ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ VIỆT HÀ
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GIẢI PHÁP NÂNG CAO HIỆU SUẤT CHUYỂN
HÓA ISOFLAVONE ĐẬU TƢƠNG TỪ DẠNG GLYCOSIDE SANG
DẠNG AGLUCONE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRƢƠNG HƢƠNG LAN
Hà Nội – Năm 2012

Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đậu tƣơng 3

2.5.2. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn 37
2.5.3. Các phương pháp phân tích lý hóa 37
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
3.1. Nghiên cứu giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone trong đậu tƣơng
từ dạng glycoside sang dạng aglucone bằng chế phẩm enzyme 41
3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn chế phẩm enzyme thích hợp 41
3.1.2. Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu của enzyme Sumizyme FP thủy
phân sữa đậu tương 43
3.1.3. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất sữa đậu tương giàu isoflavone dạng
aglucone bằng phương pháp thủy phân với enzyme Sumizym FP 48
3.2. Nghiên cứu nâng cao hàm lƣợng isoflavone aglucone trong sữa đậu tƣơng bằng
phƣơng pháp lên men 51
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất dịch sữa đậu tương đến sự chuyển hóa
isoflavon 51
3.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống vi khuẩn đến khả năng chuyển hóa isoflavone . 53
3.2.3. Ảnh hưởng của pH dịch lên men đến khả năng chuyển hóa isoflavone 54
3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa isoflavone 55
3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chuyển hóa isoflavone 56
3.2.6. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí vô trùng đến khả năng chuyển hóa isoflavone
57
3.2.7. Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất sữa đậu tương giàu isoflavone dạng
aglucone bằng phương pháp lên men với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 62
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC 74
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây và hạt đậu tƣơng 3
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của các oligosaccharide trong đậu tƣơng 9
Hình 1.3. Sự tƣơng đồng về cấu trúc phân tử của các isoflavone và β-estradiol
(estrogen ngƣời) 10
Hình 1.4. Một số thực phẩm chế biến từ đậu tƣơng 12
Hình 1.5. Quá trình trao đổi chất của daidzein và genistein 16
Hình 1.6. Sự thủy phân isoflavone glycoside bằng bazơ và axit 22
Hình 1.7. Cấu trúc enzyme  – glucosidase A từ vi khuẩn Clostridium cellulovorans 23
Hình 1.8. Sự thủy phân các isoflavone bằng enzyme -glucosidase 24
Hình 1.9. Hình ảnh hiển vi điện tử của Bacillus subtilis 27
Hình 2.1. Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 32
Hình 3.1. Hiệu suất chuyển hóa isoflavone trong sữa đậu tƣơng thủy phân bằng các
chế phẩm enzyme 42
Hình 3.2. Hiệu suất chuyển hóa isoflavone trong sữa đậu tƣơng thủy phân bởi enzyme
Sumizyme FP theo thời gian 47
Hình 3.3. Quy trình công nghệ sản xuất sữa đậu tƣơng giàu aglucone bằng phƣơng
pháp thủy phân với enzyme Sumizyme FP 50
Hình 3.4. Hiệu suất chuyển hóa glycoside sang aglucone ở các nồng độ cơ chất lên

Bảng 2.1. Điều kiện thủy phân sữa đậu tƣơng của các chế phẩm enzyme 34
Bảng 3.1. Hàm lƣợng isoflavone trong sữa đậu tƣơng thủy phân với các chế phẩm
enzyme khác nhau 41
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme Sumizyme FP đến sự chuyển hoá
isoflavone từ dạng glucoside sang dạng aglucone 43
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của pH đến sự chuyển hoá isoflavone từ dạng glucoside 44
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự chuyển hoá isoflavone 45
từ dạng glucoside sang dạng aglucone nhờ enzyme Sumizyme FP 45
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của thời gian đến sự chuyển hoá isoflavone 46
Bảng 3.6. Đặc tính của dịch sữa đậu tƣơng thủy phân bằng enzyme Sumizyme FP 48
Bảng 3.7. Hàm lƣợng isoflavone glycoside và isoflavone aglucone trƣớc và sau lên
men của các mẫu có nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau 51
Bảng 3.8. Số lƣợng tế bào trong quá trình lên men ở các nồng độ cơ chất khác nhau
bởi vi khuẩn B.subtilis LH10 53
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của sục khí vô trùng đến hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ
dạng glycoside sang aglucone trong quá trình lên men 58
Bảng 3.10. Động học của quá trình lên men sữa đậu tƣơng với chủng vi khuẩn
B.subtilis LH10 trên thiết bị lên men 5 lít Labo-controller MDL-8C 59
Bảng 3.11. Sự thay đổi của các đồng phân isoflavone (mg/100g) trong quá trình lên
men 60
Bảng 3.12. Đặc tính của dịch sữa đậu tƣơng trƣớc và sau khi lên men 62

Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học 1
MỞ ĐẦU
Từ nhiều thế kỷ nay, đậu tƣơng đã trở thành cây trồng chiếm vị trí quan trọng
trong đời sống của con ngƣời nhƣ một nguồn thực phẩm. Các sản phẩm từ đậu tƣơng
đã và đang đƣợc sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới với diện tích canh tác và sản lƣợng

Bacillus subtilis natto 15, 51, 36, 61. Trong những nghiên cứu này, enzyme -
glucosidase đƣợc coi là enzyme chìa khóa, chịu trách nhiệm cho quá trình chuyển hóa
isoflavone từ dạng glycoside sang aglucone. Do vậy, nâng cao hàm lƣợng isoflavone
dạng aglucone trong các sản phẩm từ đậu tƣơng đang trở thành một hƣớng nghiên cứu
mới của ngành công nghiệp thực phẩm.
Xuất phát từ mục đích làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng giàu
isoflavone có tác dụng giảm nồng độ cholesterol trong máu, cải thiện sắc đẹp và sức
khỏe cho phụ nữ đặc biệt phụ nữ ở thời kỳ mãn kinh, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài “Nghiên cứu một số giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu
tương từ dạng glycoside sang dạng aglucone”. Nội dung nghiên cứu của đề tài gồm
02 phần chính nhƣ sau:
1. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside
sang dạng aglucone bằng quá trình thủy phân sữa đậu tương với chế phẩm enzyme

-
glucosidase thương mại.
2. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside
sang dạng aglucone bằng quá trình lên men sữa đậu tương với chủng vi khuẩn
Bacillus subtilis LH10. Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
4
Bảng 1.1. Sản lƣợng đậu tƣơng của thế giới năm 2010 23
Nƣớc
Sản lƣợng
(triệu tấn)
Tỷ lệ
(%)
Hoa Kỳ
90,6
34,6
Braxin
68,5
26,2
Argentina
52,7
20,1
Trung Quốc
15,1
5,8
Ấn Độ
9,8
3,7
Paraguay
7,5
2,9
Các nƣớc khác
17,4
6,7
Tổng số
261,6

Đơn vị
Hàm lƣợng
Nƣớc
g
8,5
Na
mg
2,0
Năng lƣợng
Kcal
416
Zn
mg
4,9
Protein
g
36,5
Cu
mg
1,7
Lipid tổng số
g
19,9
Mn
mg
2,52
Axit béo bão hòa
g
2,9
Se

mg
1,62
Isoflavone
mg
200
Vitamin B
5

mg
0,79
Ca
mg
277
Vitamin B
6

mg
0,38
Fe
mg
15,7
Axit folic
µg
375
Mg
mg
280
Vitamin B
12


6
Bảng 1.3. Thành phần protein của đậu tƣơng 50, 26
Thành phần
Đơn vị
Khoảng hàm
lƣợng
Hàm lƣợng
trung bình
Protein
Axít amin
Các Axít amin không thiết yếu
Alanine
Arginine
Axít Aspartic
Axít glutamic
Glycine
Cysteine
Proline
Serine
Các axít amin thiết yếu
Histidine
Isoleucine
Leucine
Lysine
Methionine
Phenyalanine
Threonine

0,47 – 0,54
1,12 – 1,62
1,52 – 2,24
40 1,69
2,9
4,48
7,26
1,69
0,60
2,02
2,07

1,04
1,76
3,03
2,58
0,54
1,95
1,58
0,49
1,43
1,83
Hầu hết các protein có mặt trong đậu tƣơng là globulin, dạng protein dự trữ.
Dựa vào hệ số lắng, globulin đƣợc phân chia thành các loại 2S, 7S, 11S và 15S. Trong

Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học 8
Bảng 1.4. Hàm lƣợng axít linoleic, axít linolenic và tỷ lệ (n-6)/(n-3) của một số
chất béo thực vật 35
Loại hạt
6 (n-6)
(%)
3 (n-3)
(%)
Tỷ lệ 6/3
Đậu tƣơng
53
7 – 9
6 – 7
Lạc
32,5
-
1
Hƣớng dƣơng
65,2
0,3
1
Hạt cây rum
81,4
0,4

chứa enzyme cần thiết. Kết quả tạo ra các khí nhƣ cacbonic, hydro, nitơ và metan phụ
thuộc vào từng chế độ ăn và hệ vi sinh vật đƣờng ruột khiến cơ thể phải chịu đựng
chứng đầy bụng và các tác dụng phụ không mong muốn khi tiêu hóa.

Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học 9 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của các oligosaccharide trong đậu tƣơng
Các carbohydrate không tan trong đậu tƣơng bao gồm cenlulose,
hemicenlulose, pectin và một lƣợng nhỏ tinh bột. Chúng là các thành phần cấu trúc
đƣợc tìm thấy chủ yếu trong thành tế bào và phần lớn thuộc vào nhóm chất xơ thực
phẩm.
1.2. Isoflavone trong đậu tƣơng
1.2.1. Cấu trúc
Isoflavone là các hợp chất polyphenol thuộc lớp flavonoid có cấu trúc cơ bản
gồm hai vòng benzen (A và B) nối với nhau bởi một cầu ba carbon tạo thành dị vòng
pyran(C). Trong cấu trúc của isoflavone, vòng benzen B đƣợc nối ở vị trí thứ 3 thay vì
vị trí số 2 của dị vòng C nhƣ các flavonoid khác. Isoflavone có cấu trúc tƣơng đồng
với các estrogen của ngƣời nên còn đƣợc gọi là phytoestrogen hay estrogen thảo mộc
nhƣng có hoạt lực yếu hơn 65. Trong tự nhiên, isoflavone có 2 dạng chính: aglucone,
dạng không liên kết với phân tử đƣờng glucose và glycoside, dạng liên kết với glucose
Hình 1.3. Sự tƣơng đồng về cấu trúc phân tử của các isoflavone và β-estradiol
(estrogen ngƣời)

Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học 11
Bảng 1.5. Công thức và trọng lƣợng phân tử của các đồng phân isoflavone
Isoflavone
Công thức
Trọng lƣợng
phân tử
Daidzein
C
15
H
10
O
4

254
Glycitein
C
16
H

Genistin
C
21
H
20
O
10

432
Acetyl- daidzin
C
23
H
22
O
10
458
Acetyl-glycitin
C
24
H
24
O
11

488
Acetyl-genistin
C
23
H

isoflavone 40. Hàm lƣợng isoflavone trong đậu tƣơng nằm trong khoảng từ 50 –
3,000µg/g 34 thay đổi phụ thuộc vào các yếu tố giống, các điều kiện sinh trƣởng và
thu hoạch. Theo báo cáo của Hammond (2005), hàm lƣợng isoflavone của đậu tƣơng
Mỹ có 1,2 – 2,5mg/g, đậu tƣơng Hàn Quốc có 0,5 – 2,3mg/g và đậu tƣơng Nhật Bản
có 0,2 – 3,5mg/g 25. Thành phần và hàm lƣợng của các đồng phân isoflavone cũng
thay đổi trong các thực phẩm từ đậu tƣơng khác nhau phụ thuộc vào phƣơng pháp chế
biến. Isoflavone tìm thấy trong đậu tƣơng và các sản phẩm đậu tƣơng không lên men
chủ yếu là các glycoside, dạng hấp thụ hạn chế trong hệ tiêu hóa ngƣời do có tính phân
cực và trọng lƣợng phân tử cao. Chúng chiếm đến trên 90% hàm lƣợng isoflavone
tổng số 32. Tuy nhiên, các aglucone (daidzein, genistein và glycitein) không phong
phú trong đậu tƣơng và các thực phẩm từ đậu tƣơng không lên men (0,2 - 1,5 mg/g)
nhƣng đƣợc quan tâm đặc biệt do là các chất “phytochemical” có hoạt tính sinh học
mạnh 68. Các isoflavone dạng aglucone này đƣợc hấp thụ nhanh hơn với hàm lƣợng
cao hơn so với các glycoside tƣơng ứng 30, 57.

Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học 12
Sự khác nhau trong cấu trúc hóa học có thể liên quan đến hoạt tính của các
isoflavone trong hệ thống sinh học. Trong số 3 isoflavone aglucone thì glycitein có
hàm lƣợng nhỏ nhất, chỉ chiếm khoảng 5 - 10% isoflavone tổng số trong các sản phẩm
đậu tƣơng nhƣng có hoạt tính sinh học mạnh hơn so với daidzein và genistein 60.
Ngoài ra, trong một số thử nghiệm lâm sàng trên đối tƣợng phụ nữ trƣởng thành,
daidzein đƣợc báo cáo là có hoạt tính sinh học cao hơn genistein 73.
1.2.2. Hàm lượng isoflavone trong các thực phẩm từ đậu tương
Các thực phẩm đậu tƣơng đƣợc chia thành 2 nhóm chính dựa trên phƣơng pháp
chế biến bao gồm thực phẩm đậu tƣơng không lên men và thực phẩm đậu tƣơng lên
men (hình 1.4).


học của vi sinh vật dẫn đến làm giàu hoạt tính của các cơ chất trong thực phẩm với
protein, các axít amin quan trọng, các axít béo thiết yếu, carbohydrate, một số chất
chống oxi hóa và sterol thực vật. Quá trình lên men xảy ra trực tiếp trên đậu tƣơng đã
nấu chín dƣới các điều kiện riêng tạo ra một số loại thực phẩm đậu tƣơng lên men
truyền thống nhƣ natto (Nhật Bản), chungkookjang (Hàn Quốc), kinema (Ấn Độ),
tempeh (Indonesia), thua nao (Thái Lan), sữa đậu tƣơng lên men,…. Phụ thuộc vào
phƣơng pháp chế biến và chủng vi sinh vật sử dụng mà hàm lƣợng, thành phần
isoflavone của các thực phẩm đậu tƣơng lên men có sự khác biệt lớn. Trong đó, các
liên kết  – glucoside đã đƣợc thủy phân để chuyển hóa isoflavone dạng glycoside
sang aglucone nhờ enzyme β- glucosidase từ các vi sinh vật.

Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học 14
Bảng 1.6. Thành phần của các đồng phân isoflavone trong đậu tƣơng và các sản phẩm đậu tƣơng thƣơng mại [66, 67]
Ghi chú: Tỷ lệ phần trăm được tính theo mol
-: không được phát hiện ; N : Số mẫu

Mẫu

N
Aglucone (%)
-glucoside (%)
6”-O-malonyl-β-glucoside (%)
6”-O-acetyl-β-glucoside (%)
Trọng
lƣợng
µg/g
Daidzein

tƣơng
4
1,8
1,8
0,2
23,6
36,9
2,4
10,9
16,5
1,3
0,5
1,2
3,0
317,0
Tofu
6
2,7
3,5
0,1
9,9
13,2
6,3
22,5
33,6
6,9
0,5
0,9
-
459,9

646,1
Đậu
tƣơng nấu
chín
6
1,8
3,6
-
25,1
49,2
3,8
4,4
3,5
1,7
1,7
5,2
-
605,1
Kinako
5
3,8
4,9
1,2
20,8
25,1
1,6
0,3
-
0,5
15,9

2,1
-
303,8
Tƣơng
5
45,1
21,2
6,6
10,4
13,1
-
-
3,6
-
-
-
-
13,7

Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học 15
1.2.3. Quá trình trao đổi chất và hấp thụ của isoflavone ở người
Quá trình trao đổi chất của các isoflavone đậu tƣơng trong cơ thể ngƣời rất đa
dạng. Sau khi tiêu thụ isoflavone một số chất chuyển hóa của isoflavone đƣợc hình
thành nhờ các phản ứng deglycoside và phản ứng khử trong pha trao đổi chất I rồi tiếp
tục tạo liên kết với các axít glucoronic và sulfonic trong pha trao đổi chất pha II trƣớc
khi bài tiết khỏi cơ thể.
1.2.3.1. Trao đổi chất pha I


Hình 1.5. Quá trình khử của các isoflavone dạng aglucone
1.2.3.2. Trao đổi chất pha II
Sau khi hấp thụ, các hợp chất isoflavone aglucone và các chất chuyển hóa của
chúng đƣợc liên kết ngay với các axít glucuronide nhờ enzyme UDP glucuronosyl
transferase (UGT) và sulphate nhờ enzyme sulfotransferase (SULT) trong gan, tiến
vào vòng tuần hoàn gan-ruột với sự trao đổi chất và tái hấp thu mạnh trong ruột rồi
đƣợc tiết ra ngoài qua đƣờng nƣớc tiểu. Còn các isoflavone không đƣợc hấp thụ thì
đƣợc bài tiết theo đƣờng phân ở dạng không liên kết 5.
1.2.4. Lợi ích của isoflavone đối với sức khỏe
Nhiều lợi ích sức khỏe của đậu tƣơng có đƣợc nhờ sự đóng góp của các
isoflavone. Các hợp chất này có hoạt tính giống estrogen và đƣợc cho là tốt cho phụ

Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học 17
nữ thời kỳ mãn kinh 37. Chúng đƣợc báo cáo về tác dụng giảm nguy cơ bệnh tim
mạch mãn tính bằng cách giảm mức độ oxi hóa các cholesterol và giảm sự tích lũy
LDL-Cholesterol trên thành mạch máu. Do vậy, tăng cƣờng quá trình phục hồi của
thành mạch 48. Hơn nữa, isoflavone cũng có tác dụng ngăn ngừa một số bệnh ung

phosphatidylinositol kinase và protein kinase đƣợc hoạt hóa bởi mitogen. Ngoài ra,
genistein đã thể hiện sự ức chế in vitro với phenolsulfotransferase, một enzyme liên
quan đên các chất gây ung thƣ chứa nhóm sulphate.
1.2.4.2. Ngăn ngừa bệnh tim mạch
Cholesterol là một trong những thành phần thiết yếu của cơ thể. Nó tham gia
cấu trúc màng tế bào. Axít mật và các hormone cũng đƣợc tạo thành từ cholesterol.
Mặc dù vậy, cholesterol có thể tạo ra những vấn đề xấu khi hàm lƣợng cholesterol
trong máu tăng, gây nguy hại đến mạch máu nhƣ bệnh động mạch vành do những thay
đổi về lối sống liên quan đến chế độ ăn. Đến năm 2020, bệnh tim mạch sẽ trở thành
nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Số lƣợng ca tử vong ƣớc tính trên 20
nghìn ngƣời một năm. Đặc biệt, nguy cơ mắc bệnh tim mạch tăng mạnh ở phụ nữ bƣớc
vào thời kỳ mãn kinh do sự sản xuất estrogen trong cơ thể bị giảm xuống.
Từ lâu, con ngƣời đã biết rằng đậu tƣơng hay các thành phần của nó ảnh hƣởng
đến hàm lƣợng lipid máu đặc biệt là cholesterol máu. Trong một nghiên cứu thực hiện
trên 31 tình nguyện viên có chỉ số lipid máu cao (gồm 19 đàn ông và 12 phụ nữ mãn
kinh) đƣợc cung cấp khẩu phần ăn chứa đậu tƣơng với 86mg isoflavone glycoside mỗi
ngày (53,4mg aglucone) trong hai đợt thử nghiệm cách nhau 2 tuần, mỗi đợt kéo dài 1
tháng. Kết quả cho thấy sự giảm xuống của nồng độ LDL-cholesterol bị oxi hóa trong
hệ tuần hoàn và không có trƣờng hợp nào tăng hoạt tính estrogen nƣớc tiểu 28.
Teede và cộng sự (2001) 64 cũng đã nhận thấy những ngƣời đàn ông khỏe mạnh và
những phụ nữ mãn kinh sử dụng SPI ở dạng nƣớc uống cung cấp 118 mg isoflavone
glycoside/ngày (73,3 mg aglucone) trong thời gian 3 tháng có huyết áp tâm thu, huyết
áp tâm trƣơng và huyết áp trung bình giảm. Đồng thời, nồng độ triacylglycerol và
HDL-cholesterol cũng hạ xuống. Tuy nhiên, chƣa có bằng chứng chứng minh các
isoflavone dạng tinh khiết có tác dụng hạ thấp cholesterol. Những ảnh hƣởng này đòi
hỏi sự kết hợp cả protein và isoflavone đậu tƣơng. Các protein và isoflavone dƣờng
nhƣ hoạt động hiệp đồng. Nghĩa là tác dụng của chúng lớn hơn khi hoạt động cùng

Trích đoạn Một số thực phẩm giàu isoflavone trên thị trƣờng thế giới và Việt Nam Phƣơng pháp nghiên cứu

---