ĐẶT VẤN ĐỀ
Acid shikimic từ lâu được biết đến là một hợp chất trung gian quan trọng
trong quá trình sinh tổng hợp một số acid amin thơm như phenylalanine,
tyrosin, tryptophan; và một số hợp chất alcaloid. Acid shikimic có thể được
phân lập từ vi khuẩn như E. coli hay từ một số loài thực vật.
Trong những năm gần đây, acid shikimic còn được biết đến với vai trò quan
trọng mới, nó là nguyên liệu dùng để tổng hợp osletamivir – hoạt chất chính
của Tamiflu, thuốc có tác dụng điều trị bệnh cúm gia cầm H
5
N
1
. Hiện nay, acid
shikimic dùng để tổng hợp Tamiflu được chiết xuất chủ yếu từ quả của cây
Hồi - đây là nguồn cung cấp nguyên liệu chủ yếu cho sản xuất thuốc phòng
chống cúm gia cầm.
Tuy nhiên, Hồi không phải là loại cây dễ trồng, và phải đợi khoảng 5-7
năm mới có thể thu hoạch quả được, và phải hơn 10 năm mới cho thu hoạch ổn
định. Hơn nữa, cây Hồi là cây có vùng phát triển hẹp, cây thích nghi vùng đồi
núi thấp, nhiệt độ trung bình 21-23
0
C; lượng mưa hàng năm vào khoảng 1450-
1600mm. Như vậy, nếu chỉ trông chờ vào cây Hồi thì sẽ không đáp ứng được
nhu cầu về nguyên liệu acid shikimic, việc tìm ra các nguồn dược liệu khác có
chứa acid shikimic là rất quan trọng.
Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Góp phần nghiên cứu sàng lọc acid
shikimic trong một số cây thuốc ở Việt Nam” nhằm mở rộng nguồn dược liệu
có chứa acid shikimic.
Đề tài gồm các nội dung sau :
1. Định tính acid shikimic trong một số dược liệu bằng SKLM.
2. Định lượng hàm lượng acid shikimic trong các dược liệu bằng HPLC.
3. Xây dựng quy trình chiết tách và tinh chế acid shikimic từ dược liệu có

trên SKG. Tuy nhiên các thuốc thử trong phương pháp này không đặc
2
hiệu cho SA, một số acid hữu cơ khác như acid quinic cũng cho màu
tương tự [27].
- Phương pháp SKLM: được sử dụng để định tính SA từ những năm 1960
[27]. Sử dụng hệ dung môi thích hợp để chấm sắc ký so sánh chất thử
với SA chuẩn. Một mẫu có SA dương tính nếu có vết cùng R
f
và cùng
màu sau khi phun thuốc thử với SA chuẩn.
- Phương pháp HPLC: gần đây HPLC là phương pháp phổ biến để định
lượng các chất trong đó có SA [10], [20], [23].
* Phương pháp định lượng acid shikimic
Có nhiều phương pháp được áp dụng để định lượng acid shikimic như:
- Phương pháp HPLC với detector UV: phương pháp này được áp dụng dựa
vào việc xác định đường chuẩn của SA chuẩn, phát hiện SA ở bước sóng
210nm [20], [23], [24].
- Phương pháp sắc ký khí lỏng (GLC): phương pháp này được tiến hành
bằng cách tạo dẫn xuất trimethylsilyl. Sử dụng cafein làm chất chuẩn nội,
cột IO và 200 mesh gas – chrom Q với detector FID, nhiệt độ buồng tiêm
mẫu và buồng cột lần lượt là 210 và 185
0
C [18], [19].
- Phương pháp chuẩn độ: SA sau khi được tách cột Dowex-1x 8 column,
chuẩn độ bằng NaOH loãng [16], [25].
1.1.3. Vai trò và tác dụng
* Vai trò
Acid shikimic đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp của
nhiều hợp chất thiên nhiên như các acid amin thơm như phenylalanin,
tryptophan và tyrosin, và các alcaloid, các hợp chất phenolic, các phenyl

được xác định[32]. Sau đó, acid shikimic cũng được tìm thấy và được phân lập
từ nhiều cây khác như Hồi (Illicium verum Hook.f.), Canh-ki-na (Cinchona
spp.), Kha tử (Terminalia chebula), Chuối tiêu (Musa sapientum), Hướng
4
dương (Heliantuns annuus), Bạch quả (Ginko biloba), Tiểu hồi (Foeniculum
vulgare), Liquidambar styraciflua…[32], [26].
Hiện nay, phần lớn acid shikimic để sản xuất Tamiflu vẫn chủ yếu được
chiết xuất từ quả Hồi. Tuy nhiên, phải mất 5-7 năm sau khi trồng cây mới bắt
đầu cho thu hoạch quả được, và phải hơn 10 năm mới bắt đầu cho thu hoạch
ổn định. Hơn nữa, cây Hồi là cây có vùng phát triển hẹp, cây thích nghi vùng
đồi núi thấp, nhiệt độ trung bình 21-23
0
C; lượng mưa hàng năm vào khoảng
1450-1600mm. Cây được trồng trên loại đất feralit đỏ vàng, mới được khai
phá, có pH 4-5,5 [2]. Như vậy, nếu chỉ trông chờ vào cây Hồi thì sẽ không đáp
ứng được nhu cầu về nguyên liệu acid shikimic, việc tìm ra các nguồn dược
liệu khác có chứa acid shikimic là rất quan trọng.
Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát acid shikimic trên
các cây sau : một số loài Hồi, Cỏ ngọt, Bụp giấm, Dây thìa canh, Bồ công anh,
Ban tròn.
1.2.1. Đại Hồi (Illicium. verum Hook.f. Illiaceae )
* Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái
Đại Hồi còn gọi là Bát giác hồi hương, Hồi hương, Hồi sao, Mác chác, Mác
Hồi (Tày), Pit cóc (Dao) [2].
Là cây gỗ nhỏ, cao 6-8m, có thể đến 10m hay hơn. Cây có nhiều ở miền
Nam Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, đây là hai khu vực cung cấp nguồn
nguyên liệu và tinh dầu Hồi chủ yếu cho thế giới.
Ở Việt Nam, cây Hồi có nhiều ở Lạng Sơn, Cao Bằng. Gần đây phát triển
rộng ra Quảng Ninh, Bắc Kạn, Lai Châu và Hà Giang [1,2]. Cây thích nghi
vùng đồi núi thấp, nhiệt độ trung bình 21-23

mỏng.
6
Hồi lá nhỏ có tên khoa học là I. parviflorum, hiện nay mới chỉ thấy phân bố
ở Bạch Mã (TT Huế), Bà Nà ( Đà Nẵng). Trong đề tài này chúng tôi gọi tên
mẫu là Hồi Bạch Mã và Hồi Bà Nà.
Hồi lá mỏng có tên khoa học là I. tenuifolum, phân bố ở Nghệ An, Gia Lai,
Lâm Đồng, Khánh Hòa. Mẫu được sử dụng trong đề tài được lấy từ Pù Mát –
Nghệ An, nên gọi tên là Hồi Pù Mát.

1.2.3. Bụp giấm
Bụp giấm còn được gọi là Cây giấm, đay Nhật; tên khoa học là Hibiscus
sabdariffa L. họ Bông Malvaceae.
* Mô tả, phân bố, sinh thái
Bụp giấm là cây bụi, cao 1 – 2 m, sống nhiều năm, nhưng trong sản xuất
người ta chỉ trồng một năm rồi phá đi trồng lại. Cây dễ trồng, không kén đất,
có khả năng chịu hạn, không chịu úng, được nhân giống bằng hạt và cành.
Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu Á và châu Phi.
Bộ phận dùng là đài hoa, lá và quả. Để chiết xuất SA, người ta sử dụng đài hoa
Bụp giấm [10].
* Thành phần hoá học
Bụp giấm chứa anthocyan, acid hữu cơ, nhựa, đường, alcaloid và một số
thành phần khác.
Các lá đài giàu về acid và protein; các aicd chính tan trong nước là acid citric,
acid malic, acid tartric và acid hisbiscis [2], [4], [5].
Ngoài ra hoa bụp giấm còn chứa acid shikimic với hàm lượng 0,3% [10].
* Công dụng
Lá Bụp giấm có vị chua, dùng làm rau ăn. Đài hoa được dùng làm gia vị thay
giấm, chế nước giải khát, mứt kẹo, siro hoặc đem phơi khô và nấu lấy nước
uống.
7

Hoa nhỏ, màu vàng, xếp thành xim dạng tán ở nách lá, dài 8mm, rộng 12-
15mm, đài có lông mịn; tràng không có lông ở mặt ngoài, tràng phụ là 5 răng
[4].Quả đại dài 5,5cm, rộng ở nửa dưới, hạt dẹp, lông mao dài 3cm.
Hoa tháng 7, quả tháng 8.
Bộ phận dùng là dây, lá được thu hái quanh năm [4].
* Thành phần hóa học
Cây chứa một chất glucosidic là acid gymnetinic rất gần với acid
chrysophanic nhưng khác về một số tính chất.
Lá chứa những hợp chất hữu cơ, 2 hydratcacbon, chlorophyll a và b, phytol,
nhựa, acid tartric, inositol, các hợp chất anthraquinonic và acid gymnemic.
Lá Dây thìa canh có chứa acid shikimic với hàm lượng 6,79% [10].
* Công dụng
Thường dùng trị đái tháo đường. Lá cũng dùng làm thuốc dễ tiêu hóa, còn
dùng tán thành bột để chống độc.
Ở Ấn Độ, người ta dùng đắp lên vết cắn và dùng đắp lên vết cắn và dùng sắc
uống trong để trị rắn độc cắn.
Ở Trung Quốc, người ta thường dùng cả cây bỏ rễ và quả làm thuốc trị
phong thấp tê dại, viêm mạch máu, rắn độc cắn, trĩ và các vết thương do dao,
đạn [4].
1.2.6. Bồ công anh – Trung Quốc
Tên khác là Bồ công anh thấp, tên khoa học là Taraxacum officinale, họ Cúc
Asteraceae.
* Mô tả, phân bố, sinh thái
9
Cây thảo, sống một năm hay nhiều năm, cao 0,2 – 0,4 cm, không có thân [2],
[4], [5]. Phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ấm, á nhiệt đới thuộc châu Âu, châu
Mỹ và châu Á. Được nhập vào Việt Nam từ lâu nhưng đến nay đã trở nên
hoang dại ở một số vùng núi cao 900m trở lên như Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Sa
Pa, Bắc Hà (Lào Cai), Sìn Hồ (Lai Châu), Đà Lạt (Lâm Đồng)…[2].
Cây được nhân giống từ hạt. Sau khi ra hoa quả, cây tàn lại, hạt có túm lông

* Công dụng
Theo dân gian, cây Ban được dùng để chữa viêm gan vàng da, trẻ em lên sởi,
vết thương sưng đau, mụn nhọt, sâu răng, hôi mồm, ho, có nơi dùng chữa rắn
cắn.
Ở Trung Quốc còn dùng để chữa viêm gan cấp hoặc mãn, viêm ruột thừa,
viêm amidan, cam tích ở trẻ em.
Trong số các dược liệu trên, hiện nay ở Việt Nam mới chỉ có các nghiên cứu
về acid shikimic trên các loài Đại Hồi (Illicium verum), những loài Hồi khác
và dược liệu còn lại đang được bước đầu nghiên cứu trên thế giới. Chính vì
vậy chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mở rộng nguồn nguyên liệu cho acid
shikimic.
11
PHẦN II:
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu :
- Lá các mẫu Hồi được thu hái tại Bà Nà (Đà Nẵng), Bạch Mã (Thừa Thiên
Huế), Pù Mát (Nghệ An) vào tháng 8/2009; hiện đang được lưu mẫu tại khoa
Tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu.
- Đài hoa Bụp giấm, được thu hái tại Bắc Giang và được lưu giữ tại khoa Phân
tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu.
- Lá Cỏ ngọt, Ban tròn lấy tại nơi lưu mẫu dược liệu chuẩn của khoa Phân tích,
Viện Dược liệu.
- Lá Dây thìa canh do Thạc sĩ Ngô Quốc Luật, trung tâm cây thuốc Hà Nội
cung cấp.
2.2. Dụng cụ và hóa chất :
* Dụng cụ :
- Sinh hàn đối lưu.
- Bản mỏng tráng Silicagel GF 254 (Merk).
- Máy cất quay “Buchi”.
- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến “Carry 1E”.

* Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn mẹ acid shikimic (Sigma) có nồng
độ 0,4mg/ml. Từ dung dịch này pha loãng để được các dung dịch chuẩn có
nồng độ thích hợp.
13
* Dung dịch thử:
Cân chính xác 2g (chính xác đến 0,0001g) dược liệu đó nghiền nhỏ cho vào
túi giấy lọc. Chiết dược liệu bằng bộ dụng cụ shoxhlet với 200 ml ethanol phân
tích 85% đến hết acid shikimic. Thu hồi dung môi đến cạn. Hòa tan cắn thu
được vào khoảng 30ml nước cất. Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 20
phút.
Lọc lấy dịch, rửa giấy lọc bằng 5ml nước cất. Gộp dịch lọc và dịch rửa, thêm
nước cất vừa đủ bình định mức 50ml (ddA). Pha loãng ddA 50 lần với dung
môi pha động, lọc qua màng lọc Supelco trước khi tiêm mẫu.
2.3.2.3. Khảo sát phương pháp định lượng acid shikimic
Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Được xác định từ 6 lần tiêm
lặp lại của dung dịch chuẩn có nồng độ SA thích hợp, ghi lại các giá trị về thời
gian lưu, diện tích pic, độ cân xứng của pic, số đĩa lý thuyết của cột. Xử lý
thống kê các số liệu thu được để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp: Khảo sát sự phụ thuộc
tuyến tính của diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng bằng cách pha các
dung dịch acid shikimic chuẩn có nồng độ thích hợp. Xây dựng đường chuẩn
hồi quy: y = ax + b. Trong đó x là diện tích pic (mAU.s), y là nồng độ của
dung dịch tiêm (µg), a và b là các hệ số thực nghiệm. Đánh giá đường chuẩn
thông qua hệ số tương quan r.
Khảo sát độ lặp lại của phương pháp: Độ lặp lại của phương pháp được
đánh giá dựa trên độ lặp lại của 6 phép đo riêng biệt thông qua độ lệch chuẩn
tương đối RSD (Relative Standard Deviation).
Khảo sát độ đúng của phương pháp: Độ đúng của phương pháp được
đánh giá bằng phương pháp thêm chuẩn.
14

3.1.2. Tiến hành chấm SKLM
* Sắc ký lớp mỏng pha thuận
- Chuẩn bị bản mỏng :
Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F
254
(Merck), hoạt hóa ở 110
0
C trong 1h.
-Các hệ dung môi khai triển:
Hệ I: HCOOH – MeOH – EtAc (1- 9- 11)
Hệ II: HCOOH – MeOH – CHCl
3
(1- 9- 11)
Hệ III: Propanol – EtAc – CH
3
COOH – H
2
O (4 – 3 – 1 – 2)
Hệ IV: n-BuOH - CH
3
COOH – H
2
O (5 – 1 – 4)
- Thuốc thử hiện màu:
Bản mỏng sau khi chạy được phun với H
2
SO
4
10% sau đó đem đốt nóng ở
120

Lambda max : 212 655 292 299 307
Lambda min : 287 291 297 306 310
Hình 3: Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết Dây thìa canh
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
0 100 200 300 400 500 600
4.42 7858868
5.00 1136259
6.03 484860
6.67 294329
7.03 690806
8.19 382651
9.88 988519
10.73 329586
11.42 308062
12.12 256102
13.16 282812
16.17 246276
1: 210 nm, 8 nm
Acid shikimic - DTC
SL_A Shikimic_DTC (20mg-ml) -5uL- 150510 - 001.dat
Retention Time
Area
Spectrum at time 4.44 min.
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360
4.44 min
Lambda max : 212 655 298 304 307
Lambda min : 297 302 306 319 309

19
Số liệu thống kê Phương trình hồi quy: y = 2.10
-5
x – 0,7382
Bình phương hệ số tương quan: r
2
= 0,9949
Nhận xét:
Các số liệu thống kê thu được cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự
phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và lượng chất cần định lượng
vời đương chuẩn hồi quy: y = 2.10
-5
x – 0,7382 và bình phương hệ số tương
quan r
2
= 0,9949.
Hình 5: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng
độ acid shikimic
* Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua 5 lần định lượng hàm lượng SA
của mẫu quả Hồi với các điều kiện HPLC đã chọn ở mục 2.3.2.1. Kết quả
được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3: Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
STT Diện tích pic (mAUs) Hàm lượng acid shikimic (%) Số liệu thống kê
1 2201379 5,53
M = 5,595
n = 5
RSD = 0,02%
2 2219183 5,58
3 2193352 5,51

Nhận xét:
Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp định lượng SA có độ đúng cao, thể
hiện ở độ lệch chuẩn tương đối nhỏ RSD = 0,001% (<5%).
* Xác định giới hạn định lượng của phương pháp
21
Pha loãng dần dung dịch chuẩn và tiến hành sắc ký theo các điều kiện HPLC
đã chọn ở mục 2.3.2.1. Kết quả khảo sát cho thấy, dung dịch SA có nồng độ
2,0µg/ml có pic SA với chiều cao lớn hơn 10 lần nhiễu đường nền. Như vậy
giới hạn định lượng là 2,0µg/ml.
 Như vậy:
Các kết quả khảo sát về tính thích hợp của hệ thống sắc ký, khoảng tuyến
tính, độ lặp lại, độ đúng và giới hạn định lượng của phương pháp định lượng
SA bằng HPLC cho thấy có thể áp dụng phương pháp này để định lượng SA
trong các mẫu dược liệu đem sàng lọc.
3.2.2. Định lượng acid shikimic trong các mẫu dược liệu
Các mẫu dược liệu nghiên cứu được xác định hàm lượng SA bằng phương
pháp HPLC với các điều kiện đã chọn.
Sắc ký đồ HPLC thu được của dung dịch chuẩn, dung dịch thử được thể hiện ở
hình 6 và hình 7.
Hình 6: Sắc ký đồ HPLC của dung dịch acid chuẩn
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
0 200 400 600 800 1000
4.35 100.00
1: 210 nm, 8 nm
ACID SHIKIMIC Sigma
Shikimic acid Std 0,54mg-ml -5uL- 030210-001.dat
Retention Time
Area Percent

đường chuẩn hồi quy.
Hàm lượng SA trong dược liệu được tính theo công thức sau:
X (%) =
m
Ci25,0
Trong đó:
Ci: Nồng độ SA của dung dịch thử (µg/ml)
m: Khối lượng dược liệu chiết định lượng SA đã trừ độ ẩm.
23
Chúng tôi đã tiến hành định lượng hàm lượng SA trong mẫu trong các dược
liệu đã chuẩn bị, kết quả được trình bày trong bảng 3.5:
Bảng 5: Hàm lượng SA trong các dược liệu khảo sát
STT Dược liệu
Diện tích pic
(mAUs)
Hàm ẩm
(%)
Hàm lượng
SA/dược liệu (%)
1 Lá Hồi Bạch Mã 5533460 12,21 2,48
2 Lá Hồi Bà Nà 6300923 11,70 2.51
3 Lá Hồi Pù Mát 8876018 13,60 3,19
4 Lá Ban tròn 4011041 7,15 3,34
5 Lá Bồ công anh TQ 2869136 6,12 0,79
6 đài Bụp giấm 796317 7,19 0,11
7 Cỏ ngọt 1660857 11,25 0,16
8 Dây thìa canh 1574983 18,24 0,68
Nhận xét:
Chúng tôi đã định lượng acid shikimic trong 8 mẫu dược liệu: 3 mẫu Hồi,
Ban tròn, Bồ công anh, Bụp giấm, Cỏ ngọt, Dây thìa canh. Kết quả định lượng

ký đồ sau.
Hình 8 : Sắc ký đồ HPLC của SA chuẩn
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
0 200 400 600 800 1000
4.35 100.00
1: 210 nm, 8 nm
ACID SHIKIMIC Sigma
Shikimic acid Std 0,54mg-ml -5uL- 030210-001.dat
Retention Time
Area Percent
Hình 9: Săc ký đồ HPLC của sản phẩm thu được
25