TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC – THỰC PHẨM
MÔN CÔNG NGHỆ LÊN MEN
NHỮNG HỆ THỐNG CỐ
ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN
TRONG ỨNG DỤNG
LÊN MEN LIÊN TỤC
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2013
GVHD: Trịnh Khánh Sơn
SVTH:
Nguyễn Ngọc Phương Anh 11116003
Nguyễn Thị Minh Trang 11116071
Đinh Trọng Thuần 10116063
Khiany Phimavong 111160L1
TÓM TẮT:
Trong một số ngành công nghiệp liên quan đến nấm men, hệ thống lên men liên tục cung
cấp lợi thế kinh tế rất quan trọng so với các hệ thống truyền thống. Tốc độ lên men được cải
thiện đáng kể, đặc biệt là khi lên men liên tục được kết hợp với kỹ thuật cố định tế bào để làm
tăng mật độ nấm men trong quá trình lên men. Do đó kỹ thuật này được xem là sự hứa hẹn tuyệt
vời cho hiệu quả sản xuất của đồ uống lên men, chẳng hạn như bia, rượu vang và rượu táo cũng
như ethanol sinh học. Tuy nhiên, có một số cạm bẫy quan trọng, và vài hệ thống lên men liên tục
quy mô công nghiệp đã được triển khai. Trước tiên, chúng ta xem xét các kỹ thuật cố định tế bào
khác nhau và thiết lập bồn lên men. Sau đó, ảnh hưởng của sự cố định đến sinh lý tế bào và hiệu
suất quá trình lên men được thảo luận. Cuối cùng, chúng ta tập trung vào việc sử dụng thực tiễn
quá trình lên men liên tục và các hệ thống cố định tế bào để sản xuất bia.
GIỚI THIỆU:
Hệ thống lên men truyền thống sử dụng các tế bào nấm men huyền phù tự do trong bồn lên
men mẻ. Bồn lên men được làm đầy với môi trường chưa lên men và toàn bộ bồn ('' mẻ'') dần
dần được lên men và sau đó ra khỏi bồn. Ngược lại, hệ thống lên men liên tục có một dòng
chảy liên tục của môi trường chưa lên men vào bồn lên men và một dòng chảy liên tục tương
ứng của sản phẩm lên men ra khỏi hệ thống. Trong hệ thống lên men đơn giản nhất, bồn lên

Sự gắn kết bề mặt của tế bào nấm men
Trong loại cố định này, tế bào nấm men được cho phép gắn vào một nguồn hỗ trợ vững
chắc. Nhiều loại vật liệu mang khác nhau đang được sử dụng (Willaert 2006). Sự gắn kết tế bào
với chất mang có thể được gây ra bằng cách sử dụng tác nhân liên kết (như oxit kim loại, Glu-
taraldehyde hoặc Aminosilane). Tuy nhiên, để sản xuất đồ uống và ethanol, độ kết dính tự nhiên
thường được ưa thích hơn việc sử dụng (có khả năng gây hại hoặc không ổn định) chất gây cảm
ứng. Sự cố định tự nhiên rất đơn giản và các điều kiện ở mức độ nhẹ, nhưng tỷ trọng tế bào
thường không cao như các loại thu được trong các hệ thống mà các tế bào bị bẫy (xem thêm).
Hơn nữa, khi không có rào cản giữa các tế bào và dung dịch, tách rời tế bào và di dời là có thể
làm được. Trong khi sự kết dính tự nhiên của tế bào nấm men với chất nền vẫn còn khó giải
thích, một số cơ chế đã được đề xuất (đại diện cho bài nhận xét, xem Verstrepen and Klis
2006). Hiện tượng kết dính, ví dụ, được tạo bởi tĩnh điện, ion (Lewis acid/base) và tương tác
kỵ nước (Lifshitz-van der Waals) (Oliveira 1997), nhưng sự giữ lại trong lỗ trống chất mang và
keo tụ nấm men cũng có thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình cố định hình thành
trước , các chất mang tạo hình thô (Branyik et al. 2004b). Do đó, các đặc tính của tế bào nấm
men và chất mang, như kỵ nước, tích điện, các thuộc tính cho và nhận electron cần được xem
xét khi thiết kế các chất mang cố định mới.
Bẫy trong ma trận xốp
Cách cố định chính thứ hai là bẫy trong ma trận xốp. Có hai phương pháp bẫy. Đầu tiên,
các tế bào được cho phép khuếch tán vào một ma trận xốp hình thành trước. Sau khi các tế bào
bắt đầu phát triển, chuyển động của chúng bị cản trở bởi sự hiện diện của các tế bào khác và ma
trận hậu quả là chúng bị kẹt (Baron và Willaert 2004). Sự đính kèm trên bề mặt của vật liệu này
cũng có thể xảy ra (Mistler và Breitenbu ¨ cher 1995). Bọt biển, thủy tinh kết dính, gốm sứ,
cacbua silic, polyurethane, chitosan và các sợi thép không gỉ là những vật liệu thường được sử
dụng (Masschelein 1994; Scott và O'Reilly 1995; Tata và cộng sự năm 1999; Shen et al 2003b).
Trong phương pháp thứ hai, ma trận xốp được tổng hợp tại chỗ xung quanh các tế bào. Thông
thường, hydrogel polymer tự nhiên và tổng hợp như Ca-alginate, κ-carrageenan, agar,
polyurethane, polystyrene và polyvinylalcohol được sử dụng (Ramakrishna và Prakasham 1999).
Những hạt polymer thường có dạng cầu với đường kính khoảng từ 0,3 đến 3 mm. Mặc dù có thể
thu được tỷ trọng sinh khối cao, bẫy gel ít được chú ý trong ngành công nghiệp lên men vì một

hơn chúng có vẻ. Keo tụ bị ảnh hưởng bởi nhiều thông số, chẳng hạn như điều kiện dinh dưỡng,
kích động, nồng độ Ca
2+
pH, nhiệt độ lên men, việc xử lý nấm men và điều kiện bảo quản
(Verstrepen et al 2003; Sampermans và cộng sự 2005). Do đó, môi trường tự lên men, và đặc
biệt hơn lượng hợp chất glucose, sucrose và nitơ có thể ảnh hưởng đến thành công của việc cố
định (Verstrepen et al. 2004). Tuy nhiên các thông số này chưa được nghiên cứu một cách hệ
thống và rất khó để dự đoán tác động của môi trường lên kết dính tế bào. Trên hết, keo tụ là một
sự biến dạng - hiện tượng đặc biệt (Jin và Speers 1998). Khả năng của các tế bào nấm men để
keo tụ có tầm quan trọng đáng kể cho ngành công nghiệp sản xuất bia, vì nó cung cấp một cách
hiệu quả và đơn giản để tách hầu hết các tế bào nấm men từ bia tươi ở cuối quá trình lên men. Vì
vậy, keo tụ mạnh và hoàn chỉnh là một thuộc tính mong muốn cho tất cả các nấm men của bia.
Tuy nhiên, các tế bào nấm men không nên keo tụ trước khi dịch hèm bị suy giảm hoàn toàn,
chẳng hạn keo tụ sớm gây trì trệ, gọi là'' treo'', quá trình lên men, có thể dẫn đến các loại bia bị
mất hương vị (Verstrepen và cộng sự 2003). Tầm quan trọng ngày càng tăng trong các lò phản
ứng keo tụ, vì triển vọng của mật độ tế bào cao trong quá trình liên tục, tiếp tục tăng cường nhu
cầu kiểm soát keo tụ nấm men (Xu et al. 2005). Trong trường hợp này, chủng nấm men keo tụ
cấu thành (bằng kỹ thuật di truyền) đều mong muốn, bởi vì chủng thông thường chỉ keo tụ trong
pha ổn định và do đó các tế bào theo cấp số nhân sẽ bị rửa sạch (Domingues et al. 2000).
HÌNH DẠNG LÒ PHẢN ỨNG
Nói chung, trong hệ thống lên men cố định liên tục, 5 loại lò phản ứng sinh học đang được
sử dụng, được mô tả bằng sơ đồ ở hình. 2. Các lò phản ứng sinh học bao gồm ba pha: rắn (chất
mang hoặc khối kết tập), chất lỏng (môi trường) và khí (không khí, oxyhoặc chất khí khác).
Đánh giá chi tiết hơn được đưa ra ở nơi khác (Baron et al 1996;. Obradovic và cộng sự năm
2004.). Sự lựa chọn lò phản ứng có liên quan đến các loại hình cố định, đến sự chuyển hóa của
các tế bào, và với khối lượng và yêu cầu truyền nhiệt.
Trong một lò phản ứng ống phức hợp (Hình 2A), môi trường lên men được truyền hoặc lên
hoặc xuống thông qua các phản ứng được phức hợp với các nấm men cố định. Đây là loại lò
phản ứng có ưu điểm là đơn giản và khả năng hiện thực hóa một dòng chảy lặp đi lặp lại. Về mặt
lý thuyết, duy trì điều kiện dòng chảy lặp đi lặp lại lý tưởng sẽ cho phép các giai đoạn khác nhau

có thể được xem như là hình thức phát triển tự nhiên mà nó có thể bảo vệ khỏi áp lực nào đó
(Verstrepen và Klis 2006), có liên quan đến ứng suất-FAC. Những phản hồi phủ định điều khoản
tham chiếu mà sự cố định áp đặt lên tế bào nấm men, trong đó ảnh hưởng của truyền khối giới
hạn là quan trọng nhất.
Bẫy trong hạt keo và chất mang trơ cho thấy đặc điểm giới hạn khuếch tán như nhau. Sự
hấp phụ chỉ là rào cản cho quá trình truyền khối bên ngoài (giữa môi trường và các chất mang)
mà không có giới hạn truyền khối nội bộ. Đặc tính truyền khối nội bộ được quyết định bởi đặc
điểm cơ – hóa của yếu tố cố định, ví dụ như: kích thước, độ xốp, cấu trúc. Một thông số quan
trọng trong việc đánh giá quá trình truyền khối nội bộ là môđunThiele, được định nghĩa là tỷ số
của chất nền được tiêu thụ trên chất nền mới được cung cấp bởi quá trình khuếch tán (Willaert
cùng các cộng sự 1996). Vấn đề chính được xem xét là truyền khối bên ngoài là sự chọn lựa bể
phản ứng phức hợp và bể phản ứng một tầng hay kích động. Nên cẩn thận trong việc kết luận
rằng hoạt tính nấm men cố định có bản chất thay đổi. Để giải quyết vấn đề này, tế bào nấm men
có thể được gắn như một lớp đơn (Doran và Bailey 1986, Shen cùng các cộng sự 2003b).
Sự so sánh giữa hoạt động trao đổi chất của tế bào cố định và tế bào tự do cho thấy sự hoạt
hóa khả năng trao đổi chất mạnh mẽ của nấm men và tăng cả khả năng lưu trữ (glycogen và
trehalose) và cấu trúc polysaccharides (glucan và mannan) (Doran và Bailey 1986, Galazzo và
Bailey 1990, Jirku cùng các cộng sự 2000). Việc tăng mức độ bội thể và hàm lượng protein trong
tế bào cố định, khiến Doran và Bailey (1986) đưa ra giả thuyết rằng do sự gắn kết các tế bào dày
đặc bên trong gel, sự sinh sản bằng cách nảy chồi và nhân rộng tế bào, nhưng không có DNA và
sản xuất poly-saccharide, bị ngăn cản. Tuy nhiên, sự gia tăng lưu trữ polysaccharides cũng có thể
được giải thích bởi tương tác giữa hấp thụ glucose và hoạt động của enzyme
phosphofructokinase (Galazzo và Bailey 1990).
Việc so sánh tốc độ tăng trưởng đã cho ra nhiều kết quả trái ngược nhau. Số liệu báo cáo
đã mô tả sự gia tăng, tốc độ tăng trưởng ổn định hoặc giảm xuống (Norton và D’Amore 1994).
Tế bào cố định được xem là kháng lại ethanol hơn là tế bào nấm men huyền phù tự do.
Theo Hilge – Rotmann và Rehm (1990), độ bão hòa gia tăng của hàm lượng axit béo của nấm
men cố định (do điều kiện thẩm thấu thay đổi trong vi môi trường của các tế bào) có tương quan
với sự gia tăng dung nạp. Thật vậy, các tế bào nấm men cố định cho thấy tỷ lệ axit béo bão hòa
cao hơn so với các tế bào tự do (Norton cùng các cộng sự1995; van Iersel cùng các cộng sự1999;

nhiên, các quá trình lên men bia liên tục không bao giờ thành công về phương diện thương mại
do nhiều vấn đề thực tế, chẳng hạn như gia tăng nguy cơ ô nhiễm (chủ yếu là do sự cần thiết để
lưu trữ bổ sung dịch hèm trong bồn chứa), sự thay đổi trong hương vị bia, thiết kế hệ thống phức
tạp và thiếu linh hoạt. Chỉ có quá trình sản xuất bia liên tục của chuỗi nhà máy bia Dominion ở
New Zealand bởi Morton Coutts được thực hiện thành công ( Coutts1966 ; Dunbar cùng các
cộng sự 1988 ). Trong những năm 1970, có một sự hồi sinh trong việc phát triển hệ thống lên
men bia liên tục mới, nhờ sự phát triển của công nghệ tế bào cố định. Những ưu điểm chính của
việc sử dụng tế bào cố định để sản xuất bia là nâng cao năng suất tích, cải thiện sự ổn định tế
bào, việc thực hiện dễ dàng hơn của vận hành liên tục, cải thiện kiểm soát vận hành, phục hồi tế
bào hỗ trợ và tái sử dụng, và đơn giản hóa chế biến sản phẩm ra ( Nedovic cùng các cộng sự
2005 b ). Narziss và Hellich đã phát triển một trong những hệ thống cố định đầu tiên để sản xuất
bia. ''Lò phản ứng sinh học biobrew'' của họ bao gồm một bộ lọc Kieselguhr, đặc trưng bởi thời
gian lên men ngắn, mặc dù hương vị không đạt yêu cầu ( Narziss và Hellich1971;Narziss 1997 ).
Hiện nay, chỉ có nấu bia và sản xuất bia không cồn thu được bằng phương tiện của các lò
phản ứng nấm men cố định quy mô thương mại. Trong các quá trình này, không có tăng trưởng
nấm men thực tế và hình thành hương vị được yêu cầu. Trong quá trình lên men thứ cấp,
diacetyl, chất có hương vị bơ, đang được giảm đến mức hương vị tương đối, acetoin vô hoạt và
2,3-butanediol bởi các tế bào nấm men. Đi-xeton nối đôi này được hình thành trong quá trình lên
men chính bởi một decarboxylation oxy hóa ngoại bào của một α-acetolactate, chất rò rỉ từ các
quá trình isoleucine – valine. Hai hệ thống nấu chín liên tục đã được triển khai trong công nghiệp
cho đến nay: một ở Sinebrychoff Nhà máy bia (Phần Lan, công suất: 1 triệu hl mỗi năm) và một
hệ thống khác, được phát triển bởi Kỹ thuật Alfa Laval và Schott (Mensour và cộng sự năm
1997.). Cả hai đều bao gồm một máy tách (để ngăn chặn phát triển các tế bào nấm men trong các
giai đoạn tiếp theo), một đơn vị xử lý nhiệt (để đẩy nhanh tiến độ chuyển đổi hóa học của α-
acetolactate thành diacetyl và acetoin), và một lò phản ứng khuôn đầu tràn với nấm men cố định
trên hạt DEAE-cellulose hoặc hạt thủy tinh xốp (để giảm diacetyl còn lại) tương ứng. Sau đó, các
chất mang DEAE-cellulose được thay thế bằng gỗ vụn giá rẻ hơn (Virkaja¨ rvi 2002). Gần đây,
xử lý nhiệt đã được thay thế bởi sự chuyển hóa enzyme trong một lò phản ứng cố định, trong đó
decarboxylase α-acetolactate được cố định trong viên nang đa lớp đặc biệt, tiếp theo là giảm
diacetyl bằng nấm men trong một lò phản ứng ống phức hợp thứ cấp (Nitzsche và cộng sự

thứ hai. Trong các lò phản ứng ống phức hợp chủ yếu este và ethanol được tạo ra kỵ khí. Hạt gel
Ca-alginate ban đầu được chọn là chất mang nguyên liệu để cố định các tế bào nấm men, nhưng
chúng sau này được thay thế bằng hạt gốm sứ, vì khả năng tồn tại lâu hơn nấm men. Để cải thiện
khả năng làm mát trong quá trình nhân rộng, ống làm mát đã được đưa vào trong các lò phản ứng
ống phức hợp. Ở giai đoạn thứ ba, được đi trước bằng bước xử lý nhiệt và tương tự giai đoạn
trước đó, quá trình nấu bia diễn ra. Điều này là cần thiết, nồng độ còn lại của đi-xeton nối đôi
thường cao hơn trong hệ thống tế bào cố định (có thể do thời gian cư trú ngắn, do đó việc giảm
diacetyl không đủ diễn ra). Bia được sản xuất trong quá trình này trong vòng 3-5 ngày.
Ở Bảng 1, hầu hết các hệ thống phòng thí nghiệm và quy mô thí điểm triển vọng nhất cho
liên tục lên men chính bia trong tương lai được tóm tắt.
Bảng 1 Triển vọng hệ thống nấm men cố định cho quá trình lên men chính bia
KẾT LUẬN VÀ CÁC TRIỂN VỌNG TƯƠNG LAI
Mặc dù có rất nhiều ưu điểm tiềm tàng, quá trình lên men liên tục với nấm men cố định
vẫn chưa được áp dụng trên quy mô công nghiệp, vì ưu thế chi phí chưa thực hiện được, một số
vấn đề kỹ thuật và đặc tính sinh lý và trao đổi chất nấm men bị thay đổi, ảnh hưởng đến hương vị
của đồ uống hoặc hiệu suất quá trình lên men. Hơn nữa, chi phí vận chuyển là một nhân tố quyết
định tính khả thi của hệ thống cố định. Thúc đẩy bởi các cuộc khủng hoảng năng lượng gần đây,
tăng cường nghiên cứu nhằm phát triển các lò phản ứng được cải thiện, sự hiểu biết tốt hơn về
sinh lý học của các hệ thống tế bào cố định và các cơ chế cố định, cùng với việc tìm kiếm các vật
liệu chất mang giá rẻ, sáng tạo và mới lạ, nên cho phép triển khai thực hiện tổng quát hơn công
nghệ đầy hứa hẹn này.