BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THÙY NGÂN

TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA PHỨC
HỢP LIPID AMPHOTERICIN B KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THÙY NGÂN TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô, các kỹ thuật
viên bộ môn Bào chế và bộ môn Vật lý - Hóa lý - Trường Đại học Dược Hà Nội đã
giúp đỡ và tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận này.
Nhân đây, em cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, các
phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy
bảo em suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã
luôn bên cạnh cổ vũ, cho em chỗ dựa tinh thần vững chắc và là nguồn động lực lớn
lao cho em trong suốt quá trình 5 năm học.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Lê Thị Thùy Ngân

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Amphotericin B. 2
1.1.1.Nguồn gốc. 2
1.1.2. Công thức hóa học. 2
1.1.3. Đặc tính lý hóa 2
1.1.4. Phổ tác dụng và cơ chế tác dụng. 3
1.1.5. Dược động học. 4
1.1.6. Chỉ định 4
1.1.7. Tác dụng không mong muốn. 5
1.1.8. Liều dùng. 5
1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của Amphotericin B trên thị trường. 6
1.2. Phức hợp lipid Amphotericin B. 7

nhiệt vi sai. 29
3.2. Bào chế phức hợp lipid Amphotericin B có tỉ lệ mol AMB bằng 100%/
tổng số mol lipid. 31
3.2.1. Ảnh hưởng của pha nước. 32
3.2.2. Phương pháp hydrat hóa màng film. 33
3.2.3. Phương pháp làm nhỏ kích thước tiểu phân. 35
3.2.4. Độ ổn định về KTTP, phân bố KTTP của mẫu N2 sau siêu âm 3’. 36
3.2.5. Chứng minh công thức N2 là phức hợp lipid bằng phương pháp quét
nhiệt vi sai. 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40
PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT
Viết tắt
Từ/cụm từ đầy đủ
1
AMB
Amphotericin B
2
Dd
Dung dịch
3
DĐVN
Dược điển Việt Nam

Tinh khiết hóa học
14
USP
United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)
15
Z
average
Kích thước tiểu phân trung bình DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 6
Bảng 2.1. Nguyên liệu 16
Bảng 3.1. Thành phần các công thức nhóm thay đổi tỉ lệ dược chất 23
Bảng 3.2. KTTP, phân bố KTTP các công thức nhóm thay đổi tỷ lệ AMB 24
Bảng 3.3. Thành phần các công thức trong nhóm thay đổi pha nước 26
Bảng 3.4. KTTP, phân bố KTTP của nhóm thay đổi pha nước 26
Bảng 3.5. KTTP, phân bố KTTP mẫu A1 sau bào chế và trong quá trình bảo quản
27
Bảng 3.6. Thành phần các công thức trong nhóm thay đổi pha nước 31
Bảng 3.7. KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất nạp mẫu M2 33
Bảng 3.8. KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất nạp mẫu N2 33
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của siêu âm 30s nghỉ 30s đến việc giảm KTTP 34
Bảng 3.10. KTTP, phân bố KTTP mẫu N2 siêu âm 3 phút sau siêu âm và sau bảo
quản 1 tuần 35 ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm nấm xâm lấn là nguyên nhân quan trọng gây bệnh tật và tỷ lệ tử vong ở
bệnh nhân suy giảm miễn dịch (ghép, hóa trị liệu, AIDS). Amphotericin B (AMB)
là một trong các kháng sinh polyen macrolide hiệu quả nhất cho việc điều trị nhiễm
nấm hệ thống và nội tạng trong cơ thể người. Tuy nhiên, do sinh khả dụng đường
uống thấp nên thuốc thường được sử dụng dưới dạng tiêm. Do dạng chế phẩm
Amphotericin B quy ước (chế phẩm Fungfizone) không bền trong hệ tuần hoàn và
nhanh chóng chuyển từ dạng micelle sang dạng lipoprotein gây độc cho tế bào vật
chủ, đặc biệt là độc tính trên thận, mà trong suốt những thập kỉ gần đây các nhà
khoa học đã không ngừng nghiên cứu nhằm phát triển dạng mang thuốc mới có thể
cải thiện các nhược điểm kể trên. Từ đó đã cho ra đời các dạng thuốc có tính ứng
dụng cao như vi nang, vi cầu, liposome, phức hợp lipid… Trong đó phức hợp lipid
là kết quả sự phá vỡ của cấu trúc liposome và tiếp đến là sự tái sắp xếp lại của các
phân tử lipid và dược chất khi được sử dụng ở hàm lượng cao hơn là hệ mang thuốc
có nhiều triển vọng trong giảm độc tính và tăng khả năng mang dược chất.
Trong đề tài nghiên cứu của Dược sĩ Nguyễn Thị Mỹ đã bào chế được phức
hợp lipid chứa AMB có tỷ lệ SPC: DSPG là 7:3 với tổng số mol lipid là 200 µmol;
môi trường phân tán đệm pH 7,4; và 25 mol % AMB/tổng lượng lipid cho hiệu suất
nạp dược chất cao (87,06 %), KTTP là 648,3 nm; phân bố KTTP tương đối đồng
đều (PDI = 0,363). Tuy nhiên nghiên cứu chưa đưa ra phương pháp chứng minh
mẫu sau bào chế là phức hợp lipid. Do đó, để góp phần ứng dụng phức hợp lipid
làm chất mang thuốc và giảm độc tính của thuốc, chúng tôi nghiên cứu đề tài “ Tiếp
tục nghiên cứu bào chế và đánh giá đặc tính của phức hợp lipid Amphotericin
B” nhằm mục tiêu:
+ Xây dựng được công thức và phương pháp bào chế phức hợp lipid
Amphotericin B.
+ Đánh giá được một số đặc tính: kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu
phân và hiệu suất tạo phức hợp lipid của hệ phức hợp lipid Amphotericin B.

a2
= 10 [1].
1.1.3. Đặc tính lý hóa
 Lý tính:
- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng da cam.
3 - Độ tan: không tan trong nước ở pH từ 6 đến 7, tan trong dimethylsulphoxid
(DMSO) 30- 40 mg/ml và propylene glycol, khó tan trong dimethylformamid (2- 4
mg/ml), rất khó tan trong methanol [1].
 Hóa tính:
- Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và
nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất như sau:
+ Tính lưỡng thân: phân tử AMB có một đầu thân dầu, một đầu thân nước.
+ Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrochloric hoặc các
dung dịch kiềm.
+ Dung dịch 0,0005% trong methanol ở vùng sóng từ 300- 450 nm có cực đại
hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm. Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57-
0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với ở 405 nm là 0,87- 0,93 [1].
1.1.4. Phổ tác dụng và cơ chế tác dụng.
 Phổ tác dụng: Amphotericin B là thuốc kháng nấm phổ rộng, có tác dụng
trên nhiều loại nấm bề mặt và nội tạng, như Candida, Cryptococcus, Neoformans,
Aspergillus, Histoplasma, Coccidioid, Blastomyces, Sporothrix. Nồng độ ức chế tối
thiểu với các loại nấm từ 0,03- 1µg/mL [3].
 Cơ chế tác dụng: 4


máu [4].
1.1.6. Chỉ định
- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida
albicans ở miệng và ở đường tiêu hóa.
5 - Tiêm tĩnh mạch AMB dùng để điều trị nhiễm nấm toàn thân nặng do nhiễm
Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidiodesimmitis, Cryptococus,
Hitstoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum.
- Phòng nhiễm nấm cho bệnh nhân sốt kéo dài và giảm bạch cầu trung tính đã
điều trị lâu bằng kháng sinh phổ rộng hoặc điều trị ung thư bằng hóa chất.
- Dạng liposome hoặc phức hợp lipid: chỉ định cho trường hợp điều trị thất bại
bằng AMB thông thường hoặc trong trường hợp AMB có thể gây độc cho thân hoặc
gây suy thận [4].
1.1.7. Tác dụng không mong muốn.
- Phản ứng chung: sốt, rét run, nôn, đau đầu, đau cơ khi mới tiêm truyền.
- Độc với thận: giảm sức lọc cầu thận, hoại tử thận.
- Tác dụng không mong muốn khác: thiếu máu, độc với gan tim, giảm K
+
và
Mg
2+
huyết, đau và viêm tắc tĩnh mạch nơi tiêm [3].
1.1.8. Liều dùng.
Đường tiêm, truyền tĩnh mạch: Thông thường amphotericin được truyền tĩnh
mạch. Trước khi bắt đầu điều trị với bất cứ dạng tiêm tĩnh mạch nào của
amphotericin, phải cho 1 liều test và phải theo dõi người bệnh cẩn thận trong
khoảng 30 phút.
AMB quy ước (Fungizone): Sau khi cho liều test ban đầu (1 mg tiêm truyền

Hàm
lượng
Thành phần
Dạng cấu
trúc
Kttp
(µm)
Dạng
bào
chế
Liều
dùng
1
Fungizone
50 mg
AMB và natri
deoxycholat
Micell
< 0,4
Bột
đông
khô
1 mg/kg/
ngày
2
Abelcet
100
mg/20
ml
DMPC:DMP

mg/kg/
ngày
7 (tỷ lệ mol 1:1)
4
Ambisome
50 mg
HSPC:DSPG:
Chol:AMB
(tỷ lệ mol
2:0,8:1:0,4)
Liposome
0,08
Bột
đông
khô
3 – 5
mg/kg/
ngày

1.2. Phức hợp lipid Amphotericin B.
1.2.1. Khái quát về phức hợp lipid Amphotericin B.
Ngày nay, có nhiều nghiên cứu tạo phức AMB trong các dạng bào chế kết hợp
với lipid (lipid-based formulations) nhằm giảm lượng AMB tự do, từ đó nâng cao
chỉ số điều trị của AMB [14].
Hiện có 3 chế phẩm thương mại khác nhau kết hợp với lipid của AMB trên thị
trường. Chúng khác nhau về hình thái, thành phần, hoạt tính sinh học: AmBisome
(nghiên cứu sản xuất bởi công ty dược phẩm Nexstar) có cấu trúc dạng liposome

1.2.2. Cơ chế hình thành.
Bản chất chính xác của quá trình tương tác giữa AMB với HSPC và DSPG tạo
liposom vẫn chưa được biết rõ ràng nhưng theo bằng chứng từ một báo cáo thí
nghiệm của Fujii và các cộng sự thì khi nồng độ AMB trong lớp kép lipid của
liposom tăng quá một nồng độ tới hạn, thuốc sẽ tồn tại ở trạng thái tập hợp [14]
Phân tử AMB có tính lưỡng thân: một đầu thân nước, một đầu thân dầu. Trong
môi trường nước, khi nồng độ AMB dưới nồng độ tạo micell tới hạn, sự phối hợp
giữa AMB với phospholipid tạo liposom, sự xâm nhập của các monomer AMB vào
lớp lipid của liposom dường như là khó khăn do phần chuỗi polyhydroxy thân nước
trong cấu tạo của phân tử. Do đó các phân tử AMB bị giới hạn ở mặt trung gian
giữa hai màng lipid.
Khi AMB ở nồng độ lớn hơn, AMB có thể chèn vào, gây phá vỡ cấu trúc
màng kép lipid của liposom. AMB sẽ tự kết tụ với nhau, các phân tử lipid được xen
kẽ vào
giữa các phân tử AMB để hình thành cấu trúc phức hợp.
Một mô hình được đưa ra để mô tả tương tác giữa AMB và lipid trong phức
hợp lipid chứa AMB như sau:

10
Hình 1.3. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB. [21]
Sự sắp xếp giữa lipid và AMB này phù hợp với nhiều nghiên cứu đã quan sát
được. Trong phức hợp, đuôi hydrocacrbon thân dầu của lipid gắn với chuỗi polyen
của AMB, gốc phosphat của phân tử lipid hướng về phía gốc amin của phân tử
AMB, hình thành một hình trụ tròn. Các hình trụ nhỏ này xếp cạnh nhau kéo dài
cấu trúc chuỗi. Khó có thể nói chính xác khoảng kích thước độ dài chuỗi này. Độ
dày của phức hợp này bằng một nửa độ dày của màng kép lipid thông thường [13].
1.2.3. Thành phần phospholipid trong phức hợp.

một số tích điện âm (như acid phosphatidic, phosphatidylserin…). Phospholipid tích
điện tạo ra lực đẩy tĩnh điện tạo ra liên kết tĩnh điện với dược chất tích điện. Một số
nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự thay đổi điện tích trên bề mặt liposom cũng như phức
12 hợp lipid có thể làm thay đổi đặc tính dược động học và sự phân bố của liposom,
phức hợp lipid trong cơ thể.
+ Mức độ tinh khiết: hiện các phospholipid dùng bào chế liposom cũng như
bào chế phức hợp lipid được bán sẵn trên thị trường. Tuy nhiên sản phẩm của các
nhà sản xuất khác nhau có mức độ tinh khiết khác nhau. Tùy theo mục đích của
nghiên cứu và sử dụng có thể lựa chọn loại phospholipid thích hợp [6].
1.2.4. Độ ổn định của phức hợp lipid AMB.
Với thành phần cấu tạo chính là phospholipid, phức hợp lipid AMB được coi
là dạng bào chế kém ổn định cả về mặt vật lý, hóa học và sinh học. Sự thay đổi đặc
tính lý hóa của phức hợp lipid AMB có thể xảy ra ngay trong quá trình bào chế
cũng như trong quá trình bảo quản [6].
Về mặt hóa học: sự kém ổn định về mặt hóa học của phức hợp lipid là do quá
trình oxy hóa chuỗi acid béo không no của phân tử phospholipid và quá trình thủy
phân của phospholipid tạo ra các lysophospholipid. Quá trình oxy hóa tăng nhanh
do tác động của các yếu tố: nhiệt độ, ánh sáng, chiếu xạ…[6].
Về mặt vật lý: sự kém ổn định về mặt vật lý của phức hợp lipid AMB có thể là
do sự có mặt của các thành phần tích điện trên bề mặt gây ra hiện tượng kết tụ tiểu
phân trong quá trình bảo quản. Khi sử dụng các phospholipid có nhiệt độ chuyển
pha thấp có thể gây ra hiện tượng chuyển pha (từ gel có cấu trúc bền chặt sang dạng
lỏng liên kết lỏng lẻo) cũng có thể là một yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính vật lý của
phức hợp. Trạng thái vật lý của phức hợp lipid AMB có thể được đánh giá thông
qua các chỉ số: kích thước tiểu phân và thế Zeta [6].
1.2.5. Ưu nhược điểm
1.2.5.1. Ưu điểm

giảm được sự phân bố, xâm nhập của các tác nhân này vào đường máu [16].
Phức hợp lipid của AMB liều đơn giúp cho việc sử dụng thuốc đơn giản hơn,
tránh phải sử dụng nhiều lần. Trong điều trị nấm Candida, việc sử dụng phức hợp
lipid chứa AMB dùng liều đơn cho phép đạt hiệu quả tương đương hoặc tốt hơn so
với sử dụng AMB đa liều thông thường, giảm được nguy cơ xảy ra các tác dụng
không mong muốn do giảm được lượng AMB cần phải sử dụng và giảm được chi
14 phí điều trị so với chi phí khi sử dụng AMB đa liều thông thường với thời gian điều
trị kéo dài [8].
Chi phí điều trị nhiễm nấm với phức hợp lipid chứa AMB thấp hơn so với điều
trị với dạng liposom của AMB [15, 21].
1.2.5.2. Nhược điểm
Đa số phương pháp bào chế phức hợp lipid giống với các phương pháp bào
chế liposom là có sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid, do đó có thể gây tác
động bất lợi đến sức khỏe người sử dụng cũng như môi trường [9].
Phospholipid không bền về mặt hóa học nên tuổi thọ của dạng bào chế phức
hợp lipid ngắn. Các phospholipid sử dụng đa số được chiết từ nguồn nguyên liệu tự
nhiên, do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên liệu. Phospholipid có
thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm của quá trình oxy hóa phospholipid
[22].
1.3. Một số nghiên cứu về phức hợp lipid Amphotericin B.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phức hợp lipid AMB có thể được bào chế bằng
các phương pháp tương tự như các phương pháp bào chế liposom đã được nghiên
cứu [14].
Malika Larabi và các cộng sự đã tiến hành bào chế hệ hỗn dịch của AMB bằng
phương pháp thay đổi dung môi. Trong nghiên cứu, AMB (3,5 mg hòa tan trong 10
ml methanol) được phối hợp với một dung môi hữu cơ có chứa các tỉ lệ khác nhau
của DMPC: DMPG (5 ml methanol) tại 40

độ AMB lớn hơn 50 mol%, các cấu trúc chuỗi tiếp tục xuất hiện, tuy nhiên không
còn liên kết chặt chẽ [14].
Malika Larabi và cộng sự đã sử dụng phương pháp quét nhiệt vi sai (DSC) để
theo dõi những thay đổi trong cấu trúc lớp lipid kép và sự tương tác của AMB với
phospholipid trong công thức phức hợp lipid AMB mà có thành phần giống của
Abelcet [21].
Theo quan sát của Andrew S.Janoff và cộng sự, khi một lượng lớn AMB liên
kết với DMPC: DMPG (7:3) (Abelcet), peak chuyển pha chính của lipid đã bị dãn
rộng ra và enthalpy của quá trình chuyển pha giảm đi [21].
16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu.
- Đối tượng nghiên cứu: phức hợp lipid chứa AMB
- Nguyên liệu:
Bảng 2.1. Nguyên liệu
STT
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
1
Amphotericin B
Trung Quốc
USP
2
Hydrogenated soy
phosphatidylcholin
Lipoid – Đức
NSX

Trung Quốc
TKHH
11
Hydro chlorid
Trung Quốc
TKHH

- Phương tiện nghiên cứu:
 Máy khuấy từ IKA-WERKE (Đức).
 Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern –
Anh).
 Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone 50
kD, diện tích lọc 28 cm
2
(Spectrumlab, Mỹ).
 Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức).
 Bình cầu NS 29/32, dung tích 1000ml (Buchi – Đức).
17  Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H (Hàn Quốc)
 Cân phân tích Satorius BP121S.
 Máy quét nhiệt vi sai.
 Máy đo pH InoLap.
 Máy đo quang UV-VIS U1800 HITACHI (Nhật).
 Cân kỹ thuật Sartorius TE412 (Đức).
 Tủ sấy, tủ lạnh, tủ hút chân không, các dụng cụ thủy tinh…
2.2. Nội dung nghiên cứu.
- Tiếp tục khảo sát quy trình và các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính của phức
hợp lipid AMB.