ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Nguyễn Vĩnh Đông
Đặc điểm phân tử của vi rút dại lƣu hành ở miền Bắc
Việt Nam từ năm 2006-2012
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Mã số: 604240
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS.BS. Nguyễn Thị Kiều Anh
Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 3
1.1. Sơ lƣợc lịch sử phát hiện vi rút dại 3
1.2. Virut dại 4
1.2.1. Phân loại: 4
1.2.2. Hình thái: 7
1.2.3. Cấu trúc 7
1.2.4. Khả năng và cơ chế gây bệnh 9
1.3. Dịch tễ học bệnh dại 11
1.3.1. Tình hình bệnh dại trên thế giới và Việt Nam 11
3.1.2. Kết quả xác định genotype vi rút dại 50
3.2. Kết quả phân tích đặc điểm nucleoprotein vi rút dại. 60
3.2.1. Đặc điểm chung về phân tử nucleoprotein của vi rút dại 60
3.2.2. Mức độ tương đồng ở mức nucleotide và axit amin ………. 63
3.2.3. Kết quả phân tích các SNP xuất hiện ở các chủng vi rút. 67
3.2.4. Trình tự axit amin chủ yếu xuất hiện ở các chủng vi rút. 72
KẾT LUẬN 76
KIẾN NGHỊ 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Danh mục bảng
Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Phân loại Lyssavirus gây bệnh dại/viêm não tủy
6
3.1
Kết quả chẩn đoán bệnh dại trên người bằng kỹ thuật RT –
PCR
39
3.2
Kết quả chẩn đoán bệnh dại ở động vật
44
3.3
1.2
Sơ đồ cấu trúc hệ gien của vi rút dại
9
1.3
Ổ chứa vi rút dại ở các loài động vật hoang dại trên Thế giới.
12
2.1
Tiến hành các bước của thử nghiệm
29
3.1
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm
lâm sàng
40
3.2
Tiền sử phơi nhiễm của bệnh nhân dại được chẩn đoán xác
định phòng thí nghiệm
42
3.3
Bản đồ lưu hành các chủng vi rút dại ở chó và người thuộc
các tỉnh phía Bắc
49
3.4
Genotype các chủng virus dại phân lập ở Miền Bắc Việt
Nam
52
3.5
Cây phả hệ các chủng virus dại phân lập ở người và động vật
tại Việt Nam (500 nucleotide gen N)
55
3.6
dNTP
Deoxiribonucleotide 5’-triphosphates
ELISA
Enzyme linked-immusorbent assay (Thử nghiệm hấp phụ
miễn dịch gắn enzyme)
KN
Antigen (Kháng nguyên)
Nu
Nucleotide
PM
Chủng virut Pitman More
PV
Chủng virus Pasteur (Pasteur Virus)
RFFIT
Thử nghiệm ức chế tạo đám huỳnh quang (Rapid
Fluorescent Focus Inhibition Test)
RT-LAMP
Reverse transcriptase-Loop-mediated isothermal
amplification (Phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt qua trung
gian vòng phiên mã ngược)
RT-PCR
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (Phản
ứng sao chép ngược chuỗi di truyền phân tử)
SNP
Single-nucleotide polymorphism (Đa hình di truyền do
một nucleotide đơn)
TAE
Tris Acetate EDTA
TCYTTG
Tổ chức Y tế thế giới
có dịch chưa được chặt chẽ, do vậy ổ chứa bệnh dại vẫn chưa thật sự được kiểm soát từ đó là nguồn lây bệnh cho người. Đứng trước tình hình bệnh dại gia tăng
và diễn biến phức tạp, ngày 19/1/2009 thủ tướng chính phủ đã chính thức phê
duyệt chương trình phòng chống bệnh dại Quốc Gia CV99/TTG – KTN. Để
đánh giá hiệu quả của chương trình phòng chống bệnh dại, việc giám sát các ca
bệnh dại ở người và động vật là quan trọng cũng như theo dõi đặc điểm phân tử
của các chủng vi rút dại lưu hành giúp cho việc khẳng định hiệu quả của việc
phòng chống bệnh dại trong từng giai đoạn cụ thể, trên cơ sở này có những đề
xuất xác đáng cho việc thực hiện các hoạt động phòng chống bệnh dại hiệu quả
ở các giai đoạn tiếp theo. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Đặc điểm phân tử của vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006-2012“
với 2 mục tiêu:
1/ Xác định và định týp các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt
Nam, 2006 - 2012.
2/ Phân tích đặc điểm phân tử Nucleoprotein của các chủng vi rút dại lưu
hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 - 2012.
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Sơ lƣợc lịch sử phát hiện vi rút dại
Bệnh dại là bệnh viêm não tuỷ cấp và viêm màng não nguyên phát của
động vật có vú. Bệnh có thể truyền sang người qua niêm mạc hoặc da bị tổn
dại. Ngày 6 tháng 7 năm 1885, lần đầu tiên Pasteur đã dùng vắc xin não thỏ bất
hoạt tiêm cho cậu bé 9 tuổi Joseph Meister, bị một con chó lên cơn dại cắn
nhiều vết. Sau khi được tiêm 13 mũi vắc xin dại của Pasteur, cậu bé đã được
cứu thoát khỏi bệnh dại [24]. Trong vòng một năm sau đó có khoảng 2.500
người bệnh đã được điều trị bằng vắc xin này và chỉ có 12 người bị chết [45].
Năm 1963, dưới kính hiển vi điện tử Atanasiu cùng cộng sự đã nghiên
cứu cấu trúc, hính thái của vi rút dại trên động vật thí nghiệm và trên nuôi cấy
tế bào [6].
Vào những năm 80, ứng dụng tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử và sự
phát triển của công nghệ sinh học người ta đã sử dụng kỹ thuật kháng thể đơn
dòng để chẩn đoán các chủng vi rút dại gây bệnh ở người và động vật. Bằng kỹ
thuật PCR, sequencing người ta đã có thêm nhiều hiểu biết về trật tự sắp xếp
các gien và trình tự nucleotide của vi rút dại. Nhờ vào sinh học phân tử đã mang
lại nhiều tiến bộ cho việc sản xuất vắc xin dại tái tổ hợp [29].
1.2. Vi rút dại
1.2.1. Phân loại:
Vi rút dại thuộc họ Rhabdoviridae, giống Lyssavirus. Họ Rhabdoviridae
có hơn 100 chủng phân bố trong tự nhiên có thể gây nhiễm cho động vật và
thực vật [16, 30].
Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về dịch tễ học phân
tử của vi rút dại. Hiện nay, bằng kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật kháng thể
đơn dòng, người ta đã nghiên cứu nhận dạng các chủng vi rút phân lập được từ
một số loài động vật hoang dại và hiện tại Lyssavirus gây bệnh dại ở người
được phân chia thành 7 genotype và 4 týp huyết thanh (serotype) [20] trên cơ sở
mối liên quan giữa kháng nguyên và huyết thanh học [16]. Các genotype tập trung ở các vùng địa lý khác nhau và có ổ chứa ở các động vật hoang dại khác
nhau như dơi, chồn, chó sói, cáo, mèo (Alan C. Jackson và Wiliam H. Wunner,
2002).
Chủng đại diện
Vùng địa lý lƣu hành
Động vật cảm thụ
1
Virus dại và các
chủng virus vaccine
(Serotype 1,
genotype 1)
Trên toàn thế giới trừ Úc,
Vương Quốc Anh,
Ireland, New Zealand,
Nhật Bản, Scandinavia
và Hawaii
Người; các loài động
vật hoang dại và vật
nuôi ăn thịt, ăn cỏ; dơi
hút máu và dơi ăn quả.
2
Lagos
(serotype 2
genotype 2)
Nigeria, cộng hoà Trung
Phi, Nam Phi,
Zimbabwe, Guinea,
Seneral, Ethiopia, Ai Cập
Người, Dơi ăn quả,
mèo, chó.
3
Mokola
(Serotype3,
Genotype
Chủng đại diện
Vùng địa lý lƣu hành
Động vật cảm thụ
4, genotype 6)
7
Bat Lyssavirus
phân lập từ dơi ở
Úc (genotype 7, cấu
trúc gần giống
genotype 1)
Úc
Người, dơi ăn côn
trùng, dơi ăn quả.
8,9,10
Genotype 8, 9, 10
cho tới nay chưa
nghi nhận gây bệnh
trên người
Cộng hoà Trung Á, Tây
Cáp Ca
Dơi ăn côn trùng.
1.2.2. Hình thái:
Vi rút dại có hình viên đạn một đầu tròn, đầu kia dẹt với đường kính
trung bình 75nm, chiều dài dao động từ 100 – 300 nm [12, 25]. Sự thay đổi về
độ dài phản ánh sự hiện diện các hạt trung gian có cấu trúc không hoàn chỉnh
với độ dài ngắn hơn khoảng từ 20 – 50% so với hạt vi rút hoàn chỉnh. Các hạt
trung gian có bộ gien bị cắt xén và vì thế thiếu hụt một số chức năng của vi rút,
chúng nhân lên một cách nhanh chóng và cạnh tranh tích cực với các vi rút có
sự cân bằng giữa phiên mã và sao mã. Protein N là protein có tính bảo tồn nhất
trong các protein của vi rút dại, trình tự nucleotide của gien mã hoá cho protein
N có độ tương đồng cao trong cùng một genotype, nhưng lại rất khác nhau giữa
các genotype khác nhau. Chính vì vậy mà gien N được ứng dụng rộng rãi trong
chẩn đoán bệnh dại bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, đồng thời cũng được sử
dụng để nghiên cứu sự tiến hoá cũng như dịch tễ học phân tử của nhóm
Lyssavirrus [2]. 4. Phosphoprotein NS hay M1 (37kDal): Protein M có vai trò điều hoà ARN
polymeraza phụ thuộc ARN trong quá trình polymer hoá.
5. Protein màng M2: (24 kDal) protein M2 chịu trách nhiệm về hình thái và
tiếp xúc qua lại với protein của tế bào.
1.2.3.2. Cấu trúc hệ gien.
Hệ gien của vi rút dại là một chuỗi ARN sợi âm, không phân nhánh có
hằng số lắng 45S và trọng lượng phân tử 4,6 x 10
6
Dalton, chứa khoảng 12.000
nucleotide. Sợi ARN chứa 5 gien có trật tự sắp xếp được bắt đầu từ 3’ –N –M1-
M2 -G-L –5’. ARN sợi âm không có khả năng trực tiếp dịch mã tổng hợp
protein của vi rút mà phải thông qua việc tổng hợp ARN sợi dương bổ trợ
(mARN). ARN của vi rút dại không có khả năng lây nhiễm.
ARN genome của chủng PV (Pasteur virus) có 11.932 nucleotide, 58
nucleotide đầu tiên từ vị trí 3’ của toàn bộ genome là vùng không mã hóa và
cũng chính là vùng mở đầu sao chép. Vùng mở đầu sao chép này được hoạt hóa
bởi bộ ba N, P và L protein. Ngay sau khi vùng mở đầu sao chép được phiên mã
thì 5 mARN mã hóa cho 5 protein cấu trúc của vi rút là N, M1, M2, G và L lần
lượt được tổng hợp và cuối cùng là vùng đuôi không mã hóa gồm 70 nucleotide
tận cùng ở phía đầu 5’ [30, 42].
thương từ vài giờ cho đến vài tuần [16]. Sau đó nhanh chóng đi tới các đầu mút
thần kinh cảm giác và vận động của hệ thần kinh ngoại biên rồi di chuyển tới hệ
thần kinh trung ương theo hướng phản hồi của tế bào sợi acxon với tốc độ 0,3
mm/h, tại đó nó tiếp tục nhân lên. Phần cuống não bị nhiễm trước tiên, sau đó
vùng dưới đồi và cuối cùng là phần vỏ não bị tổn thương. Tuy nhiên vào giai
đoạn nhiễm cuối thì toàn bộ hệ thần kinh trung ương cũng như một số mô ngoài
tuyến nước bọt cũng bị nhiễm vi rút. Khi nhân lên trong hệ thần kinh, vi rút dại gây tổn thương não tuỷ ở các mức độ nặng nhẹ mà biểu hiện lâm sàng khác
nhau [19].
1.3. Dịch tễ học bệnh dại
1.3.1. Tình hình bệnh dại trên thế giới và Việt Nam
Bệnh dại phổ biến trên toàn cầu, từ châu Âu đến châu Á, châu Phi, Mỹ
La Tinh trừ một số vùng không có bệnh dại như Vương Quốc Anh, Nhật Bản,
vùng Bắc cực, Úc hay châu Đại Dương là những vùng đất “biệt lập”. Theo ước
tính của TCYTTG hàng năm có khoảng 40.000 – 50.000 người chết vì bệnh dại,
trong đó 99% số ca tử vong được thông báo từ các nước đang phát triển ở châu
Phi, châu Á và vùng Nam Mỹ [16].
Tại châu Âu, bệnh dại chủ yếu xảy ra ở các nước CHLB Đức, Áo, Thuỵ
Sĩ, Pháp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ba Lan, Tiệp Khắc, Hung Ga Ry. Các quốc gia này mặc
dù thường xuyên liên tục thực hiện chương trình giám sát ổ dịch bệnh dại tự
nhiên và dự phòng bằng vắc xin cho động vật hoang dã, súc vật nuôi, nhưng
hàng năm vẫn có tới hàng chục nghìn người phải tới khám và phải sử dụng 1,2
triệu liều vắc xin tại các trung tâm phòng dại [16].
Ở châu Phi và châu Á, bệnh dại hiện tại vẫn là vấn đề y tế công cộng vô
cùng nghiêm trọng. Trong đó chó là nguồn lây chủ yếu, hàng năm con số người
chết vì bệnh dại rất cao. Tại Ấn Độ hàng năm có khoảng 3 triệu người phải tiêm
phòng vắc xin dại, 92 – 95% là do chó cắn. Ở Trung Quốc bệnh dại cũng khá
nghiêm trọng, con số tử vong lên tới hàng nghìn ca trong một năm. Tình trạng
mà người ta chỉ định theo dõi con vật sau khi cắn người trong vòng 10 ngày [5,
10].
1.3.3. Các biện pháp phòng chống bệnh dại
Ở các nước phát triển biện pháp phòng chống bệnh dại chủ yếu hướng tới
các yếu tố truyền bệnh, ổ chứa virus dại ở các động vật máu nóng hoang dại
như chồn, cáo, chó sói. Những chiến dịch chủng ngừa bằng mồi có chứa thức ăn
trộn lẫn vaccine được rải vào các cánh rừng để gây miễn dịch cho động vật
hoang dại, góp phần làm giảm nguy cơ truyền bệnh dại cho người [2].
Ở các nước đang phát triển, biện pháp phòng chống chủ yếu tập trung vào
việc tăng cường sản xuất và nâng cao chất lượng vaccine, huyết thanh phòng
bệnh dại, đẩy mạnh công tác tuyên truyền và giáo dục nhân dân về việc hạn chế
nuôi chó, tiêm chủng thường xuyên cho chó, mèo, cách xử lý khi bị súc vật nghi
dại cắn. Tăng cường công tác giám sát dịch tễ học bệnh dại để biết chính xác
dịch tễ học bệnh dại và thực hiện tiêm phòng cho các đối tượng có nguy cơ phơi
nhiễm.
Đối với bệnh dại ở súc vật: thiết lập hệ thống giám sát trung tâm có trang
thiết bị phòng thí nghiệm chẩn đoán, có đội ngũ chuyên gia theo dõi. Thành lập
chương trình kiểm soát và hạn chế đàn chó lang thang, thực hiện tiêm phòng
thường kỳ cho đàn chó.
Thực hiện giám sát kiểm dịch Quốc tế khi xuất nhập các súc vật qua biên
giới. Tăng cường hợp tác khoa học giữa các nước và khu vực có bệnh dại lưu
hành [2].
1.3.4. Các loại vắc xin tế bào phòng bệnh dại sản xuất trên thế giới
Vaccine phòng bệnh dại lần đầu tiên được nhà bác học Louis Pasteur và
các cộng sự nghiên cứu sản xuất năm 1885. Cho đến nay đã có rất nhiều loại
vaccine các thế hệ ra đời, được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới đã chứng tỏ
hiệu quả bảo vệ khác nhau.
Theo thống kê của TCYTTG các vaccine trên tế bào được sử dụng cho người
gồm [2].
miễn dịch cao. Được sản xuất tại Pháp từ 1984.
1.4. Nghiên cứu trong nƣớc liên quan đến đề tài Trước đây đã có nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của bệnh dại tại Việt
Nam do tác giả Yamagata và cộng sự (2007) [52], đã tiến hành phân lập vi rút
dại từ chó tại Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh miền Nam Việt Nam. Kết
quả của đề tài là đã so sánh trình tự nucleotide của gien N vi rút dại với một số
chủng từ các nước Châu Á khác, và kiến nghị rằng có sự liên hệ chặt chẽ về mặt
tiến hóa giữa các chủng tại Miền Nam Việt Nam với các chủng từ Thái Lan và
có thể có cùng chung một nguồn gốc.
1.5. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Chẩn đoán xác định bệnh dại trong phòng thí nghiệm dựa vào các phương pháp
sau:
- Xác định kháng nguyên của vi rút bằng kỹ thuật FA hoặc ELISA
- Phân lập và xác định vi rút: phân lập trên tế bào hoặc trên chuột.
- Xác định vật liệu di truyền của vi rút bằng các kỹ thuật sinh học phân
tử.
- Nhận dạng vi rút bằng kháng thể đơn dòng
- Các kỹ thuật huyết thanh học; ELISA, RFFIT, FAVN
1.5.1. Chẩn đoán bệnh dại ở người
1.5.1.1. Khi bệnh nhân đang sống
Kỹ thuật phân lập vi rút
Mẫu bệnh phẩm là nước bọt, nước tiểu, dịch não tuỷ.
Phân lập vi rút trên não chuột ổ nhắt trắng 1 – 2 ngày tuổi, sau tiêm 3 – 4 ngày
mổ lấy não chuột và xác định vi rút bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang.
Phân lập vi rút trên tế bào NA (C1300) Neuroblastoma của chuột.
Khoảng 20 – 24 giờ sau khi gây nhiễm, nhuộm tế bào bằng kháng thể kháng
dại gắn huỳnh quang sau đó soi trên kính hiển vi huỳnh quang. Mẫu bệnh phẩm
dương tính khi quan sát thấy có hình ảnh phát quang màu xanh trong bào tương
real time PCR, từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao,
cho kết quả nhanh chóng.
1.5.1.2. Sau khi bệnh nhân tử vong Não tử thi ở các vùng khác nhau như dưới đồi, nhân não, chất xám, tiểu
não.
Các kỹ thuật chẩn đoán trên não tử thi cũng tương tự như các kỹ thuật
chẩn đoán trên lâm sàng, nhưng có thêm kỹ thuật xác định tiểu thể Nergi ở tế
bào thần kinh trong mô não tử thi.
Kỹ thuật xác định tiểu thể Negri
Não được phết lên lam kính, nhuộm theo phương pháp Seller hay Mann,
soi lên kính hiển vi tìm tiểu thể Negri thường khu trú trong tế bào thần kinh
sừng Amon có kích thước khoảng 0,25 – 25 m, bắt màu hồng Eosin. Phương
pháp này cho kết quả nhanh, sau khoảng 1 giờ.
1.5.2. Chẩn đoán trên động vật
Bệnh phẩm là não động vật nghi dại. Lấy não vùng sừng Amon hai bên,
vùng dưới đồi, cuống não, nhân não, chất xám. Các kỹ thuật chẩn đoán áp dụng
như trên bệnh phẩm não tử thi.
1.6. Các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán và nghiên
cứu vi rút dại
1.6.1. Các phương pháp định týp và nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút Dại
Phương pháp miễn dịch: Sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các chủng
đại diện của các kiểu gien để định týp các vi rút dại hoang dại phân lập được.
Phương pháp đòi hỏi phải phân lập được vi rút và phải có hệ thống huyết thanh
chuẩn của từng týp huyết thanh.
Phương pháp sinh học phân tử: Phân tích, so sánh trình tự nucleotide của vi
rút dại cần xác định kiểu gien so với các chủng đại diện của các kiểu gien.
Hầu hết các công trình nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của vi rút dại
sử dụng gien N để phân tích kiểu gien và sự tiến hóa của vi rút dại. Tại khu vực
P tỏ ra không hiệu quả bằng gien N và phải giải trình tự toàn bộ gien P thì khả
năng phân loại genotype mới chính xác.
1.6.2. Kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction)
Copyright: Tài liệu đại học ©