PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT LÊN MEN LACTIC ĐỂ
TẠO CHẤT CẤY VI SINH VẬT (INOCULANTS) DÙNG TRONG CHẾ BIẾN, BẢO
QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP
CHO GIA SÚC NHAI LẠI
1
Bùi Thị Thu Huyền, Dương Văn Hợp, Đào Thị Lương,
1
Trần Quốc Việt2 và
1
Ninh Thị Len
Viện Vi sinh vật và CNSH - Đại học Quốc Gia Hà Nội;
1
Bộ môn Dinh dưỡng, TACN và Đồng cỏ - Viện Chăn Nuôi
Tóm tắt
Từ các nguồn khác nhau trong tự nhiên, 134 chủng vi khuẩn lactic được phân lập trong đó có 131 chủng vi
khuẩn đồng hình và 3 chủng dị hình. Các chủng này được tuyển chọn bằng cách thử hoạt tính catalaza, nhuộm
Gram, khả năng sinh axit lactic, kháng vi khuẩn kiểm định, enzyme ngoại bào… Tám chủng có hoạt tính sinh học
cao nhất là 2-9, 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17, L01 và L19 được lựa chọn để định danh. Kết hợp cả phương pháp sinh
lý, sinh hóa (lên men các nguồn đường, khả năng di động, dải nhiệt độ và pH thích hợp cho sinh trưởng…) và sinh
học phân tử (giải trình tự rADN 16S) có thể xếp chủng L19 và 2-9 thuộc loài L. pentosus; các chủng 2-10, 3-5, 4-14,
8-10, 9-17 thuộc loài L. plantarum và chủng L01 thuộc loài Enterococcus lactis. Các chủng được lựa chọn đều là
những chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh và được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm probiotic.
1. Đặt vấn đề
Từ thời cổ đại, con người đã biết sử dụng vi sinh vật (VSV) để chế biến và bảo quản thực
phẩm, nhưng phải đến nửa cuối thế kỷ 19, việc chế biến thức ăn xanh theo phương pháp ủ chua
dựa mới bắt đầu được phát triển ở các nước châu Âu (Mc Donald, 1991). Đến nay, kỹ thuật ủ
chua thức ăn xanh và phụ phẩm nông nghiệp đã trở nên rất phổ biến ở hầu hết các nước trên thế
giới. Mặc dù là một kỹ thuật cổ điển dựa trên cơ sở lên men của các VSV, nhưng điều khiển quá
trình lên men để nâng cao hiệu quả chế biến, bảo quản, giảm tối đa sự thất thoát, thối, hỏng, nâng

hãng Merck, Sigma, Wako…
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn, phân loại và định danh các vi khuẩn lactic như nguồn
sản xuất các chất cấy VSV.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic
- Mẫu được pha loãng 10
-3
và 10
-5
, lấy 0,05 ml gạt trên môi trường MRS, nuôi cấy ở nhiệt
độ 30
o
C. Sau 48 giờ quan sát hình thái khuẩn lạc trên các đĩa dưới kính lúp, chọn các khuẩn lạc
có vòng trong bao quanh. Các chủng này sau đó được thuần khiết và cấy truyền ra các ống thạch
nghiêng để sử dụng ngay cho các nghiên cứu tiếp theo, đồng thời các chủng này còn được bảo
quản lạnh sâu ở - 80
0
C nhằm giữ được giống trong thời gian dài.
- Các chủng vi khuẩn phân lập đầu tiên được thử khả năng sinh catalaza (bằng cách nhỏ 1
giọt 3% H
2
O
2
lên khuẩn lạc vi khuẩn. Nếu là dương tính thì sủi bọt. Vi khuẩn lactic phải có
catalaza (-)). Các chủng có catalaza âm tính được nhuộm Gram và chỉ các chủng là Vi khuẩn
Gram dương mới được xác định khả năng lên men đồng hình (Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm môi
trường MRS dịch thể có chứa ống Durham, để 1-3 ngày. Nếu không sinh khí CO
2
trong ống

C trong 3 ngày.
- Đánh giá khả năng năng chịu nhiệt: Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường dịch
thể có pH ổn định (pH =7.0), trong các máy lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút) với các dải nhiệt độ
khác nhau 20, 25, 30, 37, 45
0
C.
- Đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường có độ pH khác nhau: Tương tự như
trên, các chủng vi khuẩn cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có độ pH khác nhau (3, 4,
5, 6, 7, 8 và 9), trên máy lắc ổn nhiệt (37
o
C).
2.3.2.2. Phân loại dựa trên giải trình tự rADN 16S
- Xác định trình tự rADN 16S của các chủng vi khuẩn theo phương pháp của Sakiyama
và cs (2009).
- Đọc trình tự ADN
Sản phẩm PCR được tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động 3100
Avant. Kết quả đọc trình tự được xử lý trên phần mềm Clustal W 1.83. Các trình tự được so sánh
với trật tự ADNr 16S của các loài đã được xác định trong ngân hàng gen, để xác định đến tên
loài.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình
3.1.1. Phân lập vi khuẩn sinh axit lên men đồng hình
Với mục đích phân lập được các vi khuẩn lên men lactic đồng hình mạnh, chúng tôi sử
dụng các nguồn mẫu cỏ voi, thân cây ngô sau thu bắp được ủ chua, bã dứa làm đối tượng cho
nghiên cứu, 134 chủng vi sinh vật đã được phân lập. Tất cả các chủng này đều có Catalaza âm tính và là vi khuẩn Gram dương. Trong đó xác định được 131 chủng lên men đồng hình. Trong
số 3 chủng lên men dị hình, chủng L19 có khả năng sinh axit cao (dựa vào vòng trong của
CaCO

21
25
4-7
17
48
7-11
13
2
1-2
8
26
4-10
21
49
7-13
14
3
1-9
11
27
4-12
18
50
7-14
15
4
1-12
9
28
4-13

12
8
2-9
20
32
5-6
18
55
8-10
20
9
2-10
21
33
5-10
17
56
8-11
16
10
2-11
19
34
5-11
15
57
9-1
19
11
2-12

15
61
9-6
20
15
3-4
19
39
6a
15
62
9-7
19
16
3-5
21
40
6b
17
63
9-8
16
17
3-8
21
41
6d-2
17
64
9-10

20
45
7-1
16
68
9-17
21
22
4-2
20
46
7-3
17
69
L01
20
23
4-3
19
47
7-4
17
70
L19
21
24
4-6
21
26
20
2-5
19.5
34
34
20
14
2-9
21
20
30
26
14
2-10
20.8
28
34
24
18
2-13
16.8
10
34
28
18
3-5
19.6
10
30

28
20
4-10
18
20
34
30
20
4-14
19.8
24
34
28
18
8-10
19.6
10
30
20
18
9-4
18.6
28
34
30
20
9-6
18.8
22
30

14, 8-10; 9-17; L10; L19) là các chủng có hoạt tính cao và đại diện cho các mẫu phân lập (cỏ
Nghệ An, cỏ Mộc Châu, cỏ Ba vì, Ngô Mộc châu, dứa…) để phân loại và nghiên cứu các đặc
điểm sinh học.
3.1.2. Xác định khả năng đối kháng giữa các chủng lựa chọn Tám chủng lựa chọn được nuôi trên môi trường MRS theo phương pháp cấy vạch tiếp
xúc với các chủng khác nhau. Sau 3 ngày ở nhiệt độ 37
o
C, ở tất cả các mẫu đều sinh trưởng tốt.
Điều này cho thấy cả 8 chủng lựa chọn đều không kháng nhau.
3.1.3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng lựa chọn
Tám chủng lựa chọn được nuôi trên môi trường MRS có chứa cơ chất tinh bột, CMC,
pectin, protein và xylan. Sau 3 ngày ở nhiệt độ 37
o
C, xác định hoạt tính enzyme bằng phương
pháp khuếch tán trên thạch.
Khả năng phân giải cơ chất được đánh giá qua vòng phân giải cơ chất D-d, mm
Bảng 3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải cơ chất của các vi khuẩn
Ký hiệu
chủng
Hoạt tính enzym (D-d, mm)
Amylase
CMC-ase
Pectinase
Protease
Xylanase
2-9
9
12

6
12
13
L01
0
0
0
0
0
L19
13
16
18
17
17

Kết quả bảng trên cho thấy trừ chủng L01, thì hầu như cả 7 chủng nghiên cứu đều có khả năng
sinh các enzym ngoại bào, vòng phân giải cơ chất từ 5-18 (mm). Trong đó các chủng sinh
enzyme xylanase là cao nhất. Đặc biệt chủng L19 – chủng duy nhất lên men dị hình – phân giải
các cơ chất mạnh nhất, mạnh hơn cả các chủng lên men đồng hình. Như vậy, đây là một đặc
điểm rất tốt đối với các chủng được lựa chọn làm chất cấy trong quá trình ủ chua, bởi ngoài khả
năng sinh axit cao, kháng khuẩn các chủng nghiên cứu còn có khả năng sinh enzyme ngoại bào
phân giải các cơ chất trong các đống ủ.
3.2. Phân loại các chủng được tuyển chọn
3.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn
Việc phân loại các chủng vi khuẩn được tiến hành căn cứ vào kết hợp các kết quả nghiên
cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân tích, giải trình tự rADN 16S.
Bảng 5 trình bày các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Tất cả 08 chủng vi khuẩn đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, phản ứng catalaza âm tính,
không có khả năng di động và hình thái tế bào có 2 dạng: hình que và hình cầu. Các chủng phân

que
que
que
que
que
cầu
que
Hoạt tính Catalaza
-
-
-
-
-
-
-
-
Khả năng di động
-
-
-
-
-
-
-
-
Khả năng lên men và tạo axit từ
các nguồn hyđratcacbon:

+
+
+
+
+
Galactoza
+
+
+
-
+
+
+
+
Glycerol
+
(yếu)
-
-
-
-
-
+
+
(yếu)
Maltoza
+
+
+
+

+
+
+
D-riboza
+
+
+
+
(yếu)
+
+
+
(yếu)
+
Saccaroza
+
+
+
+
+
+
+
+
D-sorbitol
+
(yếu)
+
(yếu)
+
+

+
+
+
+
-
Sinh trưởng ở các pH 3
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
+( rất
yếu)
+(rất

0 - 6
+
+
+
+
+
+
+
+
8
+
(yếu)
+
(yếu)
+
(yếu)
+
(yếu)
+
(yếu)
+
(yếu)
+
(yếu)

C) 20
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
+ (rất
yếu)
25 - 37
+
+
+

-
Chú thích: (+) dương tính; (-) âm tính
3.2.2. Xác định trình tự 16S rADN và xây dựng cây phân loại
Các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, được thu sinh khối tế bào và tách ADN genom. Đoạn
gen mã cho 16S rARN được khuyếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phổ biến 27F và
1525R, sau đó được tinh sạch và dùng làm khuôn trong phản ứng đọc trình tự với các mồi xuôi
và mồi ngược. Kết quả đọc trình tự (phụ lục) được xử lý bằng phần mềm Clustal X và so sánh
với ngân hàng dữ liệu GeneBank bằng công cụ Blast Search để xác định đến tên loài.
Trình tự 16S rADN của 8 chủng nghiên cứu được xác định. Cây phả hệ được xây dựng
dựa trên trình tự ADNr 16S của 1400 bp của các chủng nghiên cứu với các loài gần gũi nhất với
các loài đó biết thuộc các chi Enterococcus, Lactobacillus. Pediococcus acidilactici được sử
dụng làm nhóm ngoài. Quan sát trên cây phả hệ, có 7 chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với các
loài của nhóm Lactobacillus plantarum; chủng L01 tạo nhánh khác cùng vị trí với Enterococcus
lactis (hình 1- phần phụ lục).
So sánh trình tự ADNr 16S của các chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài
đã biết cho thấy: 7 chủng 2-9, 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 và L19 có mức tương đồng 99,7-100 %
với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus paraplantarum); chủng L01 có mức tương đồng 99,9 với Enterococcus
lactis (bảng 6).
Bảng 6. Tỷ lệ ADNr 16S tương đồng (%) với loài chuẩn gần nhất
Chủng
Tỷ lệ ADNr 16S tương đồng (%) với loài chuẩn gần nhất
2-9
Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,8%), Lactobacillus
paraplantarum (99,8%)
2-10
Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,9%), Lactobacillus
paraplantarum (99,9%)
3-5
Lactobacillus pentosus (99,8%), Lactobacillus plantarum (99,7%), Lactobacillus

Curk et al., 1996). Khác với L. plantarum, L. paraplantarum thường không đồng hóa arabinose
và sorbitol (Curk et al., 1996). Kết hợp các đặc điểm sinh học phân tử và đặc điểm sinh lý, sinh
hoá có thể xếp chủng L19 và 2-9 thuộc loài L. pentosus. Các chủng 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17
thuộc loài L. plantarum. Chủng L01 thuộc loài Enterococcus lactis. Các chủng được lựa chọn
đều là những chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh và được sử dụng rất phổ biến trong các
chế phẩm probiotic. Đây là các chủng nằm trong danh sách các loài vi sinh vật được AFCO
(American Feed Control Officials) Mỹ cho phép sử dụng trong chế biến thức ăn.
4. Kết luận
- Từ các nguồn cỏ voi, thân cây ngô sau thu bắp được ủ chua, đã phân lập được 134
chủng vi khuẩn. Dựa vào các khả năng lên men đồng hình, khả năng chịu nhiệt, khả năng sinh
axit lactic, bacteriocin và enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất, 8 chủng vi khuẩn (2-9; 2-10;
3-5; 4-14, 8-10; 9-17; L10; L19) được chọn cho nghiên cứu.
- Kết hợp các đặc điểm sinh học phân tử và đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá có thể
xếp chủng L19 và 2-9 thuộc loài L. pentosus. Các chủng 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 thuộc loài L.
plantarum. Chủng L01 thuộc loài Enterococcus lactis. Các chủng được lựa chọn đều là những
chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh và được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm
probiotic.
Tài liệu tham khảo
1. Mai Thị Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh và Nguyễn Thị Giang. 2008. Đặc điểm
sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn thành phố Hà nội. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN,
Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24, pp. 221 – 226. 2. Bringel, F., Curk, M. C. & Hubert, J. C. 1996. Characterization of lactobacilli by Southern-type hybridization
with a Lactobacillus plantarum pyrDFE probe. Int J Syst Bacteriol 46: 588–594.
3. Curk M.C., Hubert J.C. & Bringel F. 1996. Lactobacillus paraplantarum sp. nov., a new species related to
Lactobacillus plantarum. Int J Syst Bacteriol 46: 595–598.
4. Emanuel, V., Adrian, V., Ovidiu, P., Gheorghe, C. 2005. Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for
obtaining a product for the preservation of fodders. African Journal of Biotechnology 4(5) 403-408.
5. Kandler O. & Weiss N. 1986. Regular, nonsporing Gram-positive rods. In Bergey’s Manual of Systematic

2
HPO4-2,0; CaCO
3
-5,0; CH
3
COONa-5,0; Cao thịt- 10,0; Triamoni xitrat-2,0;
Pepton-10,0; MgSO
4
.7H
2
O- 0,58; Cao nấm men-5,0; MnSO
4
.4H
2
O- 0,28; Tween 80- 1 ml; Thạch- 15,0;
Nước cất vừa đủ- 1lít; pH= 7,0; khử trùng ở 121
o
C/15 phút
Môi trường dịch thể bỏ thạch và CaCO
3

1.2. Môi trường thạch thường (g/l): nuôi vi sinh vật kiểm định
Cao thịt - 2,0; Pepton- 5,0; NaCl- 1,0; Thạch-15,0; Nước cất vừa đủ-1000ml (pH= 7,0); khử
trùng ở 121
o
C/15 phút.
2. Cây phân loại của các chủng nghiên cứu

53
Enterococcus lactis_DQ255948
L01
Enterococcus faecium_AJ301830
86
Enterococcus durans_AJ276354
Enterococcus hirae_Y17302
94
64
Enterococcus mundtii_AF061013
82
Enterococcus pseudoavium_ AF061002
98
Enterococcus gallinarum_ AF039900
Enterococcus faecalis_AB012212
54
56
52
100
55
0.02