BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ THU TRANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH TÍNH ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ
THÀNH PHẦN TRONG CAO
HOẠT LẠC VƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC



LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410 Nơi thực hiện đề tài:
Bộ môn Dược học cổ truyền
Trung tâm kiểm nghiệm Hà Nội
Thời gian thực hiện: từ 11/2012 đến 09/2013 HÀ NỘI 2013
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em chân thành gửi lời cảm ơn đến TS. Trần Việt Hùng, TS Bùi

1.1.2.2. Tác dụng sinh học 5
1.1.2.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT 5
1.1.3. Bạch thược 5
1.1.3.1. Thành phần hóa học 6
1.1.3.2. Tác dụng sinh học 7
1.1.3.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT 7
1.1.4. Xuyên Khung 7
1.1.4.1. Thành phần hóa học 7
1.1.4.2. Tác dụng sinh học 7
1.1.4.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT 8
1.1.5. Sinh khương 8
1.1.5.1. Thành phần hóa học 8
1.1.5.2. Tác dụng sinh học 8
1.1.5.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT 9
1.2. Tổng quan về kỹ thuật SKLM trong phân tích kiểm nghiệm 9
1.2.1. Định nghĩa 9
1.2.2. Các đại lượng đặc trưng 9
1.3. Tổng quan về kỹ thuật HPLC trong phân tích kiểm nghiệm 10
1.3.1. Định nghĩa 10
1.3.2. Các đại lượng đặc trưng 11
1.3.3. Cách đánh giá pic 14
1.3.3.1. Đánh giá diện tích 14
1.3.3.2. Đánh giá chiều cao 14
1.3.4. Cách tính kết quả 14
1.3.4.1. Phương pháp quy về 100 % diện tích 14
1.3.4.2. Phương pháp dùng chuẩn ngoại 15
1.3.4.3. Phương pháp dùng chuẩn nội 16
1.3.4.4. Phương pháp thêm chuẩn 17
1.4. Kỹ thuật chiết tách và nguyên lý ứng dụng trong phân tích kiểm nghiệm 17
1.4.1. Sai số xử lý mẫu 18

2.5. Đánh giá kết quả 28
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29
3.1. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của mẫu cao Hoạt lạc vương 29
3.2. Định tính các nhóm chất chính trong cao và dược liệu bằng phương pháp
hóa học 30
3.3. Định tính các vị dược liệu Quế chi, Hương phụ, Xuyên khung, Bạch thược
bằng phương pháp SKLM 32
3.3.1. Định tính Quế chi 32
3.3.2. Định tính Bạch thược 35
3.3.3. Định tính Hương phụ, Xuyên khung 38
3.3.4. Định tính Bạch thược, Hương phụ, Quế chi 42
3.4. Định lượng paeoniflorin trong cao Hoạt lạc vương bằng phương pháp
HPLC 45
3.4.1. Xác định hàm lượng paeoniflorin trong dược liệu Bạch thược 45
3.4.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 49
3.4.3. Khảo sát lựa chọn phương pháp xử lý mẫu phân tích 50
3.4.4. Lựa chọn quy trình phân tích 51
3.4.5. Thẩm định quy trình phân tích 51
3.4.5.1. Tính đặc hiệu của phương pháp 51
3.4.5.2. Tính thích hợp của hệ thống 54
3.4.5.3. Độ tuyến tính và khoảng xác định 55
3.4.5.4. Độ đúng của phương pháp 56
3.4.5.5. Độ chính xác của phương pháp 58
3.4.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD) 58
3.4.5.7. Giới hạn định lượng (LOQ) 59
3.4.6. Xác định hàm lượng paeoniflorin trong một số mẫu cao Hoạt lạc vương 59
3.5. “Dự thảo” tiêu chuẩn chất lượng cao đặc Hoạt lạc vương 61
3.5.1. Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao chiết ethanol 60 % 61
3.5.2. Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cao chiết nước 61
4. BÀN LUẬN 62

TT : Thuốc thử
CN : Cao chiết nước
Et60% : Cao chiết ethanol 60 %.
QC : Quế chi
HP : Hương phụ
BT : Bạch thược
XK : Xuyên khung
DHCT : Dược học cổ truyền
TTKN HN : Trung tâm kiểm nghiệm Hà Nội. DANH MỤC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
Bảng 1.01 Thông số đánh giá phương pháp phân tích 22
Bảng 3.01 Kết quả đánh giá chất lượng mẫu cao Hoạt lạc vương

Bạch thược

48
Bảng 3.12 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 54
Bảng 3.13 Bố trí nồng độ các dung dịch chuẩn paeoniflorin 55 Bảng 3.14
Kết quả xác định đáp ứng diện tích pic của các nồng độ
paeoniflorin trong dung dịch trong chuẩn
55
Bảng 3.15 Kết quả xác định độ đúng của phương pháp 58
Bảng 3.16 Kết quả xác định giá trị LOD của phương pháp 59
Bảng 3.17
Kết quả xác định hàm lượng paeoniflorin trong một số
mẫu cao Hoạt Lạc vương do nhóm nghiên cứu bào chế
60
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình Tên hình Trang
Hình 1.01
Công thức cấu tạo hợp chất paeoniflorin

Sắc ký đồ dung dịch thử (thử nghiệm định lượng
paeoniflorin trong vị dược liệu Bạch thược)
49
Hình 3.09
Sắc ký đồ mẫu placebo
53
Hình 3.10
Sắc ký đồ mẫu chuẩn paeoniflorin (tính đặc hiệu)
53
Hình 3.11
Sắc ký đồ mẫu thử (tính đặc hiệu)
54
Hình 3.12
Đồ thị biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ
paeoniflorin trong dung dịch và đáp ứng diện tích pic
56

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ cổ xưa, dược liệu đã được dùng làm thuốc chữa bệnh cho con người. Việc
kết hợp hài hòa hai nền y học cổ truyền và y học hiện đại là xu thế tất yếu của thời
đại nhằm giải quyết những khó khăn của Y học. Trong những năm gần đây, xu
hướng quay trở lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng
và điều trị bệnh trở nên thịnh hành ở Việt Nam.
Đi cùng xu thế hiện đại hóa, nhiều sản phẩm nguồn gốc thảo dược bào chế
dưới các dạng hiện đại xuất phát từ các bài thuốc cổ phương đã ra đời. Những sản
phẩm này giúp người bệnh sử dụng đơn giản, không mất thời gian, công sức cho
việc đun sắc thuốc. Tuy nhiên quy trình bào chế và tiêu chuẩn hoá một bài thuốc
cũng là một vấn đề đang được các công ty, các nhóm nghiên cứu quan tâm. Liệu

- Xây dựng phương pháp định lượng paeoniflorin trong cao Hoạt Lạc Vương.
-

Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng của cao đặc Hoạt Lạc Vương.

3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Phương thuốc Hoạt lạc vương
Thành phần:
[10]


sắc nước uống, sắc vũ hỏa, uống nóng, ngày 1 thang [3], [10].
Chống chỉ định:
Phụ nữ có thai, người đang chảy máu [3], [10].
Thận trọng:
Khi dùng cho trẻ em [3], [10].
Thông tin về các vị thuốc trong bài thuốc:
1.1.1. Quế chi
4

Cành phơi hay sấy khô của cây Quế (
Cinnamomum cassia
Presl.) hoặc một
số loài Quế khác (
Cinnamomum

zeylanicum
Blume,
Cinnamomum loureirii
Nees.),
họ Long não (Lauraceae) [8].
1.1.1.1. Thành phần hóa học
Tinh dầu: hàm lượng tinh dầu thay đổi ở các bộ phận từ 1 - 3%, lá 0,14%,
cành con 0,3 - 0,33% [5], [8].
Thành phần chính trong tinh dầu Quế là aldehyd cinnamic, hàm lượng có thể
từ 70 - 95%; ngoài ra còn có cinnamyl acetat, coumarin, cinnamyl alcol, methyl
cinnamat [2], [3], [5], [12].

Các thành phần khác: tinh bột, chất nhầy, dầu béo, tanin, chất màu, chất
ngọt, gôm, calcioxalat; các dẫn chất flavonoid gồm cả procyanidin; các chất chứa
nhân thơm; β-sitosterol, cholin, acid protocatechic [5], [7], [11], [12], [37].

nữ.
5

1.1.2. Hương phụ
Thân rễ đã loại bỏ rễ con và lông, phơi hay sấy khô của cây Hương phụ vườn
(Cyperus rotundus
L.), hoặc cây Hương phụ biển
(Cyperus stoloniferus
Retz.), họ
Cói (Cyperaceae) [8].
1.1.2.1. Thành phần hóa học
Tinh dầu: Hương phụ chứa 0,3 - 2,8% tinh dầu; chứa hơn 30 cấu tử với hàm
lượng khác nhau: cyperen 3,67%, α-cyperon 8,96%, α-cyperol 16,74%, đồng phân
của cyperon 12,26% [2], [5], [8].
Thành phần khác: flavonoid 1,25%, tanin 1,66%, các acid phenol, alcaloid
0,21 - 0,24%, glycosid tim 0,62 - 0,74%. Ngoài ra còn có chất đắng, tinh bột 9,2%,
pectin 8,7%, chất béo 2,98%, acid hữu cơ 3,25%, protein, vitamin C 8,8%, nhiều
nguyên tố vi lượng [2], [5], [8], [12].
Dược điển Việt Nam IV quy định: Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu
không ít hơn 0,35 % tính theo dược liệu khô kiệt [8].
1.1.2.2. Tác dụng sinh học
Cao hương phụ dạng lỏng có tác dụng ức chế sự co bóp, làm dịu sự căng
thẳng của tử cung động vật [2], [3], [12].
Nước sắc của hương phụ vườn và hương phụ biển có tác dụng kiểu estrogen
và mức độ khác nhau. Tinh dầu hương phụ cũng có tác dụng kiểu estrogen. Điều
này chứng minh việc dùng hương phụ trong việc điều trị các bệnh của phụ nữ [2].
1.1.2.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT [3], [10]
-

Hành khí, giảm đau: Dùng điều trị các bệnh đau bụng, đau hai bên sườn, sôi

(tỷ lệ acid benzoic khoảng 1,07%), nhựa, chất béo và chất nhầy [12].
Paeoniflorin
-

Công thức phân tử: C
23
H
28
O
11
-

Khối lượng phân tử: 480,45
-

Công thức cấu tạo (hình 1.01)

Hình 1.01: Công thức cấu tạo hợp chất paeoniflorin
Tính chất:
-

Dạng tinh thể hình kim, có màu trắng ngà.
-

Tan trong nước, ethanol và methanol.
-

Nhiệt độ nóng chảy: Khoảng 196
o
C

Bình can: dùng trong các chứng đau đầu, hoa mắt.
1.1.4. Xuyên Khung
Thân rễ đã phơi hay sấy khô của cây Xuyên khung (
Ligusticum wallichii

Franch.). Họ Hoa tán (Apiaceae) [8].
1.1.4.1. Thành phần hóa học
Dược liệu có alcaloid và tinh dầu; trong đó có acid ferulic, 4 hydroxy - 3 -
butylphthalid, senkyunolid, ligustilid, tetramethylpyrazin, chuanxiongol, acid
sedanic [2], [3], [5], [8], [12], [34], [35].
1.1.4.2. Tác dụng sinh học
8

Nước sắc xuyên khung kéo dài giấc ngủ của chuột khi dùng kèm với thuốc ngủ
barbituric [3].
Liều nhỏ tinh dầu xuyên khung có tác dụng ức chế hoạt động não, hưng phấn
trung khu hô hấp và trung khu phản xạ ở tủy sống, làm tăng huyết áp. Nếu dùng liều
cao tinh dầu xuyên khung sẽ làm não tê liệt, huyết áp hạ, hô hấp khó khăn [3].
Tác dụng kháng khuẩn: Có tác dụng ức chế
Streptococcus
và
Candida albicans

[3].
1.1.4.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT [3], [10]
-

Hoạt huyết, thông kinh: Dùng các trường hợp phụ nữ kinh nguyệt không đều,
bế kinh, đau bụng kinh, vô sinh.
-

giao cảm, tăng tuần hoàn, tăng huyết áp [3], [25], [26], [27].
1.1.5.3. Tác dụng và công dụng theo YHCT [3], [10]
Tính vị: Vị cay, tính ấm
Quy kinh: Phế, vị, tỳ.
Công năng, chủ trị:
-

Phát tán phong hàn, dùng chữa cảm mạo do phong hàn gây ra.
-

Làm ấm vị (ấm dạ dày): Dùng làm hết nôn khi bị lạnh, bụng đầy trướng
không tiêu.
-

Hóa đờm, chỉ ho: Dùng trong bệnh ho do viêm phế quản.
-

Lợi niệu, tiêu phù thũng.
-

Giải độc khử trùng: dùng chữa khi giun chui lên ống mật, tắc ruột do giun
đũa, giải độc khi ăn cua cá bị dị ứng.
1.2. Tổng quan về kỹ thuật SKLM trong phân tích kiểm nghiệm
1.2.1. Định nghĩa
SKLM là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di
chuyển qua pha tĩnh, trên đó đã đặt các chất cần tách [15],[16], [19], [23], [36].
-

Pha tĩnh: là chất bột rắn, mịn được trải thành lớp mỏng mịn và đồng nhất
được cố định trên phiến kính hoặc phiến kim loại, nhựa [15], [19]

[15], [16], [19].
Dùng để xác định vị trí vết chất thử trên sắc ký đồ khi không xác định được
tuyến dung môi
Rr = a/c
Trong đó:
-

a: Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm).
-

c: Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu chuẩn (cm).
Rr có thể lớn hơn hoặc nhỏ hơn 1.
1.3. Tổng quan về

kỹ thuật HPLC trong phân tích kiểm nghiệm
1.3.1. Định nghĩa
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hoá lý dùng để
phân tách các thành phần của một hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất
khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không hoà tan nhau. Trong quá trình sắc ký
luôn xảy ra quá trình cân bằng động về sự phân bố của chất tan vào pha tĩnh và pha
động khi pha động luôn luôn chảy qua cột với một tốc độ nhất định [15], [16], [19].
Các chất cần phân tách trong dung dịch của hỗn hợp khi được đưa vào cột sẽ
được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của cột và kiểu sắc
ký áp dụng. Dung môi pha động được bơm vào cột sắc ký dưới áp suất cao. Các
chất tan sẽ di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vào cấu trúc và tính
chất của mỗi chất. Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ được quyết định bởi bản
chất sắc ký của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của các chất tan, bản chất và thành
11

phần của pha động dùng để rửa giải chất tan ra khỏi cột. Kết quả là các chất được

-

t’
R
: thời gian lưu giữ thực của chất tan.
Thời gian lưu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bản chất sắc ký của pha tĩnh;
bản chất, thành phần, tốc độ của pha động; cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan;
pH của pha động, nồng độ chất tạo phức.
Tương ứng với thời gian lưu, đại lượng thể tích lưu của một chất là thể tích
của pha động chảy qua cột sắc ký trong khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào cột
cho đến khi chất tan được rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại.
Hệ số phân bố ( K ): [15], [16], [19]
Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất tan
giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi hệ số phân bố, nó
được tính theo công thức: K =
M
C
C
s

Trong đó: C
S
và C
M
lần lượt là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động.
12

Khi nồng độ chất tan không cao quá thì K là một hằng số chỉ phụ thuộc vào
bản chất các pha và chất tan, vào nhiệt độ.
Thừa số dung lượng ( k’ ): [15], [16], [19]

-
T

Hệ số chọn lọc (
α
): [15], [16], [19]
Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất được đặc trưng bởi hệ số chọn lọc:
α
=
A
B
K
K
=
A
B
k'
k'
=
AR,
BR,
t'
t'

Theo quy ước, chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy
α
>1.
α

càng lớn thì hai chất tách ra khỏi nhau càng xa, thường dùng