ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN PHƢƠNG THÖY NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA LƢU HÀNH GÂY
BỆNH TIÊU CHẢY TRẺ EM VÀO BỆNH VIỆN NHI
KHÁNH HÕA NĂM 2010
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – Năm 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 SƠ LƢỢC LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VIRUT ROTA 3
1.2 HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÖC 3
1.2.1 Hình thái 3
1.2.2 Cấu trúc 4
1.3 PHÂN NHÓM VÀ CÁC TÝP HUYẾT THANH 10
1.3.1 Phân nhóm 10
1.3.2 Týp huyết thanh 11
1.4 TÍNH CHẤT LÝ HÓA 11
1.4.1 Tính bền vững với PH 11
1.4.2 Tính chịu nhiệt 11
1.4.3 Tính nhạy cảm 12
1.4.4 Tính đề kháng 12
1.5 ĐẶC TÍNH VIRUT ROTA TRÊN TẾ BÀO NUÔI CẤY MÔ 12
1.6 QUÁ TRÌNH NHÂN LÊN CỦA VIRUT ROTA 13
1.7 KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VIRUT ROTA 15
1.7.1 Khả năng gây bệnh cho trẻ em 15
1.7.2 Khả năng gây bệnh ở ngƣời lớn 15
1.7.3 Cơ chế gây bệnh 16
1.8 DỊCH TỄ HỌC BỆNH TIÊU CHẢY CẤP DO VIRUT ROTA 16
1.8.1 Nguồn bệnh 16 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
1.8.2 Đƣờng lây truyền 16
1.8.3 Mùa bệnh 16
1.8.4 Lứa tuổi mắc bệnh 17
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43
3.1 XÁC ĐỊNH TỶ LỆ TCC DO VIRUT ROTA TẠI BỆNH VIỆN NHI KHÁNH
HÕA NĂM 2010 43
3.2 TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO VIRUT ROTA THEO THÁNG 44
3.3 TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO VIRUT ROTA THEO NHÓM TUỔI 47
3.4 TỶ LỆ BỆNH NHÂN TCC DO VIRUT ROTA THEO GIỚI TÍNH 50
3.5 ĐẶC TÍNH CÁC CHỦNG VIRUT ROTA LƢU HÀNH TẠI BỆNH VIỆN NHI
KHÁNH HÕA NĂM 2010 51
3.5.1 Đặc tính chủng P 51
3.5.2 Đặc tính chủng G 56
3.6 Sự lƣu hành các chủng tổ hợp G – P của virut Rota 61
3.6.1 Sự phân bố các chủng tổ hợp G – P tại miền Trung 61
3.6.2 Sự lƣu hành các chủng tổ hợp G – P theo thời gian 62
KẾT LUẬN 64
KIẾN NGHỊ 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
2. Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
Deoxyribonucleic Acid
Axit Deoxyribonucleic
CDC
Centers for Disease Control
and Prevention
Trung tâm Kiểm soát và phòng chống
bệnh, Mỹ
ARN
Ribonucleic Acid
Axit Ribonucleic
RT-
PCR
Reverse transcription
polymerase chain reaction
Phản ứng chuỗi Polymerase phiên mã
ngƣợc
TCC
Tiêu chảy cấp
WHO
World Health Organization
Tổ chức Y tế Thế giới
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
3. DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Đặc điểm chuỗi nucleotit các đoạn gen của virut Rota [16,18] 5
Bảng 2. Các gen và protein của virut Rota [6,8] 7
Bảng 3. Týp huyết thanh của virut Rota [6,8] 11
Bảng 4. Sự phân bố các chủng lƣu hành trên toàn cầu, năm 2001 – 2008 [66] 18
Bảng 5. Các chủng virut Rota đƣợc cân nhắc để phát triển vắc xin [6] 22
Bảng 6. Các primer đƣợc sử dụng để định týp G và týp P 35
Bảng 7. Bảng tra kích thƣớc các kiểu gen G, P sau khi điện di 41
Bảng 8. Tỷ lệ TCC do virut Rota hàng năm tại Việt Nam [1,2,3] 44
Hình 11. Vị trí các Primer và bản sao ADN thu đƣợc để xác định kiểu gen G 36
Hình 12. Vị trí các Primer và bản sao ADN thu đƣợc để xác định kiểu gen P 36
Hình 13. Ảnh minh họa vị trí mẫu trên bản gel 41
Hình 14. Ảnh minh họa kiểu gen G phân tích trên gel agarose 2% 42
Hình 15. Ảnh minh họa kiểu gen P phân tích trên gel agarose 2% 42
Hình 16. Tỷ lệ bệnh nhi mắc bệnh TCC vào bệnh viện Nhi Khánh Hòa 43
năm 2010 43
Hình 17. Biểu đồ tỷ lệ trẻ em mắc bệnh TCC do virut Rota theo tháng tại các khu vực . 46
Hình 18. Sự phân bố TCC do virut Rota theo nhóm tuổi 49
Hình 19. Tỷ lệ trẻ dƣơng tính với virut Rota phân bố theo giới tính tại bệnh viện nhi
Khánh Hòa năm 2010 50
Hình 20. Kết quả điện di trên gel agarose xác định kiểu gen P 51
Hình 21. Tỷ lệ các kiểu gen P tại bệnh viện nhi Khánh Hòa năm 2010 52
Hình 22: Sự phân bố các kiểu gen theo khu vực trong cả nƣớc 53
Hình 23. Sự phân bố kiểu gen P theo thời gian 55 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Hình 24. Kết quả điện di trên gel agarose xác định kiểu gen G 56
Hình 25. Sự phân bố các kiểu gen G lƣu hành tại miền Trung năm 2010 57
Hình 26. Sự lƣu hành các kiểu gen G tại miền Trung năm 2009 và năm 2010 60
Hình 27. Sự phân bố các tổ hợp G – P của virut Rota 61
Hình 28. Sự lƣu hành các chủng tổ hợp G – P theo thời gian 62 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
2
và xác định đặc tính của các chủng virut Rota trong thời gian dài trên thế giới cũng
nhƣ tại Việt Nam, trƣớc và sau khi sử dụng vắc xin là cơ sở đánh giá hiệu quả của
các vắc xin đang sử dụng, sự biến đổi bất thƣờng của các chủng virut Rota để từ đó
có hƣớng phát triển vắc xin mới hiệu quả hơn.
Xuất phát từ thực tiễn trên, để góp phần đánh giá tình hình tiêu chảy cấp do
virut Rota ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“ Nghiên cứu đặc tính virut Rota gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em vào bệnh
viện Nhi Khánh Hòa năm 2010” nhằm các mục tiêu sau:
1. Xác định tỷ lệ bệnh nhi bị tiêu chảy cấp do virut Rota tại bệnh viện Nhi
Khánh Hòa và mối liên quan của bệnh này với yếu tố mùa, tuổi, giới.
2. Xác định đặc tính các týp virut Rota lƣu hành tại bệnh viện Nhi Khánh Hòa.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
4
Hình 1. Hình ảnh virut Rota chụp dƣới kính hiển vi điện tử [58]
1.2.2 Cấu trúc
Virut Rota có dạng khối cầu 20 mặt, đƣờng kính khoảng 75nm, chuỗi
nucleocapsit của virut đƣợc tạo thành bởi 3 vòng xoắn đồng tâm. Vỏ Capsit của
virut Rota có dạng đối xứng 20 mặt, 132 capsomer sắp xếp đối xứng xoắn
[15,19,58]
Cấu trúc capsit của virut Rota gồm 3 lớp rõ rệt.
Lớp ngoài chứa protein cấu trúc VP4 và VP7 .
Lớp trong chứa protein cấu trúc VP6 là loại kháng nguyên đặc hiệu nhóm,
chiếm 50% hạt virut và có thể đƣợc phát hiện trong kỹ thuật ELISA.
Lớp lõi chứa protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3.
Các nghiên cứu bằng kỹ thuật điện di miễn dịch và kính hiển vi điện tử đã
khẳng định: Capsit trong mang kháng nguyên đặc hiệu nhóm, capsit ngoài mang
kháng nguyên đặc hiệu týp, nhân của virut không mang tính kháng nguyên . Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
5
Hình 2. Hình minh họa cấu trúc của virut Rota
Chú thích : Neutralization antigen: Kháng nguyên trung hoà
Subgroup antigen : Kháng nguyên phân nhóm
Core : Lõi
4
2.362
34,70
776
5
1.581
33,90
491 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
6
Đoạn gen
Số cặp Bazơ
Tỷ lệ G + C ( %)
Số axit amin
6
1.356
38,60
397
7
1.104
33,50
315
8
1.059
35,50
317
9
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
7
Bảng 2. Các gen và protein của virut Rota [6,8]
Đoạn
gen
Sản
phẩm
protein
Khối lƣợng
phân tử
protein
Vị trí
trong hạt
virut
Chức năng
1
VP1
125.005
(125K)
Bao quanh
sợi ARN
ARN polymerase phụ thuộc ARN, liên kết với
(53K)
Không
cấu trúc
Không có vai trò cho sinh trƣởng của
virut
6
VP6
44.816
(41K)
Capsít
lớp trong
Cấu trúc và kháng nguyên đặc hiệu loài
7
NSP3
34.600
(34K)
Không
cấu trúc
Làm tăng hoạt tính của mARN virut và
ngừng tổng hợp protein trong tế bào vật
chủ
8
NSP2
36.700
(35K)
Không
cấu trúc
NTPase tham gia đóng gói hạt virut và
sao chép hệ gen
9
- VP4 là một protein nhạy cảm với proteasa (P serotype) là kháng nguyên có đặc
tính ngƣng kết hồng cầu. Nhờ enzym protease phân hủy, VP4 đƣợc phân cắt
một cách đặc hiệu thành VP5* và VP8* giúp cho sự xâm nhập của virut vào tế
bào. VP4 định ra týp P của virut Rota.
- VP6 là kháng nguyên chung cho các dƣới nhóm của virut Rota. Chúng đƣợc sử
dụng trong các thử nghiệm phát hiện nhiễm virut Rota nhóm A.
- VP7 là một glycoprotein (G serotype) là kháng nguyên trung hoà đặc hiệu cho
týp huyết thanh, định ra týp G của virut Rota [16,20,22,25,35]
Ngoài ra các protein nằm trong lõi cũng có vai trò rất quan trọng trong quá
trình nhân lên của virut Rota:
- VP1 là enzym ARN polymerase nằm trong lõi hạt virut tham gia vào quá trình
phiên mã tạo ra các phân tử mARN và tạo ra các bản sao genom ARN cho các
hạt virion mới .
- VP2 có hoạt tính liên kết ARN không đặc hiệu, nhận biết cả ARN sợi đơn và
sợi kép. Việc lắp ráp VP2 vào trong lõi không phụ thuộc vào protein khác và
dsARN, do VP2 mang vùng chứa Ala – 387 và vùng kẹp hóa leucine có vai trò
quan trọng trong việc tự lắp ráp vào lõi.
- VP3 là một phần của màng lõi trong của hạt virion và là enzym Guanylyl
transferase, có vai trò gắn mũ vào đầu 5
‟
trong quá trình cải biến sau phiên mã
phân tử mARN, bảo vệ mARN khỏi sự phân hủy của các nuclease .
Ban đầu ngƣời ta gọi hạt virut hoàn chỉnh là hạt virut có 2 vỏ, mặc dù số
liệu mới đây cho thấy rằng những hạt virut này có 3 lớp. Sự thiếu vỏ ngoài của phân
tử lớp kép thƣờng đƣợc miêu tả nhƣ hạt thô ráp bởi vì mặt ngoài của chúng nhô ra
cấu trúc siêu phân tử của capsit trong (VP4) [17]. Những nghiên cứu đầu tiên về cấu
trúc virut Rota đã nhất trí cho rằng hạt virut có 20 mặt đối xứng [16,44]. Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
+ Protein không cấu trúc [6 ]
- NSP1 đƣợc mã hóa bởi từ gen 5 ,có đặc tính liên kết ARN. Ngƣời ta chứng
minh đƣợc rằng các chuỗi cystein của NSP1 có vai trò quan trọng cho hoạt tính
liên kết ARN. NSP1 có đặc hiệu với tất cả 11 đoạn ARN của virut Rota. Đích
liên kết là vị trí gần đầu 5‟ của mARN và có thể thuộc 34 nucleotit đầu tiên của
mARN
- NSP2 là một protein liên kết ARN tích lũy trong thể vùi của virut (viroplasms)
và cần thiết cho quá trình sao chép genom của virut. NSP2 có đặc tính liên kết
ARN tuy nhiên không đặc hiệu virut, đầu cacboxyl của NSP2 chứa vùng bảo
thủ cao có 37 acid amin và đƣợc dự đoán là domain liên kết ARN.
- NSP3 liên kết mARN của virut trong những tế bào nhiễm và ức chế tổng hợp
protein trong tế bào vật chủ.
- NSP4 là một độc tố trong ruột của ngƣời bị bệnh tiêu chảy và là độc tố ruột do
virut đầu tiên đƣợc phát hiện.
- NSP5 và NSP6 đƣợc mã hóa nhờ gen 11 bởi hai khung đọc mở (ORF) khác
nhau.
1.3 PHÂN NHÓM VÀ CÁC TÝP HUYẾT THANH
1.3.1 Phân nhóm
Virut Rota đƣợc phân chia theo nhóm, phân nhóm dựa trên các protein vỏ
capsit của virut.Theo Lambert J.P (1992) virut rota đƣợc chia thành 5 nhóm A, B,
C, D và E. Nhóm A có 2 phân nhóm là 1 và 2, phân nhóm 1 có týp huyết thanh 2,
phân nhóm 2 có týp huyết thanh 1, 3 và 4 [6,8].
Baoming (1995) chia thành 7 nhóm là A, B, C, D, E, F và G, trong đó chỉ có
nhóm A, B, C gây bệnh cho cả ngƣời và động vật. Nhóm D, E, F, G chỉ thấy ở động
vật . Nhóm A hay gặp nhất, gây ra hầu hết các vụ dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em.
Nhóm B, C thƣờng gây những vụ dịch lẻ tẻ, hay gặp ở trẻ lớn và ngƣời trƣởng
thành [6,8] Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
việc giám sát dịch tễ týp huyết thanh G và P nhằm xác định týp phổ biến đóng vai
trò rất quan trọng trong việc phát triển vắc xin Rota mới [6, 16].
1.4 TÍNH CHẤT LÝ HÓA
1.4.1 Tính bền vững với PH
Virut Rota bền vững với pH ở diện rộng (pH từ 3 đến 10) nhờ đó mà có
virut Rota thể tồn tại và phát triển tốt trong ruột ngƣời [8].
1.4.2 Tính chịu nhiệt
Virut Rota có thể sống nhiều giờ trên bàn tay và nhiều ngày trên bề mặt rắn,
virut vẫn ổn định và có khả năng gây bệnh khi sống trong phân một tuần. Ở 4
0
C Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
12
thậm chí ở 20
0
C với sự có mặt của 1,5 mM CaCl
2
virut rota vẫn giữ đƣợc tính gây
nhiễm trùng trong nhiều tháng [10,20], ở - 20
0
C virut có thể tồn tại nhiều năm [6].
Virut dễ bị bất hoạt ở nhiệt độ cao trên 45
0
C. Nếu đông tan băng nhiều lần
thì virut mất khả năng gây nhiễm trùng . Virut có khả năng tồn tại lâu trong buồng
bệnh nhân nên tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện khá cao [6].
1.4.3 Tính nhạy cảm
giúp cho virut Rota xâm nhập vào tế bào. Một số tác giả đã thành công trong việc
phân lập virut Rota ngƣời từ bệnh nhân bị viêm dạ dày ruột cấp trên tế bào thận khỉ
Cynomolgus tiên phát và kỹ thuật nuôi quay trong môi trƣờng có trypsin. Nhiều tác
giả cũng công nhận phƣơng pháp có hiệu quả để nuôi cấy và phân lập virut Rota
ngƣời là việc sử dụng enzym phân giải protein nhƣ tripsin, elatin, pancreatin để làm
tăng tính gây nhiễm của virut Rota ngƣời đối với tế bào nuôi [16,17].
1.6 QUÁ TRÌNH NHÂN LÊN CỦA VIRUT ROTA
Các điểm đặc trƣng nhất của quá trình virut Rota nhân lên trong tế bào nhƣ sau [6]:
Quá trình sao chép xảy ra hoàn toàn trong tế bào chất.
Tế bào không chứa các enzym dùng cho sao chép sợi kép ARN, vì thế virut
phải tự cung cấp các enzym cần thiết.
ARN sợi (-) đƣợc dùng làm khuôn để sao chép sợi (+) nhờ enzym ARN
polymeraza phụ thuộc ARN. Sợi (+) này dùng để tổng hợp các protein, đồng
thời phiên mã tạo ARN sợi (-). Khi sợi (-) đƣợc tổng hợp hoàn toàn, nó thực
hiện việc liên kết với sợi (+).
Sự phân giải tế bào sẽ giải phóng các hạt virut khỏi các tế bào nhiễm.
Các giai đoạn chính của quá trình sao chép virut Rota bao gồm: giai đoạn
hấp phụ, xâm nhập và cởi áo; quá trình tổng hợp và sao chép; giai đoạn lắp ráp và
giải phóng virut ra khỏi tế bào vật chủ. Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
14
Hình 4: Chu trình nhân lên của virut Rota trong tế bào
*Giai đoạn hấp phụ, xâm nhập và cởi vỏ [6]
Sự xâm nhập của virut Rota ngƣời phụ thuộc vào việc tách lớp vỏ ngoài của
virut bằng trypsin. Virut đã đƣợc xử lý trƣớc bằng trypsin sẽ trực tiếp xâm nhập qua
màng tế bào vào trong bào tƣơng của tế bào.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
15
Các protein của virut đƣợc tổng hợp đồng thời với sự sao chép ARN của
virut. Các protein cấu trúc bao gồm VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 và VP7 có tác dụng
tạo capsit của virut. Các protein không cấu trúc bao gồm NSP1, NSP2, NSP3,
NSP4, NSP5 tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ARN [11].
*Giai đoạn lắp ráp và giải phóng
ARN sợi kép tạo thành sẽ đƣợc lắp ráp với các protein cấu trúc tạo thành hạt
virut hoàn chỉnh trong bào tƣơng tế bào và đƣợc giải phóng ra ngoài tế bào bằng
cách ly giải tế bào chủ hoặc nảy chồi [11].
1.7 KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VIRUT ROTA
1.7.1 Khả năng gây bệnh cho trẻ em
Virut rota nhóm A là nguyên nhân hàng đầu gây viêm dạ dày ruột cấp dẫn
đến tiêu chảy ở trẻ em, đặc biệt là trẻ từ 6 đến 24 tháng tuổi. Trẻ sơ sinh hiếm khi bị
bệnh, chủ yếu là nhiễm trùng không triệu chứng hoặc biểu hiện bệnh rất nhẹ [8, 11],
có khoảng 10% - 20% trẻ sơ sinh bị nhiễm virut rota có biểu hiện lâm sàng [6].
Nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ sơ sinh có thể liên quan tới kháng thể từ mẹ
truyền qua nhau thai cho con hoặc kháng thể và các yếu tố ức chế trypsin trong sữa
mẹ, enzym pancreatic chƣa hoàn chỉnh Nhƣ vậy, mặc dù sữa mẹ không phải là
phòng đƣợc nhiễm virut rota nhƣng có thể phòng đƣợc bệnh tiêu chảy nặng [6].
Ngoài gây viêm dạ dày ruột cấp, virut rota còn có thể gây viêm ruột hoại tử,
lồng ruột, tắc mật ngoài gan, xuất huyết đƣờng niệu, nhiễm trùng huyết Tuy
nhiên, hiện nay chƣa có bằng chứng điển hình có tính thuyết phục về vấn đề này
1.7.2 Khả năng gây bệnh ở người lớn
Nhiễm trùng do virut Rota cũng khá phổ biến ở ngƣời lớn, thƣờng do virut
nhóm B gây ra, tuy nhiên ngƣời mắc có thể không có triệu chứng hoặc bị tiêu chảy
mãn tính. Theo một nghiên cứu khoảng 55% ngƣời lớn khi tiếp xúc với trẻ em nằm
viện vì viêm dạ dày ruột do virut Rota có lƣợng kháng thể tăng trong thời gian con
nhiễm bệnh nhất do các bé thƣờng tiếp xúc với đồ vật bằng tay, miệng. Đôi khi
virut Rota có thể gây bệnh cho những thành viên khác trong gia đình và những
ngƣời có tiếp xúc gần gũi với trẻ mắc bệnh [6].
1.8.3 Mùa bệnh
Ở các nƣớc khí hậu ôn đới, tiêu chảy do virut rota thƣờng xuất hiện vào mùa
đông [6,7]. Theo thống kê có tới hơn 50% trẻ nhập viện mắc bệnh TCC là do virut
Rota gây nên.Ở các nƣớc nhiệt đới và các nƣớc đang phát triển, yếu tố mùa ít rõ rệt
hơn, bệnh có thể gặp quanh năm [6].
Copyright: Tài liệu đại học ©