BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ HỒNG LIÊN KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI
TRƯỜNG LÊN MEN CHỨA ĐẬU TƯƠNG
TỚI KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CỦA
Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân - Giảng viên Bộ môn Công nghiệp Dược, người thầy
đã luôn quan tâm, trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận này.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ths. Kiều Thị Hồng, Ths.
Nguyễn Khắc Tiệp, DS. Lê Ngọc Khánh đã cho tôi nhiều ý kiến đóng góp quý báu
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ
môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã động
viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên
cứu vừa qua.
Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Lê Thị Hồng Liên
1.3.6. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
sinh enzym protease của B. subtilis natto 11
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên liệu và thiết bị sử dụng 13
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng 13
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 13
2.1.3. Môi trường 14
2.1.4. Máy móc và dụng cụ 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung nguồn dinh dưỡng chứa đậu tương
tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 15
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và casein
tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu 16
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto 16
2.3.2. Phương pháp làm sữa đậu nành 16
2.3.3. Phương pháp làm đậu natto 16
2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính các nhóm enzym 17
2.3.5. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm: 18
Chương 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ 19
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcacbon chứa đậu tương tới khả
năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 19
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung sữa đậu nành và bột đậu tới khả
năng sinh enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto 19 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men Bacillus subtilis natto trong môi
trường canh thang có bổ sung sữa đậu nành và bột đậu nành đến khả năng sinh
protease của Bacillus subtilis natto 23
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tổng hợp chứa đậu tương và casein
CMC
Carboxy methyl cellulose
CU
Caseinolytic units
Da, kDa
Dalton, kilo Dalton
FU
Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả
năng phân giải fibrin của chất nghiên cứu
NCBI
National center for Biotechnology
Information (Trung tâm quốc gia về thông
tin công nghệ sinh học)
pI
Điểm đẳng điện của protein
TLPT
Trọng lượng phân tử
t – PA
Tissue plasminogen activator (các tác nhân
hoạt hóa plasminogen ở mô)
VSV
Vi sinh vật
môi trường bổ sung sữa đậu nành, bột đậu và của dịch chiết natto
24
3.3
Đường kính vòng phân giải casein (
casein
) của dịch lên men khi
nuôi cấy B. subtilis natto sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ trong các
môi trường canh thang có bổ sung casein
28
3.4
Đường kính vòng phân giải casein (
casein
) của dịch lên men khi
nuôi cấy B. subtilis natto sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ trong môi
trường canh thang có bổ sung casein 2% và bột đậu nành
31
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ
bổ sung casein
28
3.4
Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải casein của dịch lên
men sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ trong các môi trường bổ sung
casein 2% và bột đậu nành
32
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh liên quan đến tim mạch là nguyên nhân lớn nhất gây tử vong trên
toàn thế giới. Trong năm 2012, khoảng 17,5 triệu người chết vì bệnh tim mạch, chiếm
31% tỉ lệ người tử vong trên toàn cầu [47]. Ở Mỹ, mỗi năm có khoảng 900.000 người
mắc bệnh huyết khối tĩnh mạch, trong đó khoảng 300.000 ca tử vong [26]. Tại thành
phố Hồ Chí Minh, theo thống kê, mỗi năm có khoảng 17.500 nguời bị đột quỵ do tai
biến mạch máu não, trong đó 9.000 người tử vong. Việc ngăn ngừa sự hình thành
huyết khối có vai trò quan trọng để phòng ngừa và điệu trị các bệnh này [16]. Trước
đây, để điều trị bệnh huyết khối người ta sử dụng các chất chống đông như heparin
và coumarin. Bước sang đầu thế kỷ 20, người ta đã phát hiện ra các enzym có khả
năng tiêu fibrin, các enzym hiện nay đang được dùng như streptokinase, urokinase
tuy nhiên các enzym này được dùng chủ yếu trong cấp cứu tai biến và có nhiều tác
dụng phụ [45].
Nattokinase là một protease có khả năng tiêu fibrin mạnh, được phát hiện năm
1980 bởi giáo sư Hiroyuki Sumi có nguồn gốc từ Natto - một món ăn truyền thống từ
Nhật Bản được lên men bằng cách ủ đậu nành nấu chín với Bacillus subtilis natto.
Đặc biệt, nattokinase còn dùng được đường uống để phòng bệnh huyết khối [24],
[43]. Trong điều kiện lên men chìm, B. subtilis natto còn có khả năng sinh nhiều
enzym ngoại bào như protease, amylase, cellulase,…Việc thay đổi môi trường dinh
dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzym của vi khuẩn. Với khả năng
thống của người Nhật. Vi khuẩn có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển rất tốt trên
đậu tương đã nấu chín, chúng cũng phát triển trên các loại ngũ cốc, các nguồn thực
phẩm có nguồn gốc động vật như cá, thịt, tôm, cua,… [23], [37].
1.1.3. Đặc điểm hình thái
B. subtilis natto là trực khuẩn Gram (+), hình que. Nội bào tử hình que có kích
thước dưới 1. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau tạo thành chuỗi.
Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt
hơi nhăn tạo thành lớp mịn, lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào
môi trường thạch [37].
3
Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn của Bacillus subtilis natto [44]
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng
B. subtilis natto là vi sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn
hydratcacbon: đường đơn như glucose, fructose,…; đường đôi như maltose, lactose,
saccharose,…; polysaccharid như tinh bột, Nguồn nitơ cần tiết cho sự phát triển của
vi khuẩn là amino acid và protein. VSV có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic,
arginin,… nhưng không sử dụng được threonin, methionin, tryptophan, phenylalanin.
VSV cũng cần có biotin để phát triển, trong môi trường không có biotin các tế bào
dinh dưỡng không thể phát triển, bào tử cũng không nảy mầm được [37].
1.1.5. Đặc điểm sinh lý
B. subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển ở nồng độ oxy
lớn hơn 3%. Vi khuẩn phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30 – 50
0
C); pH trung
tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 – 7,6. Nhiệt độ tối ưu
là 37
0
Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba
xúc tác: Ser, His, Asp [40].
Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; trung tâm hoạt động là bộ ba xúc
tác: Asp33, His81, Ser259 [23].
1.2. Natto và Nattokinase
1.2.1. Natto
Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản đã có từ cách đây hơn 1000
năm, là những hạt đậu nành đã luộc chín và được lên men với vi khuẩn B. subtilis
natto ở nhiệt độ khoảng 40
0
C – 43
0
C trong vòng 24 – 32 giờ thành những hạt màu
nâu, độ nhớt cao và có mùi nồng. Natto truyền thống được làm bằng cách ủ hạt đậu
đã luộc chín trong các bó rơm hoặc phủ rơm lên, do trong rơm rạ có B. subtilis natto.
Natto là một thức ăn, một sản phẩm lên men chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe,
trong đó có nattokinase được cho là có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các bệnh về
tim mạch [24], [30]. Hình 1.2. Sản phẩm natto [30].
5 Bảng 1.1. Thành phần chính trong 100g Natto [27]:
Thành phần
Hàm lượng
Caloride
200Kcal
mỡ máu cao và kêu gọi cộng đồng thế giới cải thiện nếp sống sinh hoạt và tiêu thụ
Natto [45].
1.2.2. Nattokinase
a) Nguồn gốc
6 Nattokinase (kí hiệu là EC 3.4.21.62) là một enzym có hoạt tính tiêu fibrin rất
mạnh có nguồn gốc từ Natto – món ăn truyền thống của Nhật Bản [30].
Trong đó: 3 (Loại): Hydroxylase
4 (Nhóm): Protease
21 (Dưới nhóm): Protease serin
62 (Enzym): Subtilisin
Tên ADN: arpN, định danh phân loại: 86.029 [NCBI] [30].
b) Đặc điểm cấu tạo
Nattokinase có cấu trúc là một chuỗi polypeptid gồm 275 gốc acid amin và
không có cầu nối disulfua trong phân tử. Nattokinase có trung tâm hoạt động bao gồm
nhóm hydroxyl của Ser – 221, imidazol của His – 64 và nhóm carboxyl của Asp – 32
[7].
Hình 1.3. Cấu trúc bậc 3 của nattokinase [30].
c) Tính chất
Nattokinase có điểm đẳng điện pI = 8,6 ± 0,3; ổn định trong khoảng pH từ 6 –
10, nhiệt độ < 50
0
C; bị bất hoạt khi pH < 5, nhiệt độ ≥ 70
0
C và các ion Fe
3+
, Al
nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông thông
thường khác [31].
e) Công dụng
Đã có rất nhiều nghiên cứu về hiệu quả của nattokinase trong điều trị huyết
khối, tim mạch như nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng của Fujita năm 1995 [32],
Haritha M. năm 2011 [30]. Năm 2008, Kim J. đã chỉ ra nattokinase có vai trò trong
việc phòng ngừa và điều trị tăng huyết áp [28]. Enzym này cũng được dùng để giảm
8 đau, đau xơ cơ, hội chứng mệt mỏi mạn tính, viêm màng dạ con, u xơ tử cung, co thắt
cơ, vô sinh, ung thư và bệnh beriberi [46].
Ở nước ta cũng có một số nghiên cứu về tác dụng của nattokinase trên lâm
sàng: nghiên cứu của bác sĩ Nguyễn Chí Tuệ năm 2008 ở bệnh viện Quân Y 103 đã
công bố kết quả nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Nattospes (Nattokinase) trên 73
bệnh nhân đột quỵ não, hầu hết bệnh nhân có hiệu quả về lâm sàng, có xu hướng giảm
đông máu, không có trường hợp nào bị tai biến chảy máu [15]; nghiên cứu của GS.TS
Nguyễn Văn Thông (2008) tại Bệnh viện 108 cũng cho thấy Nattospes có hiệu quả
tương đương Aspirin (thuốc đầu tay trong điều trị đột quỵ não) [13]; năm 2009,
Nguyễn Bá Anh với nghiên cứu hỗ trợ điều trị phục hồi chức năng vận động của bệnh
nhân nhồi máu não sau giai đoạn cấp ở Bệnh viện Bạch Mai cũng cho thấy trên lâm
sàng và trong dự phòng tái phát Nattospes và Aspirin có tác dụng tương đương,
enzym còn rất ít tác dụng phụ so với Aspirin khi dùng trong thời gian dài [1].
Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một số thực phẩm chức năng chứa
nattokinase dưới dạng viên nang: Nattospes (300FU/g), S-Nattokinase (5.000FU/g),
Nattokinase plus FUcoidan (2.000FU/g), Nattokinase plus (3.000FU/g), Japato
(600FU/g), Nattovena (4.000FU/g).
1.2.3. Đậu nành
Cây đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L) Merrill, đậu nành có nhiều
màu sắc khác nhau. Trong đó đậu nành có màu vàng là loại tốt nhất nên được trồng
40,0
21,0
4,9
34,0
Tử diệp
90,3
43,0
23,0
5,0
29,0
Vỏ hạt
8,0
8,8
1,0
4,3
86,0
Phôi
2,4
41,1
11,0
4,4
43,0
Công dụng của đậu nành:
Đậu nành chứa nhiều protein, 8 loại acid amin thiết yếu, là nguồn cung cấp
chất xơ, sắt và vitamin nhóm B. Các hợp chất isoflavon và hóa thảo (phytochemicals)
khác trong đậu nành như protease inhibitors, phytates, phytosterol, lecithin, acid
Omega-3,…có khả năng phòng ngừa và trị liệu một số bệnh như: đau tim, tai biến
mạch máu não, ung thư vú, ung thư kết tràng…(theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ,
Viện Đại học Havard, Viện Đại học Alabama. Minnesota, Iowa và Helsinki, Phần
sinh vật tăng lên nhiều lần so với bình thường. Trong công nghiệp sản xuất enzym
cần lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi
trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [10], [17].
1.3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men
Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định bằng thời
gian cho phép tích tụ enzym tối đa. Thời gian đó phụ thuộc chủ yếu vào chủng vi sinh
vật. Enzym vi sinh vật thường được sinh vào pha log (pha lũy thừa). Protease ngoại
bào của loài B. subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vi khuẩn
vào cuối pha lũy thừa cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử [10].
11 1.3.6. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
sinh enzym protease của B. subtilis natto
a) Nghiên cứu trên thế giới
Năm 2005, Junguo Liu và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh
dưỡng cho sinh tổng hợp nattokinase sử dụng chủng Bacillus subtilis natto NLSSE.
Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các nguồn nitrogen: (NH
4
)
2
SO
4
, NaNO
3
, natri
glutamate, casein, pepton đậu nành; khảo sát các nguồn hydratcacbon: glucose,
saccharose, maltose, xylose và glycerol với hàm lượng 20g/l; tối ưu hóa 6 nhân tố
dinh dưỡng: nguồn C, N, MgSO
4
4
0,02%, K
2
HPO
4
0,02%, KH
2
PO
4
0,01%, CaCl
2
0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu nành 3% [35].
b) Nghiên cứu trong nước
Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus
sp.7.2 và Bacillus sp. NP3 có khả năng sinh tổng hợp enzym nattokinase 470FU/g
trên môi trường thạch đậu nành hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên
khay từ một số chủng Bacillus spp. lấy từ bộ sưu tập giống của Viện sinh học nhiêt
đới và phân lập từ thực phẩm natto [12].
Hin Vireak (2012) đã xác định được enzym do Bacillus subtilis natto sinh ra
là protease và amylase; enzym protease của vi khuẩn có khả năng tiêu fibrin; xác định
môi trường nuôi cấy vi sinh vật cho hoạt tính enzym tốt nhất là canh thang có bổ sung
0,05% casein; xác định thời gian thu enzym có hoạt tính tốt nhất là 28 giờ [17].
12 Nguyễn Ngọc Ánh (2013) đã phân lập được vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ
sản phầm natto thương mại và đã xác định được vi khuẩn sinh ra 3 enzym ngoại bào
là protease, amylase, cellulase, trong đó protease có khả năng tiêu fibrin; đồng thời
xác định được môi trường tổng hợp giúp vi khuẩn sinh nhiều protease và sinh ít
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng
Bacillus subtilis natto – (chủng được phân lập từ chế phẩm natto Nhật Bản
trên thị trường được lưu giữ tại phòng Vi sinh – Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường
Đại học Dược Hà Nội).
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng
Nguyên liệu và hóa chất sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.1
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng:
Tên
Nguồn gốc
Tên
Nguồn gốc
Pepton
Ấn Độ
Dung dịch Xanh methylen
Việt Nam
Cao thịt
Đức
KI, Iot, HCl, NaOH
Trung Quốc
NaCl
Trung Quốc
KH
2
PO4
Trung Quốc
Thạch bột
Trung Quốc
Đậu nành
Việt Nam
Casein
Pepton
Cao thịt
NaCl
Thạch thường
Nước máy vđ
Lượng
1,0g
0,5g
0,5g
2,3g
100ml
b) Công thức môi trường canh thang (MT2)
Thành phần
Pepton
Cao thịt
NaCl
Nước máy vđ
Lượng
1,0g
0,5g
0,5g
100ml
c) Công thức môi trường canh thang sữa đậu (MT3)
Thành phần
Pepton
Cao thịt
NaCl
Sữa đậu nành tách bã
Lượng
1,0g
Đức (Satorius)
Lò vi sóng
Hàn Quốc (Daewoo)
Máy làm sữa
đậu
Hà Lan (Philips)
Tủ lạnh
Nhật (Toshiba)
Máy li tâm
Đức (Rotofix)
(Universal)
Các dụng cụ được sử dụng: Bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, đĩa petri
nhựa (đường kính 8,8cm), ống nghiệm, pipetman, pipet tip, thước kẹp Palmer…
2.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu giải quyết 2 mục tiêu sau:
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung nguồn dinh dưỡng chứa đậu tương
tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto
- Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung sữa đậu nành và bột đậu tới khả năng
sinh enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto.
- Khảo sát thời gian thu enzym protease khi nuôi cấy vi khuẩn trong các môi
trường canh thang có bổ sung sữa đậu nành và bột đậu.
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và casein
tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto
- Lựa chọn nồng độ casein thích hợp bổ sung vào môi trường canh thang, khảo
sát thời gian cho hoạt độ protease cao nhất.
- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp bột đậu và casein, khảo
sát thời gian cho hoạt độ protease khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường bổ sung.
16
cấy truyền là 10%. Nuôi trên máy lắc ở 37
0
C trong thời gian thích hợp, tốc độ lắc 110
vòng/phút [5], [11].
2.3.2. Phương pháp làm sữa đậu nành
Rửa sạch 80g đậu tương hạt. Ngâm trong nước lạnh trong 12 giờ. Cho đậu
tương vào máy làm sữa đậu. Đong chính xác 1000ml nước cất vào máy. Khởi động
máy, bật máy đến khi đậu tương hoàn toàn mịn thì tắt máy. Giữ sữa đậu nành trong
ngăn mát tủ lạnh, sử dụng trong vòng 2 tuần.
2.3.3. Phương pháp làm đậu natto
Rửa sạch 20g đậu nành hạt. Ngâm trong nước lạnh 12 giờ. Cho đậu đã ngâm
vào đĩa petri, hấp tiệt trùng ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau tiệt khuẩn, để nguội xuống
Copyright: Tài liệu đại học ©