BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BICH THARATH
KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA
MÔI TRƢỜNG DINH DƢỠNG ĐẾN
LƢỢNG SINH KHỐI CỦA
Saccharomyces boulardii
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2015
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghiệp Dược, những người đã giúp đỡ, đóng
góp ý kiến quý báu và hỗ trợ tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành
khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị kỹ
thuật viên trong bộ môn Công nghiệp Dược.
Em cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường và các thầy
cô giáo trong trường đã dạy dỗ và dìu dắt em trong năm năm học tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và
hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên BICH THARATH
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 3
1.1.Probiotics 3
2.1.3. Môi trường sử dụng nuôi cấy nấm men 20
2.2. Nội dung nghiên cứu 21
2.2.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của nấm men S. boulardii. 21
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường dinh dưỡng đến lượng sinh
khốinấm men S. boulardii. 21
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 21
2.3.1. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng 21
2.3.2. Phương pháp nhân giống 21
2.3.3. Phương pháp nuôi cấy thu dịch lên men 22
2.3.4. Phương phápthu sinh khối 22
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 23
3.1. Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men S. boulardii 23
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của các môi trƣờng dinh dƣỡng lƣợng sinh khối
nấm men S. boulardii 24
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng củacác nguồn hydrat cacbon đến lượng sinh khối
nấm men S.boulardii 24
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ đường glucose đến lượng sinh
khối nấm men S. boulardii 26
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng củacác nguồn nitơ đến lượng sinh khối nấm men
S.boulardii 27
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ cao nấm men đến lượng sinh 28
khối nấm men S. boulardii 28
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30
DANH MỤC CÁC BẢNG
1.1. Một số tác động tăng cường hệ miễn dịch của probiotics ở người.
2.1. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu.
2.2. Thiết bị, dụng cụ.
3.1. Khối lượng sinh khối nấm men S. boulardii thu được từ 20 ml môi
trường nuôi cấy tại các thời điểm đã cố định.
3.2. Khối lượng sinh khối thu được trong các môi trường có chứa nguồn
hydratcacbon.
3.3. Khối lượng sinh khối thu được theo các nồng độ của đường glucose.
3.4. Khối lượng sinh khối thu được trong các môi trường có chứa nguồn
nitơ.
3.5. Khối lượng sinh khối thu được theo các nồng độ của cao nấm men.
của thế kỷ XXI. Công nghệ sinh học đã mang lại những hiệu quả to lớn cho
con người, đặc biệt trong lĩnh vực y tế, sức khỏe.
Hiện nay các chế phẩm sinh học được sản xuất và sử dụng ngày càng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Giáo sư Miqinihafu thuộc viện
nghiên cứu Pasteur phát hiện ra rằng: “Nếu cơ thể hấp thu loại vi khuẩn đặc
biệt nào đó thì có thể ức chế sự sinh sôi của các vi khuẩn có hại trong ruột,
tránh việc sản sinh ra chất độc. Như vậy không những khó mắc bệnh mà còn
có thể tránh lão hóa và kéo dài tuổi thọ”.Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu đã chỉ
ra rằng các vi sinh vật có lợi có tác động trong việc cải thiện tiêu hóa, mang
đến nhiều lợi ích cho sức khỏe con người.Ngoài ra, những vi sinh vật này còn
đóng vai trò trong việc cải thiện khả năng miễn dịch, sức khỏe tim mạch,
giảm nguy cơ ung thư
Probiotics từ lâu đã được biết đến là những vi khuẩn có lợi, sống và
giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột. Chúng có nhiều ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực như dược phẩm, chăn nuôi, thực phẩm Trong lĩnh vực dược phẩm
probiotics chủ yếu được sử dụng chữa trị các bệnh đường tiêu hóa, trong đó,
nấm thuộc chủng S. boulardii, có vai trò ngăn chặn và hạn chế sự hoạt động
của vi khuẩn bệnh như E. coli, Shigella và Samonella. Đặcbiệt S. boulardii là
loại probiotic an toàn, chịu nhiệt, có năng lực sống trong ống tiêu hoá, kháng
lại kháng sinh, phát triển nhanh trong một thời gian ngắn.
Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu về nuôi cấy nấm men S.
boulardii còn ít,vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát ảnh hƣởng
2
củamôi trƣờng dinh dƣỡng đến lƣợng sinh khối của Saccharomyces
boulardii”, với 2 mục tiêu là :
1. Xây dựng đường cong sinh trưởng củanấm men S. boulardii.
2. Khảo sát ảnh hưởng củacác nguồn và các nồng độ của môi trường dinh
dạ dày[17].
Tuy nhiên phải tới đầu thế kỉ XX những nguyên cứu đầu tiên về vai trò
của một số vi khuẩn mới được tiến hành bởi Eli Metchnikoff. Ông đã đưa ra ý
kiến rằng: “Sự phụ thuộc của các vi khuẩn đường ruột vào thức ăn sẽ làm
đường ruột có thể dung nạp ở mức độ nào đó việc thay đổi các hệ vi khuẩn
trong cơ thể và thay thế các vi khuẩn có hại bằng các vi khuẩn có
lợi”[13],[17].
Vào thời điểm này Henry Tissier, một bác sỹ nhi khoa người Pháp nhận
thấy trẻ em bị tiêu chảy thường có một lượng nhỏ vi khuẩn hình chữ Y trong
phân. Những vi khuẩn này trái lại có số lượng lớn ở những đứa trẻ khỏe
mạnh. Ông đã đề xuất sử dụng hệ vi khuẩn này cho những bệnh nhân tiêu
chảy để giúp họ có được đường ruột khỏe mạnh.
Những công trình nghiên cứu của Metchnikoff và Tissier là những
nghiên cứu đầu tiên đưa ra giả thiết khoa học về việc dùng vi khuẩn một cách
4
hữu ích. Vào năm 1960 thuật ngữ probiotics mới được đề xuất để đặt tên cho
các chất do vi khuẩn sản sinh ra để thúc đẩy sự phát triển của các hệ vi cơ
khác. Để chỉ ra bản chất vi khuẩn của probiotics, Fuller (1989) đã định nghĩa
lại thuật ngữ này: “Probiotics là các sinh vật sống khi bổ sung theo đường tiêu
hóa có ảnh hưởng tích cực đến vật chủ bằng việc cải thiện sự cân bằng đường
ruột của chúng”. Một định nghĩa gần tương tự đã được đề xuất bởi Havenaar
and Huis in „t Veld (1992): “Probiotics là các vi khuẩn đơn lẻ hoặc hỗn hợp
các vi khuẩn còn sống sót khi được dùng cho người hoặc động vật sẽ tác động
tích cực đến vật chủ bằng cách cải thiện hệ vi khuẩn đường ruột”. Một định
nghĩa gần đây hơn nhưng chưa phải là cuối cùng: “Probiotics là các vi sinh
vật sống khi được dùng với số lượng thích hợp sẽ mang lại những lợi ích về
mặt sức khỏe cho vật chủ”.
thải
Muối rau quả được xem như là một phương thức hữu hiệu bảo quản
thực phẩm bởi trong qua trình lên men tự phát rau củ quả, các vi khuẩn acid
lactic giữ vai trò lên men đường tạo acid lactic nâng cao độ ổn định của sản
phẩm, ngoài ra nhóm vi khuẩn này còn làm tăng lượng vitamin và sinh khả
dụng của vitamin giúp tiêu hóa thức ăn tốt hơn. Các loại rau củ quả hay dùng
để muối dưa là loại chứa lượng lớn các loài vi khuẩn có lợi trong lên men như
dưa chuột, các loại rau cải, cà rốt, ớt Các loài vi khuẩn tìm thấy nhiều trong
quá trình lên men này là: Lactobacillus sp. (L. plantarum, L.brevis),
Leuconostoc sp.(L. mesenteroides) và Pediococcus sp.(P. pentosaceus, P.
Cerevisiae)[10].
Trong sữa chua cũng tồn tại nhiều chủng như: Lactobacillus sp.(L
.bulgaricus), Bifidobacterium sp. (B.bifidum)[18].
Các nhà khoa học cũng đã phân lập được probiotics từ thịt gia súc sống
chủ yếu là chi Lactobacillusgồm các loài như: Lactobacillus lactis,
Lactobacillusfermentum,Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus.
Dựa vào nghiên cứu này có thể sử dụng vi khuẩn lactic làm chất bảo quản thịt
mà giảm chất phụ gia độc hại [8].
6
Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh sữa mẹ cũng chứa probiotics
trong đó gồm nhiều chủng Bifidibacterium giúp cân bằng hệ khuẩn ruột và
phát triển hệ miễn dịch ở trẻ em bú mẹ [7], [19].
1.1.2.2. Trong đƣờng tiêu hóa của con ngƣời
Vi khuẩn probiotics cư trú thường xuyên trên cơ thể con người (cả
động vật bậc cao và côn trùng).Có hơn 400 loài vi khuẩn được tìm thấy trong
đường tiêu hóa,một nửa khối lượng của vật chất ở đại tràng là vi khuẩn với số
lượng gấp 10 lần số lượng của các tế bào mô tạo nên cơ thể. Thông thường dạ
những nhiệm vụ riêng biệt. Vi khuẩn sống trong đường tiêu hóa bao gồm cả
vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại, điều đó không có nghĩa là khi loại trừ hết
vi khuẩn có hại cơ thể sẽ khỏe mạnh mà sự cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và
vi khuẩn có hại mới đem lại sự khỏe mạnh tốt nhất.
Vikhuẩn có lợi là những vi khuẩn như: Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium bifidum và một số vi khuẩn
khác.Chúng giúp ta tiêu hóa thức ăn, cung cấp dinh dưỡng, vitamin, và cạnh
tranh với vikhuẩn có hại. Những vi khuẩn có lợi có thể được bổ sung qua
đường uống[4].
1.1.3.2. Probiotics và bệnh tiêu chảy
Theo thống kê, bệnh tiêu chảy ở người do các nguyên nhân sau:
75 - 80%dovi khuẩn
10% do kí sinh trùng
5% do virus
5% là do các nguyên nhân khác.
8
Probiotics được chứng minh là có tác dụng trong năm loại tiêu chảy:
tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn, tiêu chảy do
nhiễm virus, tiêu chảy ở người du lịch, tiêu chảy do bất dung nạp lactose [6,
7].
1.1.3.3. Probiotics và sự kích thích hệ miễn dịch
Các nghiên cứu in vivo và in vitro cho thấy rằng một vài chủng
probiotics chuyên biệt có khả năng biến đổi chức năng hệ miễn dịch, kích
thích hệ miễn dịch kháng lại các bệnh truyền nhiễm và ung thư, điều hòa các
phản ứng miễn dịch quá mẫn như dị ứng [7].
Bảng1.1.Một số tác động tăng cường hệ miễn dịch của probiotics ở người.
Chức năng
9
Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học đã chứng minh được
tác dụng hạ lipid máu của probiotics. Dựa trên những quan sát ở bệnh nhân sử
dùng sản phẩm sữa lên men và một báo cáo về sự đồng hóa cholesterol bởi
chủng L. acidophilus người ta đã đề xuất rằng probiotics có thể ảnh hưởng có
lợi lên chuyển hóa lipid.Vi khuẩn probiotics có thể lên men hydratcacbon
không thể tiêu hóa được và tạo ra các acid béo chuỗi ngắn trong ruột, những
chất này ức chế sự tổng hợp cholesterol trong gan hoặc tái phân phối
cholesterol từ huyết tương đến gan, vì vậy làm giảm lượng lipid trong máu.
Các chủng đơn lẻ có thể phân hủy muối mật và cản trở sự hấp thucholesterol
từ đường ruột [6], [9].
b) Tác dụng ngăn ngừa ungthƣ
Tác dụng chống khối u của probiotics có thể do một số cơ chế sau: gắn
với tác nhân đột biến, sản xuất các chất chống đột biến, ức chế các enzym tiền
ung thư như nitroreductase và β-glucuronidase, tăng cường sản xuất β-
glucosidase-1 chất giải phóng flavonids, sản xuất các chất chống oxy
hóa [6].
1.2.Nấm men
1.2.1. Đặc điểmchung của nấm men
Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào,
sống riêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính
chủ yếu bằng hình thức nảy chồi.
Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như: trong đất,nước,lương
thực,thực phẩm ,đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt.
Hình dạng và kích thước nấm men thay đổi tùy theo loài, giống, điều
kiện dinh dưỡng và nhiều yếu tố khác.
10
C.
Nấm men là sinh vật có nhân thật, cấu tạo tế bào có màng tế bào,
nguyên sinh chất, nhân, ty thể, ribosome, không bào, một số thể vùi
(glycogen, lipid, volutin…) [5].
11
1.2.2. Vai trò của nấm men
Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng rất
giàu protein, lipid và vitamin (đặc biệt là vitamin B).Chúng có khả năng lên
men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điền
kiện hiếu khí thì chúng có khả năng tăng nhanh lượng sinh khối tế bào.
Quá trình trao đổi chất của hầu hết giống nấm men đều không sinh ra
chất độc gây hại cho sức khỏe của người và vật nuôi nên chúng được sử dụng
rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm như: sản xuất rượu, bia, nước
giải khát có cồn, làm men bánh mì, chế biến các thực phẩm sữa lên men kefir,
johur….cho người và thức ăn gia súc.
Người ta còn sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào, sản xuất
vitamin, enzym… và đặc biệt loài Saccharomyces cerevisiae đang được sử
dụng như một công cụ đắc lực để mang các ADN tái tổng hợp phục vụ cho
việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của ngành công nghệ sinh học hiện đại
[5].
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men
Nấm men là vi sinh vật hiếu khí không bắt buộc, chúng hô hấp như một
cơ thể hiếu khí bậc cao, khi môi trường hết oxy phân tử chúng chuyển sang hô
hấp kỵ khí, gọi là quá trình lên men.Khi phản ứng lên men bắt đầu, tốc độ
sinh sản của tế bào nấm men bị kìm hãm và đến một giai đoạn nhất định hầu
như không còn nữa.Về cơ chế sinh học, đây là một quá trình sử dụng không
hết năng lượng những chất dinh dưỡng của môi trường. Vì quá trình phân hủy
Sử dụng hydrocacbon từ dầu mỏ và khí đốt làm nguồn cacbon nuôi cấy
nấm men rất được quan tâm trong vài thập kỷ gần đây.Trong đó parafin có thể
là nguồn cacbon dinh dưỡng dễ dàng đối với một số chủng của giống Candida
và Torulopsis[5].
13
Nguồn nitơ
Nấm men có khả năng tổng hợp được tất cả các acid amin,thành phần
protein trực tiếp từ các hợp chất đạm vô cơ và cacbon hữu cơ.
Đa số nấm men không đồng hóa được nitrat (trừ giống Hasenula và
Pichia).
Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của
acid vô cơ cũng như hữu cơ.Đó là amoni sulfat, phosphat rồi đến các muối
acetat, lactat, malat…Trong môi trường có muối amoni, đặc biệt là sulfat, thì
nấm men sử dụng gốc amoni trước, gốc acid còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử
dụng và sẽ làm môi trường bị acid hóa, giảm pH.
Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, peptid,
nucleotid… Trong thực tế, người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch
thủy phân đậu tương làm nguồn nitơ hữu cơ.Nấm men tiêu hóa rất tốt các
amin, còn pepton kém hơn và hoàn toàn không sử dụng được protein.Các
muối amoni được nấm men sử dụng tốt hơn các acid amin.Trong quá trình
nuôi cấy nấm men, các acid amin vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon dinh
dưỡng.Tuy nhiên, nấm men chỉ sử dụng được acid amin ở dạng L-acid amin.
Để thu sinh khối Saccharomyces được tốt, trong môi trường nuôi cấy
nên có mặt cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ [5].
Các nguyên tố vô cơ:
Trong các nguyên tố vô cơ sử dụng nuôi cấy nấm men, phospho được
), acid pantotenic
(vitamin B
5
), thiamin (vitamin B
1
),pyridoxyn (vitamin B
6
),acid nicotinic
(vitamin B
3
).
Trong công nghiệp, thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao
nấm men, nước chiết cám, dịch thủy phân đậu tương, rỉ đường.Trong các thí
nghiệm nuôi cấy ở qui mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, rau cải,
cà chua, cà rốt, khoai tây… làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường [5].
1.2.4. Đặc điểm S. boulardii
Được Herry Boulardii phát hiện vào năm 1923 trong vỏ trái cây chín, tế
bào có dạng hình tròn, bầu dục, kích thước (4–6)x (6–9) µm, sinh sản bằng
hình thức nảy chồi và tạo bào tử túi, hô hấp hiếu khí không bắt buộc.
Hình 1.2.hình ảnh tế bàoS. boulardii qua kính hiển vi điện tử
15
Có khả năng lên men đường glucose, saccharose, rafinose, xylose,
không lên men lactose, manitol, maltose , không hình thành hợp chất phân
giải tinh bột.
Là loài nấm men không mang mầm bệnh, được sử dụng như một chất
điều trị sinh học để ngăn cản bệnh tiêu chảy.
o
C, lượng sinh khối
thu được khoảng 25 – 50g/l.
Môi trường nước chiết giá đậu cũng được sử dụng để nuôi cấp nấm
men do trong đậu chứa hàm lượng protein cao, là nguồn thức ăn tốt cho nấm
men. Ngoài ra, còn có các vitamin A1,B1,B2,C,E,K và các chất kích thích tố
tăng trưởng khác.Tuy nhiên, vitamin C trong nước chiết giá đậu có thể hạn
chế sự phát triển của nấm men.
Ngoài ra, môi trường thủy phân từ cellulose thực vật (gỗ, vỏ bào, rơm
rạ, lõi ngô, bã mía…), hay parafin từ dầu mỏ cũng có thể sử dụng để nuôi cấy
nấm men.
Đặc biệt, nấm men có khả năng sử dụng được môi trường dịch kiềm
sulfit (chất thải của nhà máy giấy), thành phần chủ yếu là đường
pentose.Người ta tính được rằng, khoảng 5 tấn bột cellulose dùng sản xuất
giấy sẽ thải một lượng dịch kiềm sulfit chứa khoảng 189 kg đường.Dịch này
hấp thụ nhiều oxy nên khi nuôi cấy nấm men có thể giảm mức cung cấp oxy
tới 60% so với bình thường[3].
Hiện nay, môi trường được sử dụng để nuôi cấy nấm men phổ biến
nhất vẫn là môi trường rỉ đường.90% lượng sinh khối nấm men dùng bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi trên thế giới được sản xuất từ rỉ đường mía và củ cải
đường.Thành phần chính của loại nguyên liệu này là saccharose, khoảng 35 –
40%.Trong đường mía chứa các chất sinh trưởng (biotin, acid pantotenic,
inozit) với hàm lượng lớn,nhưng chứa ít chất khoáng và các acid amin. Vì
vậy, khi sử dụng đường mía làm nguồn cacbon nuôi cấy nấm men cần phải
loại bỏ một phần các chất sinh trưởng, đồng thời bổ sung các muối khoáng
17
cần thiết và có thể phải thêm hỗn hợp các acid amin dạng protein thủy phân
o
C, hạn chế được
mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn [5].
1.2.5.3. pH của môi trƣờng
pH tối ưu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6. Ở pH = 4, tốc độ tích lũy
sinh khối giảm, pH=3 – 3,5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại. Mức độ
hấp thu chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzym, sự sinh
Copyright: Tài liệu đại học ©