhuộm hóa học tế bào bằng xúc tác bởi esteraza. Dựa vào tính chất khác nhau trong

lympho và cuối cùng là Unc trong tế bào chƣa biệt hóa. Nhƣ vậy có thể khẳng định
esteraza là một tập hợp gồm nhiều isoenzym không đồng nhất. Bằng phƣơng pháp
sắc ký điện di Scott và c.s [87] đã thu đƣợc esteraza tinh khiết từ các tế bào bạch
cầu dòng tủy và tìm ra hai isoenzym của esteraza A và B. Hai isoenzym này thƣờng
có mặt trong các bào quan của cả hai dòng bạch cầu đoạn và bạch cầu mono. Nhiều
công trình nghiên cứu gần đây cũng cho thấy hai isozym này khác nhau về sự ức
chế bởi nhiệt độ và NaF [20, 27, 84, 90].
Năm 1991, bằng kỹ thuật Northern blot, Zschunke F và c.s [114] đã giải mã
ARN thông tin (mARN) tinh khiết chiết xuất từ tế bào bạch cầu mono và đã tìm ra
cấu trúc bậc 1 của enzym này gồm 503 axit amin. Trên bản đồ gen ngƣời, esteraza
bạch cầu đƣợc mã hóa trên nhiễm sắc thể thứ 16. Trọng lƣợng phân tử là 60kDa và
bị ức chế bởi diisopropyl flophotphat nồng độ 2 mM. Tác giả cũng chỉ ra sự giống
nhau đến 90% về cấu trúc của esteraza bạch cầu với esteraza ở microsome của tế
bào gan. Các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn của enzym đang tiếp tục đƣợc
nghiên cứu [87].
1.3.2.2. Phản ứng thủy phân este
Esteraza xúc tác cho quá trình thủy phân các este thành axit cacboxylic và
ancol. Các este này có thể là các este béo, este vòng thơm [44, 77]. Đây là phản
ứng phổ biến trong mọi tế bào, đặc biệt trong chuyển hóa các chất nội và ngoại sinh.
25

Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy các gốc Ser, His, Glu, Asp và Gly ở trong tâm
hoạt động của esteraza có vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác phản ứng thủy
phân este. Điều này đƣợc minh chứng bằng sự sụt giảm khả năng xúc tác trong phản
ứng thủy phân este của enzym khi thiếu một hoặc một số axit amin nêu trên ở các
esteraza phân lập đƣợc [53].
Hiện nay, nhiều hợp chất đƣợc sử dụng làm cơ chất cho phản ứng nhuộm
esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời, trong đó phổ biến nhất là naphtol AS axetat và
naphtol AS-D cloaxetat. Cơ chế của phản ứng thủy phân các cơ chất này dƣới tác
dụng của esteraza bạch cầu ngƣời xảy ra theo sơ đồ 1.11 [23, 61, 78, 101].

Hình 1.2. Phân tử esteraza