1
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian
học tập tại Trường.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng và TS. Lê
Hồng Điệp, những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên
làm việc tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện
Di truyền Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp
đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng thời gian qua.
Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ
thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ
theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT. Tôi xin chân thành biết ơn sự hỗ trợ đó.
Hà Nội, tháng 6 năm 2014
Học viên Tống Thị Hường i
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC HÌNH v
1.7. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo phôi hóa tạo hệ thống tái sinh và
chuyển gen vào sắn 24
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1. Vật liệu nghiên cứu 27
2.1.1. Mẫu thực vật 27
2.1.2. Vi khuẩn và các vector 27
2.1.3. Môi trường nuôi cấy 28
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 28
2.2.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch 28
2.2.2. Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm 29
2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 29
2.2.4. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa
30
2.2.5. Phương pháp biến nạp 31
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Nghiên cứu tạo mẫu sạch 33
3.2. Nghiên cứu thí nghiệm tạo chồi, nhân cụm chồi và kéo dài chồi 36
iii
3.3. Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa từ chồi nách cây sắn 37
3.4. Kết quả tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa của giống TMS
60444 47
3.5. Kết quả chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa của giống TMS 60444 49
KIẾN NGHỊ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60
đến khả năng tiếp nhận gen của mô sẹo phôi
hóa 51
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Hình thái cây sắn [47] 3
Hình 2. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 1995 – 2012 [66] 8
Hình 3. Sản lượng sắn (năm 2008) của các nước trên thế giới [65] 9
Hình 4. Các hệ thống đang được sử dụng để thu cây sắn biến đổi gen [59] 24
Hình 5: Tỷ lệ mẫu sống của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau
33
Hình 6: Tỷ lệ mẫu sạch của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau
34
Hình 7. Kết quả thí nghiệm tạo cụm chồi của giống HL 2004-28 sau 28 ngày nuôi cấy
37
Hình 8. Các cụm mô sẹo 2 tuần tuổi trong môi trường CIM 40
Hình 9. Khối mô sẹo của các giống trong môi trường DKW sau 2 tuần nuôi cấy 42
Hình 10. Khối mô sẹo HL 2004-28 (A); KM 140 (B); KM 419 (C) và TMS 60444 (D)
ở giai đoạn 8 tuần tuổi tại môi trường MMS 45
Hình 11. Cụm mô sẹo phôi hóa tái sinh 48
Hình 12: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào sắn thông qua A. tumefaciens 50
Hình 13: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD
600
=
Napthanele acetic acid
2,4D
Axit 2,4 Diclorophenoxiaxetic
ADN
Acid deoxiribonucleic
Picloram
4-Amino-3,5,6-trichloro-2-pyridinecarboxylic
Glufosinate
(RS)-2-Amino-4 (hydroxy(methyl)phosphonoyl)butanoic acid
MS
Murashige and Skoog
OD
Optical Density
w/v
Weight per volume 1
MỞ ĐẦU
Biến đổi khí hậu làm nhiệt độ trái đất tăng lên, dẫn đến các hiện tượng hạn hán,
lũ lụt xảy ra thường xuyên hơn, cùng với dịch bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự
sinh trưởng và phát triển cũng như năng suất cây trồng. Điều này ảnh hưởng trực tiếp
đến đời sống của con người, đặc biệt là vấn đề an ninh lương thực, nhất là đối với con
người ở những khu vực thường xảy ra thiên tai hoặc có điều kiện tự nhiên không thuận
lợi. Trước tình hình đó, việc tạo ra các nguồn giống cây mới, nhất là cây lương thực có
năng suất cao, phẩm chất tốt, thích nghi rộng với các điều kiện môi trường, càng trở
nên cấp thiết. Công nghệ chọn giống trước đây chủ yếu được tiến hành bằng phép lai
giữa các giống có các tính trạng khác nhau để thu được thế hệ con lai có tính trạng
mong muốn. Tuy nhiên phương pháp này có những hạn chế nhất định khiến tiềm năng
- Tạo được lượng lớn nguồn nguyên liệu sắn vô trùng, phục vụ cho việc tạo mô
sẹo phôi hóa.
- Xác định được mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh từ mô sẹo
phôi hóa.
- Thăm dò khả năng chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa thông qua Agrobacterium
tumefaciens.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về
mức độ tạo mô sẹo phôi hóa, khả năng tái sinh, khả năng tiếp nhận gen từ
Agrobacterium tumefaciens vào mô sẹo phôi hóa của sắn (Manihot esculenta Crantz).
Ý nghĩa thực tiễn: Là cơ sở ứng dụng để chuyển gen quan tâm vào cây sắn (M.
esculenta Crantz) nhằm tạo ra giống sắn mới có tính trạng mong muốn.
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực
vật – Viện Di truyền Nông nghiệp, với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ
thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ
theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT.
3
CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây sắn
1. 1. 1. Nguồn gốc và phân loại
Cây sắn (Manihot esculanta Crantz) là cây đóng vai trò quan trọng trong kinh tế
nông nghiệp của nước ta. Nó không chỉ đóng vai trò cung cấp nguồn thực phẩm cho con
người, nguồn thức ăn cho chăn nuôi mà còn là mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ chốt,
Sắn được người Bồ Đào Nha đưa vào châu Phi lần đầu tiên vào giữa thế kỷ 16.
Trải qua thế kỷ 17 phát triển chậm chạp, sắn được du nhập vào đảo Bourbon và Ilede
(Pháp) vào các năm 1738-1739, và đưa sang Madagasca vào năm 1875, Xri lanca
(1786), Calcutta (1794) và một số nước phía đông châu Phi như Zambiar (1799),
Uganda (1878). Ở châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ 17, Việt Nam
và một số nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ 18 [2].Tuy nhiên, mãi đến
thế kỷ 19, nghề trồng sắn và tiêu thụ mới thực sự phát triển với sự du nhập các kỹ thuật
chế biến ở Brazin bởi các nô lệ được phóng thích. Từ đó đến nay, diện tích, năng suất
và sản lượng sắn ngày một tăng [8].
5 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây sắn
Rễ sắn
Rễ sắn có thể mọc ra từ hạt hoặc từ hom (đoạn thân cây được lựa chọn giữ lại
làm giống cho vụ kế tiếp). Rễ mọc từ hạt bắt đầu là một rễ cọc mọc thẳng cắm xuống
đất sau đó các rễ phụ mọc ra. Cả rễ cọc và rễ phụ đều có khả năng phát triển thành củ.
Rễ mọc ra từ hom thì đầu tiên mọc ngang sau đó cũng cắm thẳng xuống đất.
Rễ sắn có hai chức năng chính là đồng hóa và dự trữ. Rễ đồng hóa thường cắm
sâu trong lòng đất có thể dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng và giúp cho cây
vững chắc. Rễ dự trữ (rễ củ) do các rễ con tập trung dinh dưỡng mà thành. Khi cây
mới ra rễ thì có rất nhiều rễ con nhưng sau đó chỉ một số rễ con được tập trung dinh
dưỡng phát triển thành củ. Củ sắn thường có dạng hình trụ có thể dài tới 30 cm, có thể
có hoặc không có cuống củ [19].
Thân cây
Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ 1-3 m. Chiều cao của cây phụ thuộc vào
giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng. Thân sắn có
khả năng phân cành, tuy sự phân cành có ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của cây.
Thân và cành già đã hóa gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng. Số lượng thân
Số lượng hoa của mỗi giống sắn không giống nhau, thường hoa đực sẽ nhiều
hơn hoa cái nhưng hoa cái lại thường nở trước hoa đực để tránh hiện tượng tự thụ
phấn. Hoa cái nở cuối cùng thường nở cùng với hoa đực nở đầu tiên trên cây. Hoa đực
thường nở vào giữa trưa còn hoa cái thường khép lại vào nửa cuối buổi chiều.
Bao phấn bắt đầu mở trước khi hoa nở được khoảng 2 giờ và mở hoàn toàn
trước khi hoa nở 1 giờ; sau đó phát tán nhờ gió hoặc côn trùng với phạm vi thụ phấn là
trong khoảng 30 cm. Tuổi thọ của hạt phấn là một tuần còn thời gian tiếp nhận hạt
phấn của đầu nhụy trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo, chuyển sang
màu nâu, khô đi và rụng chậm nhất là sau 1 ngày. Thời gian từ lúc thụ phấn đến thụ
tinh kéo dài từ 8-19 giờ [8], [19].
7
Quả và hạt
Quả sắn thuộc loại quả nang, mở khi chín, đường kính 1-1,5 cm. Quả có 3 ngăn,
được tạo thành từ 6 cánh của bầu hoa, mỗi ngăn chứa một hạt. Màu sắc quả thường
biến đổi từ lục nhạt, hơi vàng đến lục hay đỏ tía khá đậm. Cuống quả phình lên ở chỗ
tiếp xúc với quả. Sau khi chín, quả tự mở chỉ còn lại trục giữa của quả.Hạt sắn hình
trứng, tiết diện hơi giống hình tam giác. Hạt có vân hoặc những vết màu nâu đỏ trên
nền màu kem hoặc xám nhạt [8], [19].
1.1.3. Giá trị của cây sắn
Sắn là một trong 3 cây lương thực quan trọng nhất thế giới bên cạnh gạo và ngô
[26]. Củ sắn có hàm lượng tinh bột cao với khoảng 84-87% trọng lượng khô, là nguồn
cung cấp carbonhydrate cho hơn 500 triệu người ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới
cũng như hơn 1 tỷ người trên thế giới.Trong củ sắn cũng có một số loại axit amin chứa
lưu huỳnh tuy lượng không nhiều và hàm lượng thấp các protein, chất béo, một số chất
khoáng (P, K, Mg, ) và vitamin (B1, B2, ) [22], [25], [30]. Tại Châu Á, Châu Phi và
Mỹ Latinh, có khoảng 600 triệu người có cuộc sống phụ thuộc vào cây sắn. Ở những
Hình 2. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 1995 – 2011 [66]
Năm 2011, sản lượng sắn thế giới đạt 252,2triệu tấn củ tươi so với 231,76triệu
tấn năm 2010 và năm 1995 là 161,79 triệu tấn. Nước sản xuất sắn nhiều nhất là
Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu tấn) và Indonesia (19,92 triệu
0
50
100
150
200
250
300
0
5
10
15
20
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
10
Sản lượng sắn ở Việt Nam bị suy giảm trong suốt những năm 1980-1990,
nhưng trồng sắn đã tăng mạnh trong những năm gần đây (2000-2012). Sản lượng sắn
năm 2000 chỉ đạt 1,99 triệu tấn đã tăng gấp 5 lần, đạt 9,74 triệu tấn vào năm 2012
(Bảng 2). Sự nhảy vọt này là do có sự tăng mạnh cả diện tích trồng (từ 237600 ha năm
2000 lên 550600 ha năm 2012) và năng suất (từ 8,66 tấn/ha năm 2000 lên 17,7 tấn/ha
năm 2012). Sản lượng sắn ở các vùng miền Trung và khu vực Đông Nam Bộ chiếm
đến 78% tổng sản lượng cả nước, đặc biệt là các tỉnh Gia Lai, Kon Tum, Đắk
Nông,Đắk Lắk ở Tây Nguyên; Tây Ninh, Đồng Nai, Bình Phước, Bình Thuận ở khu
vực Đông Nam Bộ; và các tỉnh Phú Yên,Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định ở khu
vực duyên hải miền trung (Bảng 2).
Bảng 2. Sản lƣợng sắn (x 1000 tấn) trồng tại Việt Nam từ 1995 – 2012 [66]
Việt Nam đạt được tiến bộ nhanh trong việc áp dụng công nghệ mới trong chọn
tạo và nhân giống cây trồng mới ở châu Á. Tiến bộ nàylà kết quả của nhiều yếu tố,
trong đó sự thành công trong lai tạo giống và ứng dụng công nghệ mới là những yếu tố
góp phần chính. Sự kết hợp giữa sản xuất trên diện rộng và phát triển các ngành công
nghiệp chế biến tinh bột và ethanol đã tạo ra nhiều công ăn việc làm, tăng xuất khẩu,
thu hút đầu tư nước ngoài và góp phần công nghiệp hóa và hiện đại hóa một số khu
vực nông thôn. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN & PTNT) đã có kế
hoạch duy trì diện tích sắn khoảng 450000 ha 2011-2015, và những nỗ lực đang được
thực hiện để tăng năng suất củ tươi 16,9-20 tấn/ha vào năm 2011 và 23-24 tấn/ha vào
năm 2015 bằng cách sử dụng công nghệ mới, đặc biệt là trong lai tạo (Bộ NN & PTNT
7256/TB-BNN-VP 25/12/2009) [26].
Việt Nam gần đây đã phát triển một chính sách E10 mà sẽ yêu cầu sản xuất từ
100 đến 150 triệu lít mỗi năm. Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt "Đề án phát triển
nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm 2025", nhằm mục đích để sản
11
xuất nhiên liệu sinh học và một phần thay thế nhiên liệu truyền thống. Điều này sẽ
60
Ethanol Tam Nông
100
Đồng Xanh
70
Tổng cộng
650 triệu lít/ năm
1.3. Lịch sử phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật được khởi nguồn từ học thuyết tế bào,
được nêu bởi Schleiden và Schwan vào năm 1983. Đến năm 1902, Haberlandt đã đưa
học thuyết trên vào thực nghiệm với nỗ lực tạo các phôi nhân từ các tế bào soma từ lá
một số cây một lá mầm, tuy nhiên, những thí nghiệm của ông đã thất bại bởi các cây
một lá mầm rất khó nuôi cấy và các tế bào này đã mất khả năng tái sinh. Sau đó, Kotte
và Robins (năm 1922)đã lặp lại thí nghiệm này với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một
cây hòa thảo. Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh
trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Thành công bước đầu của thí
nghiệm này đã mở ra giai đoạn phát triển mạnh mẽ của công nghệ nuôi cấy mô tế bào
với thành công của White(1934) khi nuôi cấy thành công rễ cây cà chua
(Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước
chiết nấm men. Sau đó, White đã thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại
12
vitamin nhóm B: thiamine (B1), pyridoxine (B6) và nicotinic acid nên việc nuôi cấy
đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau.Sau khi Went
và Thimann phát hiện chất điều hòa sinh trưởng (hormone) đầu tiên làacid-β-
indolacetic (IAA) và kết tinh được chất này, Gautheret cùng với Nobercourt (năm
1939) đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian vô hạn của mô
sẹo cà rốt (Daucuscarota) trên một môi trường rắn bằng thạch, bằng cách cấy chuyền 6
năm 1965 cho dù chúng gây ra nhiều tranh cãi về khả năng xâm nhập và biểu hiện
cũng như tồn tại lâu dài của ADN ngoại lai. Nhờ các plasmid, hàng loạt gene ngoại lai
được chuyển vào nhiều họ thực vật. Các phương pháp để đưa gene ngoại lai vào tế bào
thực vật cũng trở nên đa dạng với những kĩ thuật hiện đại như sử dụng điện
(electroporation), kĩ thuật vi tiêm (microinjection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene
transfer), sử dụng súng bắn gene (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế
giới ứng dụng và phát triển bên cạnh kĩ thuật chuyển gen truyền thốngbằng vi khuẩn
Agrobacterium [16].
Khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân
giống cây trồng và phục tráng cây trồng với thí nghiệm của Morel (1960) trên các loài
địa lan (Cymbidium). Với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel có thể phục
tráng, tạo các dòng vô tính không bị nhiễm bệnh virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị
với khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và hàng loạt cây trồng có giá trị kinh tế cao như
chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả có múi và đã có những đóng góp to
lớn cho nông nghiệp thế giới.
Hiện nay, công nghệ nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực
tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học
và vào nghiên cứu lí luận di truyền thực vật bậc cao. Các hiểu biết cơ bản về đời sống
của mô và tế bào đơn độc trong môi trường nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin,
chất sinh trưởng, nguồn cacbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều
khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng là những tiền đề được
chuẩn bị trong giai đoạn trước.
Ở Việt Nam, nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương
trình chọn giống, nhân giống hiện đại. Mặc dù còn rất nhiều vấn đề phải đi sâu nghiên
cứu để giải quyết trong những năm tới, nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi
giai đoạn phôi thai của nó và đang chuẩn bị những đóng góp tích cực vào lí luận sinh
học cây trồng và vào thực tiễn nông nghiệp.
14
15
dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học [17]. Sự biệt hóa tế bào hình
thành chất liệu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây, hơn nữa hình thành vùng mô phân
sinh, trung tâm sự tạo nên chồi và rễ [29].
Khả năng hình thành chồi phụ thuộc vào số lần cấy chuyền và hàm lượng các
chất điều hòa sinh trưởng, trong đó, tỷ lệ cytokinin/auxin từ 10–100 đóng vai trò quyết
định. GA
3
cản trở sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi,
tuy nhiên sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy ra trên môi trường không có chất kích
thích sinh trưởng hoặc có cytokinin và không có auxin . Ngược lại, quá trình tạo rễ cần
auxin, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng. Để tạo ra rễ thường dùng phlorolgucinol + IBA có
hiệu quả hơn chỉ dùng auxin [6].
1.4.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp nuôi cấy mô – tế bào có những ưu điểm đáng lưu ý như (1) Cây
con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng
suất cao; (2) tạo được cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng
đã chọn lọc; (3) Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao; (4) Tạo được cây có
genotip mới (đa bội, đơn bội); (5) Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen; (6) Có khả năng
sản xuất quanh năm; (7) Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều
kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém và (8) Hệ số nhân giống cực kì cao
(thường đạt được ở các loài cây khác nhau trong phạm vi từ 3
6
-10
12
/năm), rút ngắn
thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà.Trong công tác giống cây trồng, vấn
đề chất lượng và số lượng giống được quan tâm hàng đầu. Bằng phương pháp nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus bởi (1)
ra khối lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn thông qua kĩ thuật tạo phôi soma
hoặc chế ra hạt giống nhân tạo. Tuy nhiên, nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác
với cây mẹ về mặt di truyền do quá trình phát sinh và phát triển của mô sẹo thường
xuất hiện đột biến gen, gây ra bởi hiện tượng nội nguyên phân, là hiện tượng nhân đôi
nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào. Đột biến tuy không có lợi cho việc duy trì
nguyên trạng những đặc tính di truyền trong quá trình tạo giống nhưng lại chính là đối
tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống. Ngoài việc cung cấp những đột biến tự
nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lí tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác
nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen.
17
Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá thể đã chọn lọc
người ta thường tái sinh cây theo hướng trực tiếp, còn mục tiêu của tái sinh gián tiếp là
tạo ra nhiều biến dị để phục vụ cho việc chọnlọc và cải tạo giống cây trồng [3].
1.5. Môi trƣờng nuôi cấy tế bào mô thực vật
Môi trường nuôi cấy là yếu tố quyết định tăng trưởng, phát triển và biệt hóa của
tế bào – mô thực vật. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài
thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và
nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành
phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm nguồn cacbon, các
vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng.Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu
cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA, …) và một số chất có thành phần
không xác định như nước dừa, dịch trích nấm men…Tuy vậy, một số thành phần
không thể thiếu trong mỗi môi trường nuôi cấy, bao gồm nước, chất khoáng, nguồn
hidrocacbon và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Tất cả các thành phần này đều
có vai trò cực kì quan trọng, tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh
trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro [23].
1.5.1. Các chất khoáng
Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng. Chúng là thành
phần cấu tạo nên cấu trúc tế bào, chẳng hạn như Mg là một phần của phân tử diệp lục,
thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng không cấn thiết cho sự tăng
trưởng của tế bào nhiều loài thực vật. Acid nicotinic thường được sử dụng với nồng
độ 0,1-5 mg/l, và pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1-10 mg/l. Myo-inositol mặc
dù có bản chất là một carbohydrate nhưng có vai trò quan trọng, kích thích cho sự tăng
trưởng của tế bào đa số loài thực vật. Myo-inositol được phân tách ra thành acid
ascorbic và peptine và được đồng hóa thành phosphoinositide và phosphatidylinositol
có vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào. Myo-inositol thường được sử dụng
trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ 50-5000 mg/l. Một số
vitamin, đặc biệt là nicotinic axit (vitamin B3), canxi pantothenate (vitamin B5) và
biotin thường xuyên được sử dụng để nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cấy.Các
vitamin khác như acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocopherol),
riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi
cấy khi nồng độ thiamin thấp và có vai trò kích thích sự sinh trưởng của thực vật trong
giai đoạn khởi đầu nuôi cấy [12], [60].
Copyright: Tài liệu đại học ©