BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG
TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA
NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH
TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG
TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA
NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH
TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH

Sinh viên

Đoàn Quốc Phương
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Cây Sen 2
1.1.1. Cây sen 2
1.1.2. Chiết xuất alkaloid trong lá sen 3
1.1.3. Phương pháp tách alkaloid dưới dạng tinh khiết 4
1.2. Hợp chất nuciferin. 4
1.2.1. Công thức, tính chất 4
1.2.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dược liệu 5
1.2.3. Tác dụng dược lý. 5
1.3. Tổng quan về các phương pháp tạo N-oxid 7
1.3.1. Sử dụng tác nhân oxy hóa. 7
1.3.2. Sử dụng tác nhân alkyl halogenid tác dụng với hydroxylamine. 10
1.3.3. Sử dụng phản ứng loại Cope. 10
1.3.4. Phân tích lựa chọn phương pháp tạo N-oxid của nuciferin. 10
1.4. Các phương pháp N-demethyl hóa. 11
1.4.1. Khử hóa N-oxid 11
1.4.2. Sử dụng K
3
Fe(CN)
6
. 12
1.4.3. Sử dụng gốc phthalimide-N-oxyl 12

2
O 25
3.3. Kết quả xác định cấu trúc 26
3.3.1. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng oxy hóa (nuciferin N-oxid) 26
3.3.2. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng khử hóa (nuciferin) 28
3.3.3. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng demethyl hóa (nornuciferin) 29
3.4. Thử tác dụng sinh học 31
3.5. BÀN LUẬN 32
3.5.1. Về quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin 32
3.5.2. Về các phản ứng bán tổng hợp. 33
3.6.3. Về phần xác định cấu trúc 35
3.6.4. Về phần thử hoạt tính sinh học 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
1
H-NMR
Phổ cộng hưng từ hạt nhân proton
(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)
AcOEt
Ethyl acetat
AcOH
Acid acetic
ATCC

American Type Culture Collection
CTCT
Công thức cấu tạo
ESI-MS

MeCN
Acetonitril
MeOH
Methanol
MTO
Methyltrioxorheni
MTT
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid
NaOMe
Natri methanolat
NPB
Natri perborate tetrahydrat
NPC
Natri percarbonat
RANKL
Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand
R
f

Hệ số lưu giữ (retension factor)
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
TBHP
tert-butyl hydroperoxid
t-BuOH
tert-butanol
t
o
nc


Bảng 3.4.
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin N-oxid ….…………
26
Bảng 3.5.
Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của nuciferin N-
oxid …………………………………………………………………
27
Bảng 3.6.
Kết quả phân tích phổ cộng hưng từ hạt nhân proton của nuciferin
N-oxid (
1
H-NMR, 500MHz, CDCl
3
)…………………………………
27
Bảng 3.7.
Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của nuciferin
28
Bảng 3.8.
Kết quả phân tích phổ cộng hưng từ hạt nhân proton của nuciferin
(
1
H-NMR, 500MHz CDCl
3
)………… ……………………………
28
Bảng 3.9.
Kết quả phân tích phổ cộng hưng từ hạt nhân carbon 13 của
nuciferin (
13

Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tạo codein N-oxid bằng cách sử dụng H
2
O
2
30%
8
Hình 1.5. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng m-CPBA………………
8
Hình 1.6: Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPB…………………
8
Hình 1.7: Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng UHP…………………
9
Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPC…………………
9
Hình 1.9. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng ozon…………………
9
Hình 1.10. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng alkyl halogenid………
10
Hình 1.11. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng phản ứng loại Cope………………
10
Hình 1.12. Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid bằng H
2
O
2…………………………………
11
Hình 1.13. Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng FeSO
4
.7H
2
O


Hình 3.3. Sơ đồ khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl.
Hình 3.4. Sơ đồ khử nuciferin N-oxid bằng FeSO
4
.7H
2
O.
24
25
Hình 3.5. Cơ chế phản ứng oxy hóa tạo N-oxid
33
Hình 3.6. Cơ chế phản ứng khử N-oxid bằng FeSO
4
.7H
2
O
34
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam có một hệ sinh thái đa dạng và phong phú một tiềm năng lớn về tài
nguyên dược liệu (thực vật, động vật, khoáng vật) nói chung và tài nguyên cây dược
liệu nói riêng. Nước ta đã biết có 12000 loài thực vật có mạch. Trong đó có trên 4000
loài cây thuốc, vùng phân bố rộng khắp cả nước [7].
Trong rất nhiều loại dược liệu được sử dụng để chữa bệnh, Sen là một loài rất
phổ biến  Việt Nam. Sen tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen –
Nelumbonaceae. Ngó sen có tác dụng cầm máu, hạt sen là thuốc bổ, chữa di tinh, mất
ngủ, suy nhược thần kinh. Gương sen, lá sen có tác dụng chữa huyết ứ, băng huyết,
tiểu tiện ra máu [4].
Trong cây sen, các alkaloid chiếm tới 0,7-0,8%, với nuciferin là alkaloid chính.

ngó sen hay ngẫu tiết, ăn được. Lá
(liên diệp) mọc lên khỏi mặt nước, có cuống lá dài, có gai nhỏ, phiến lá hình khiên,
to, đường kính 60-70 cm có gân tỏa tròn. Hoa to màu trắng hay đỏ hồng, đều lưỡng
tính. Quả (thường gọi là hạt sen) chứa một hạt (liên nhục) không có nội nhũ. Hai lá
mầm dày. Chồi mầm (liên tâm) gồm 4 lá non gập vào phía trong. Sen được trông
nhiều  nhiều nơi nước ta để ăn và làm thuốc. Mùa thu hái vào các tháng 7-9 [4].
Thành phần hóa học: Lá sen có chứa alcaloid (0,77 – 0,84%), trong đó có
nuciferin, nor-nuciferin, roemerin, anonain, liriodenin, pronuciferin, O-norciferin,
armepavin, N-nor-armepavin, methyl-corlaurin, nepherin, dehydroemerin,
dehydronuciferin, dehydroanonain, N-methylisocorlaurin. Trong đó nuciferin là
alcaloid chính. Ngoài ra trong lá sen còn có flavonoid, tanin, acid hữu cơ. Trong tâm
sen có nhiều alcaloid (0,85 – 0,96%), trong đó có liensinin, isoliensinin, neferin,
lotusin, nuciferin, pronuciferin, methylcorypallin, demetylcorlaurin (xem Bảng 1.1)
[3,9].
Công dụng: Alcaloid toàn phần trong lá sen có tác dụng an thần, hạ huyết áp
nhẹ. Lá sen được dng để sắc uống chữa mất ngủ với liều 15 – 20 g/ngày. Lá sen kết
hợp với một số dược liệu khác làm thuốc an thần. Tâm sen chữa mất ngủ, an thần, di
mộng tinh. Ngày dùng 4 – 10 g dưới dạng thuốc hãm hay sắc uống [3,9].
Hình 1.1. Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)
3 1.1.2. Chiết xuất alkaloid trong lá sen
1.1.2.1. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước
acid hoặc cồn (EtOH, MeOH).
 Tiến hành
Bột dược liệu được làm ẩm bằng NH
4
OH 10% sau đó chiết bằng cồn 70
o

R1
R2
R3

Nuciferin
CH
3

CH
3

CH
3

N – nor – Nuciferin
CH
3

CH
3

H
O – nor – Nuciferin
H
CH
3

CH
3


1.2. Hợp chất nuciferin.
1.2.1. Công thức, tính chất
- Công thức phân tử: C
19
H
21
NO
2
.
- Khối lượng phân tử: 295,2.
- Danh pháp: 5,5a,7,8-tetrahydro-1,2-dimethoxy-6-
methyldiabenzoquinolin (IUPAC) [4,5]; hoặc 1,2-
dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H-
dibenzo[de,g]quinolin; 1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-
tetrahydro-4H-dibenzo[de,g]quinolin; (+-)-1,2-dimethoxy-6-
methyl-aporphin; 1,2-dimethoxy-6-methyl-aporphin [13].
- Tính chất lí – hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình
khối, màu vàng nhạt, không mùi, không vị, tan tốt trong CHCl
3
, MeOH, EtOH nóng,
Hình 1.2. Công thức
cấu tạo của nuciferin
5

hầu như không tan trong nước, nhiệt độ nóng chảy 164 - 165
o
C, phổ UV (đo trong
MeOH) cho λ
max
tại bước sóng 210 nm, 228 nm, 270 nm [4,5].

- Phân lập và tinh chế: Sử dụng phương pháp kết tinh lại trong cồn nóng thu được
tinh thể màu trắng ánh xanh nhạt [1].
1.2.3. Tác dụng dược lý.
Tác dụng dược lý của dịch chiết sen và của nuciferin
Với y học cổ truyền, người ta sử dụng các bộ phận của cây sen trong những
bài thuốc khác nhau dùng để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau, ngày nay khoa học
đã chứng minh được nhiều tác dụng của những bài thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ
các alkaloid có trong sen (nuciferin là alkaloid chính) cũng như tìm ra nhiều tác dụng
mới của sen.
- Tác dụng chống ung thư:
 Nghiên cứu thấy rằng nuciferin ức chế sự hoạt hóa thụ thể của yếu tố nhân
ligand kappa-B (RANKL) – yếu tố này hình thành tế bào hủy xương trong các tế bào
đại thực bào tủy xương chuột. Ngoài ra, nuciferin tăng sinh tế bào ức chế và apoptosis
cảm ứng trong tế bào MDA-MB-231 ung thư vú  người. Hơn nữa, nuciferin có thể
điều chỉnh phân phối chu kỳ tế bào và biểu hiện của các protein liên quan đến quá
trình apoptosis trong tế bào MDA-MB-231 và ức chế ung thư vú từ đó ức chế sự tiêu
xương trong cơ thể. Vì vậy, nuciferin có thể có tiềm năng để ngăn chặn ung thư vú
[19].
 Nghiên cứu đã xem xét các hoạt động gia tăng của hợp chất cô lập, chất này
có tác dụng chống lại khối u ác tính của con người, tuyến tiền liệt và các tế bào ung
6

thư dạ dày. Kết quả chỉ ra rằng 7- hydroxydehydronuciferine ức chế đáng kể sự phát
triển của khối u ác tính, tuyến tiền liệt và các tế bào ung thư dạ dày [22].
- Tác dụng chống oxy hóa: 15 hợp chất được chiết xuất và tinh chế từ lá của Nelumbo
nucifera Gaertn. Các hoạt động chống oxy hóa của các hợp chất đã được xem xét
bằng cách dọn dẹp gốc tự do, phức kim loại và khử sắt III. Các kết quả đã cho thấy
các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa. Phát hiện này cho thấy rằng lá của Nelumbo
nucifera Gaertn. cv. Rosa-Plena là một tiềm năng để đạt được các hoạt chất sinh học
có đặc tính chống oxy hóa [22].

cứu này cho thấy rằng các thành phần trên giết hoặc giảm sự chuyển động chủ động
của H. nana [21].
- Tác dụng chống sốt rét và kháng nấm của một số alkaloid được chiết được từ lá
sen đã được thử nghiệm. Kết quả cho thấy trong số các alkaloid đã được thử nghiệm
thì một vài alkaloid có tác dụng chống sốt rét hoặc chống nấm. Tuy nuciferin không
có tác dụng này, nhưng người ta phát hiện ra một mối liên hệ cấu trúc và tác dụng có
liên quan mật thiết với nhóm thế  vị trí C1 và C2 trên vòng aporphin (xem Hình 1.3)
. Đây được coi là một hướng nghiên cứu mới với việc gắn nhóm thế vào 2 vị trí này
 nuciferin [11].
- Kích thích tiết insulin: Nuciferin chiết từ lá sen có tác dụng kích thích tiết insulin
in vitro tốt hơn Glyburid. Cơ chế kích thích tiết insulin bằng cách đóng các kênh K
+
- ATPase , giải thích tác dụng chống bệnh tiểu đường của Nelumbo nucifera [25, 26].
Có thể kết luận sen và các hoạt chất có trong sen, đặc biệt là các alkaloid với
nuciferin là thành phần chính có thể có rất nhiều tác dụng sinh học, tác dụng tốt với
nhiều bệnh mà hiện con người vẫn còn đang trong quá trình nghiên cứu và chưa tìm
ra phương pháp chữa hiệu quả, sen và các alkaloid trong sen có một giá trị tiềm năng
lớn về mặt khoa học trong tương lai.
1.3. Tổng quan về các phương pháp tạo N-oxid
1.3.1. Sử dụng tác nhân oxy hóa.
1.3.1.1. Sử dụng tác nhân H
2
O
2
.
Điều kiện phản ứng: codein được hòa tan trong MeOH, làm lạnh về 0
o
C thêm
H
2

isonicotinonitril N-oxid với hiệu suất 81% (Xem Hình 1.6) [24].

Hình 1.5. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng m-CPBA

Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tạo codein N-oxid bằng cách sử dụng H
2
O
2
30%
Hình 1.6. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPB 9

1.3.1.4. Sử dụng Urea−Hydrogen Peroxid.
Điều kiện phản ứng: pyridin được thêm UHP, đưa nhiệt độ hỗn hợp phản ứng
lên 85
o
C trong 45 phút. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được pyridin N-oxid với hiệu
suất 85% (xem Hình 1.7) [36].

1.3.1.5. Sử dụng natri percarbonat.
Điều kiện phản ứng: thêm N-ethyl-N-methylanilin thêm xúc tác MTO, NPB,
AcOH, MeCN, sục khí N
2
, đưa nhiệt độ phản ứng lên 50
o
C trong 1h. Xử lý hỗn hợp
phản ứng thu được N-ethyl-N-methylanilin N-oxid với hiệu suất 94% (xem Hình
1.8) [18].


1.3.3. Sử dụng phản ứng loại Cope.

Điều kiện phản ứng: Hòa tan 1,(2S)-oxiranyl-prop-2-en-(1R)-ol trong MeOH,
thêm N-benzylhydroxylamin.HCl và NaOMe. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được 1-
benzyl-(2S)methyl-(1S)-N-oxy-pyrrolidin-(3R),(4S)-diol với hiệu suất 72% (xem
Hình 1.11) [27] .
1.3.4. Phân tích lựa chọn phương pháp tạo N-oxid của nuciferin.
Ở khóa luận này chúng tôi sử dụng tác nhân H
2
O
2
để oxy hóa nuciferin tạo sản
phẩm nuciferin N-oxid bi vì tác nhân H
2
O
2
rẻ tiền và dễ kiếm, thường có hầu hết 
các phòng tổng hợp hóa dược.
Hình 1.10. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng alkyl halogenid

Hình 1.11. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng phản ứng loại Cope
11

Điều kiện phản ứng: nuciferin được hòa tan trong MeOH thêm H
2
O

2

Hình 1.13. Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng FeSO
4
.7H
2
O

12 1.4.1.3 Sử dụng CuCl

Điều kiện phản ứng: N,N-dimethylanilin hòa tan trong t-BuOH. Thêm vào hỗn
hợp phản ứng CuCl và TBHP. Đưa hỗn hợp phản ứng lên 35
o
C trong 6h. Xử lý hỗn
hợp phản ứng thu được N-methylanilin với hiệu suất 64% (xem Hình 1.15) [32].
1.4.2. Sử dụng K
3
Fe(CN)
6
.
Điều kiện phản ứng: 3-dimethylaminocyclohexanol thêm nước, thêm
K
3
Fe(CN)
6
và KOH trong điều kiện nhiệt độ <5
o


1.4.4. Sử dụng este cloroformat
Điều kiện phản ứng:Khuấy hỗn hợp gồm morphin, KHCO
3
trong CHCl
3
.
Thêm phenyl cloroformat, đun hồi lưu trong 60h. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được
N-Carbophenoxynormorphin với hiệu suất 91%. N-Carbophenoxynormorphin được
hòa tan trong C
2
H
5
OH, KOH sục khí N
2
đun hồi lưu trong 24h. Xử lý hỗn hợp phản
ứng thu được normorphin với hiệu suất 43,5% (xem Hình 1.18) [10].

1.5. Lựa chọn hướng nghiên cứu.
- Với một số hoạt tính đã được nghiên cứu của các amin N-oxid như tác dụng
chống ung thư [17], kháng khuẩn [34], ức chế cytochrome P450 [35]. Vì vậy chúng
tôi oxy hóa nuciferin tạo thành nuciferin N-oxid.
- Tổng hợp các hợp chất tương tự tác nhân alkyl hóa như melphalan, clorambucil,
cyclophosphamid đã sử dụng làm thuốc ung thư. Chúng tôi dự định chọn hướng N-
demethyl hóa nuciferin sau đó đưa nhóm alkyl vào nguyên tử N. Đó là tiềm năng về
tổng hợp thuốc mới có tác dụng chống ung thư.

Hình 1.19. Sơ đồ định hướng tổng hợp dẫn chất N-demethyl hóa của nuciferin
hướng chống ung thư
Hình 1.17. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng gốc phthalimide-N-oxyl

Trung Quốc
3
Bản mỏng Silica gel 60 F254
Merck – Đức
4
Cloroform
Trung Quốc
5
Dầu hỏa
Việt Nam
6
EtOH
Việt Nam
7
FeSO
4
.7H
2
O
Trung Quốc
8
Hydro cloric
Trung Quốc
9
Hydro peroxid
Trung Quốc
10
i-PrOH
Trung Quốc
11