BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HỒ THANH NGA
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
HẠT VẢI
(SEMEN LITCHI)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HỒ THANH NGA

học cổ truyền, trường đại học Dược Hà Nội u ki trong sut thi
gian thc hin khóa lun.
Xin c    i các anh chị khoa Hóa phân tích, Dược lý- Viện
Dược Liệu  em rt nhiu trong thi gian qua.






ch


Hà N
Sinh viên

H Thanh Nga MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2
1.1. THỰC VẬT HỌC 2
1.1.1. Vị trí phân loại 2
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật của họ Bồ hòn (Sapindaceae) 2
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Litchi Sonn 3
1.1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây vải Litchi chinensis Sonn 3
1.1.2. Phân bố của cây vải Litchi chinensis Sonn 3
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 4
1.2.1. Thành phần hóa học 4

3.2.2.1. Xác định độ ẩm 25
3.2.2.2. Chiết xuất 25
3.2.2.3. Định lƣợng các phân đoạn bằng phƣơng pháp cân 26
3.2.2.4. Định tính các phân đoạn 27
3.3. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC 32
3.3.1. Chuẩn bị cao ethanol toàn phần 32
3.3.2.Thử nghiệm dọn gốc DPPH 32
3.3.2.1. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm 32
3.3.2.2. Chuẩn bị dung dịch DPPH 32
3.3.2.3. Tiến hành 32
3.3.3. Thử nghiệm dọn gốc superoxid 34
3.3.3.1. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm 34
3.3.3.3. Tiến hành 34
3.4. BÀN LUẬN 36
3.4.1. Đặc điểm vi học 36
3.4.2. Thành phần hóa học 36
3.4.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Kết quả định tính hạt Vải bằng phản ứng hóa học 24
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm hạt Vải 25
Bảng 3.3. Kết quả định lƣợng các phân đoạn 27
Bảng 3.4. Kết quả định tính cắn các phân đoạn bằng phản ứng hóa học 28
Bảng 3.5. Bảng giá trị R
f
của các vết ở phân đoạn n-hexan 30
Bảng 3.6. Bảng giá trị R
f
tƣơng ứng của các vết ở phân đoạn ethyl acetat 31
Bảng 3.7. Bảng giá trị R
f
tƣơng ứng của các vết ở phân đoạn n-butanol 32
Bảng 3.8. Hỗn hợp phản ứng 33
Bảng 3.9. Kết quả hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của dịch chiết hạt Vải, quercetin 33
Bảng 3.10. Hỗn hợp phản ứng 35
Bảng 3.11. Kết quả hoạt tính dọn gốc tự do superoxid
của dịch chiết hạt Vải và superoxid dismutase 35
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật vô
cùng phong phú và đa dạng. Bên cạnh đó Việt Nam còn được thừa hưởng một nền
y học cổ truyền phát triển từ rất lâu đời. Vì vậy, nguồn dược liệu dồi dào cùng với
vốn kinh nghiệm sử dụng của các dân tộc chính là một nguồn nguyên liệu vô cùng
quý giá cho các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên, cũng như những nghiên cứu về
hoạt tính sinh học theo hướng hiện đại.
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các
nhà khoa học đã chứng minh sự có mặt của gốc tự do trong hệ thống sinh học [23].
Các gốc tự do sinh ra trong cơ thể gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng như gây ra
các bệnh: ung thư, bệnh tim mạch, tiểu đường, các bệnh thoái hóa thần kinh, viêm
khớp dạng thấp, lão hóa [25], [32], [43]. Chính vì vậy, các nhà khoa học đã nghiên
cứu và phát hiện các chất có khả năng phân hủy, loại bỏ các gốc tự do, chúng được
gọi là các chất chống oxy hóa như: các enzym (superoxid dismutase, glutathione

đối [1], [2], [20]. Mép lá có răng cưa hoặc nếp cuộn. Hoa nhỏ, tập hợp thành cụm
hoa hình chùy, mọc ở kẽ lá bắc. Hoa đơn tính, hiếm khi lưỡng tính, đối xứng hai
bên hoặc đối xứng tỏa tròn. Đài hoa 4, 5 hoặc 6, kích thước đồng đều hoặc không
đồng đều, dính liền hoặc tách rời. Tràng 4, 5 hoặc 6, tách rời hoặc dính liền nhau,
mặt trong cánh hoa thường có những vẩy hoặc chùm lông, dính với đĩa mật, đôi khi
hoa không có cánh. Đĩa mật hình vòng khuyên, ở bên ngoài vòng nhị. Nhị hoa 5-10
thường là 8, dính vào đế hoa, nhị thò ra ngoài, tách rời hoặc dính liền, bao phấn
đính liền nứt dọc. Bộ nhụy 1, 3 hoặc 4 lá noãn, mỗi lá noãn chứa 1, 2 hoặc một số
noãn, kiểu đính noãn trung trụ; bầu có 1-4 ô, chỉ có một ô phát triển. Quả nang chia
ngăn hoặc quả mọng hoặc quả hạch. Hạt có 1, 2 hoặc nhiều hơn tách rời nhau, vỏ
ngoài hạt màu đen hoặc nâu, phôi cong uốn nếp, không có nội nhũ 2n = 20 - 36,
giàu tinh bột, lipid, có hoặc không có áo hạt [20].
Họ Bồ hòn (Sapindacae) có 135 chi, 1500 loài phân bố rộng rãi ở các vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt ở nhiệt đới Đông Nam Á [20]. Ở Việt Nam có
3

70 loài, thuộc 25 chi: Allophylus, Amesiodendron, Aryteta, Blighia, Cardiospermum,
Delavaya, Dimocarpus, Dodonaea, Glennila, Guioa, Hurpullia, Koelreuteria,
Lepisanthes, Litchi, Mischocarpus, Nephelium, Paranephelium, Pavieasia, Pometia,
Sapindus, Scheleichera, Sinoradlkofera, Sisyrolepis, Xerospermum, Zollingerio [1].
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Litchi Sonn.
Cây gỗ. Lá kép lông chim mọc so le. Cụm hoa hình chùy. Hoa đơn tính cùng
gốc, mọc ở kẽ lá bắc, đối xứng tỏa tròn. Đài 4-5 thùy, mở nắp, không có cánh hoa.
Nhị 6-8 có lông, chỉ nhị thò ra ngoài. Bộ nhụy có 2- 3 lá noãn, mỗi lá noãn chứa 1
noãn, bầu nhụy hình tim ngược. Quả đơn có áo hạt hình trứng hoặc gần hình cầu, vỏ
quả mỏng, có vết rạn, đôi khi gần như trơn. Hạt hình trứng, vỏ hạt màu nâu, phôi
thẳng 2n = 28 hoặc 30 [20]. Chi Litchi Sonn chỉ có một loài trên thế giới là Litchi
chinensis Sonn [20], [12], với 3 loài phụ [8]:
- ssp. chinensis : Được trồng nhiều ở Việt Nam và Nam Trung Quốc.
- ssp. philippinensis: Mọc hoang dại ở Philippin.

Bài 1: Bài thuốc chữa tinh hoàn sưng đau [12], [14].
Hạt vải 49 hạt
Trần bì 36g
Lưu hoàng 16g
Tất cả 3 vị tán nhỏ, dùng nước cơm làm thành viên bằng hạt đậu xanh.
5

Cách dùng: dùng rượu chiêu thuốc, lúc nào đau uống 9 viên.
Bài 2: Bài thuốc chữa đau bụng kinh hoặc sau khi đẻ [8].
Hạt vải đốt tồn tính 20g
Hương phụ 40g
Tán nhỏ, trộn đều.
Cách dùng: Uống với nước muối nhạt hoặc nước cơm, ngày dùng 2- 3 lần, mỗi
lần 8g.
Bài 3: Bài thuốc chữa đau dạ dày [14].
Hạt vải 3g
Mộc hương 2g
Nghiền thành bột.
Cách dùng: Uống với nước, ngày 3 thang.
Bài 4: Bài thuốc chữa răng sưng đau có sâu [8].
Hạt vải sấy khô, tán bột, xát vào răng bị đau nhiều lần trong ngày.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HẠT VẢI HIỆN NAY
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.3.1.1. Thành phần hóa học
Từ dịch chiết ethanol 95%, đã phân lập 7 flavonoid glycoside: Litchioside D,
pinocembrin 7-O-neohesperidoside, pinocembrin 7-O-rutinoside , taxifolin 40-O-β-D-
glucopyranoside , kaempferol 7-O-neohesperidoside, tamarixetin 3-O-rutinoside,
phlorizin [42] và 4 chất sesquiterpene glucosides: Litchiosides A, litchiosides B,
pumilaside A, funingensin A [41]. Một nghiên cứu khác phân lập được một số
anthocyanidin: 2α,3α-epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β-8-catechin); 2α, 3α-

Tác dụng hạ đường huyết
Từ dịch chiết ethanol 50% của hạt Vải, chiết phân đoạn với chloroform, n-
butanol; phần n-butanol chia thành 2 phần: phần tan trong nước (WS), phần không
tan trong nước (WI). Sau đó thử nghiệm tác dụng ức chế α-glucosidase trên in vitro
đối với dịch chiết ethanol 50%, các phân đoạn, phần WS, WI. Kết quả cho thấy:
dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh, phân đoạn n-butanol có tác dụng mạnh
nhất so với các phân đoạn, WI tác dụng mạnh hơn WS [39].
Từ dịch chiết ethanol 70% của hạt Vải, đã phân lập được α-
(methylenecyclopropyl) glycine, sau đó thử tác dụng trên chuột thấy có tác dụng hạ
đường huyết, giảm nồng độ glycogen ở gan [19].
Tác dụng ức chế tyrosinase
Thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase trên in vitro đối với các dịch chiết từ
hạt Vải: ethanol, ethanol 50%, methanol, methanol 50%, nước. Kết quả cho thấy
dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh nhất [27].
1.4.1.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
1.4.1.1. Tác dụng hạ đường huyết
Từ cao chiết ethanol 50% của hạt Vải, thử tác dụng hạ đường huyết trên mô
hình gây tăng đường huyết bằng alloxan ở chuột nhắt trắng với liều uống 1,5g và 3g
8

cao/ kg thể trọng/ ngày (tương đương với 10g và 20g dược liệu khô), trong 8 ngày
liên tục, tác dụng hạ đường huyết ở liều 1,5g cao/ kg thể trọng/ ngày có tác dụng
mạnh hơn [10].


nơi khô ráo.

Hình 2.1. Hình ảnh hạt Vải
2.1.2. Trang thiết bị
- Bếp cách thủy Memmert.
- Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius.
- Tủ sấy Memmert, Shellab.
- Máy cô quay chân không Buchi R – 200.
- Hệ thống chấm mẫu Linomat 5, đèn soi tử ngoại 2 bước sóng 254 nm và 365
nm (CAMAG).
- Máy siêu âm Wise clean (Hàn Quốc).
10

- Máy li tâm PLC-012E.
- Máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems (Đức).
- Kính hiển vi.
- Máy chụp ảnh kỹ thuật số 10.0 mega pixels (Panasonic).
- Thuyền tán.
- Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm.
2.1.3. Hóa chất, dung môi
 Hóa chất sử dụng cho chiết xuất, nghiên cứu hóa học
- Chloroform, ethanol, ethylacetat, n-hexan, n-butanol, methanol, aceton,
toluen, acid formic, acid acetic, acid sulfuric,…được mua tại các công ty hóa chất
đạt tiêu chuẩn phân tích.
- Cồn 96% thực phẩm (Việt Nam).
- Bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F
254
của hãng Merck.
- Các hóa chất, thuốc thử dùng cho định tính sơ bộ thành phần hóa học được
pha chế theo Dược Điển Việt Nam IV (các chuyên luận thuốc thử).

học.
Hạt Vải sấy ở 60
0
C, để nguội, xay thành bột thô (1400/355), cho vào túi nilon
bảo quản nơi khô ráo.
2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học
Mỗi dược liệu có những mô học đặc trưng, được thể hiện một phần ở đặc
điểm bột dược liệu. Nghiên cứu vi học bằng cảm quan và kính hiển vi nhằm tìm ra
một số đặc điểm đặc trưng nhằm định danh, xác định độ tinh khiết của dược liệu.
- Quan sát cảm quan: Nhận định màu sắc, mùi, vị,
- Quan sát bằng kính hiển vi:
+ Quan sát mô tả đặc điểm điển hình (vỏ hạt, phôi, nội nhũ,…).
+ Chọn chất lỏng lên tiêu bản nhằm làm cho đối tượng nghiên cứu trở nên sáng
hơn, rõ hơn [4], [13].
2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.3.1. Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải
a. Nguyên tắc
12

Chiết xuất: Sử dụng các quy trình chiết chuyên biệt dựa vào độ tan của các
chất trong dung môi khác nhau để loại bỏ các yếu tố cản trở phản ứng, che lấp màu
phản ứng, giúp nhận định kết quả [4], [9].
Phản ứng định tính:
- Chọn phản ứng đặc trưng thường là phản ứng màu, phản ứng kết tủa.
- Chọn thuốc thử trong định tính nhóm hợp chất phải đặc hiệu, nhạy, dễ phát
hiện [4], [9].
b. Tiến hành
Định tính xác định một số nhóm hợp chất phổ biến: Alcaloid, glycosid tim,
flavonoid, coumarin, anthranoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử,
polysaccharid, chất béo, sterol, caroten [3], [5], [6].

 Chiết xuất
Bột hạt Vải chiết siêu âm với ethanol 90%. Gộp các dịch chiết lại, cất thu hồi
dung môi, thu được cao ethanol toàn phần. Hòa tan nóng cao ethanol toàn phần với
lượng nước tối thiểu, thu được dịch lỏng. Đem dịch lỏng lắc lần lượt với các dung
môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethyl acetat, n-butanol, với mỗi loại dung
môi lắc kỹ đến khi dung môi nhạt màu thu được các phân đoạn dịch chiết. Dịch
chiết cất thu hồi dung môi ở 60
0
C thu được các cắn tương ứng.
 Định lượng các cắn phân đoạn bằng phương pháp cân
Cắn các phân đoạn đem sấy ở nhiệt độ 60
0
C tới khối lượng không đổi. Xác
định hàm lượng cắn các phân đoạn bằng phương pháp cân.
Công thức tính:
P(%) =
a
M × (1 - h)
× 100 %.
Trong đó:
P là hàm lượng cắn (%).
a là khối lượng cắn (g).
M là khối lượng dược liệu (g).
h là hàm ẩm dược liệu.
 Định tính các phân đoạn
- Định tính các phân đoạn bằng phản ứng hóa học: Định tính các nhóm hợp
chất dựa vào phản ứng đặc trưng với thuốc thử đặc hiệu tiến hành như mục
2.3.3.1.
- Định tính các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng
14

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do dùng để thực hiện phản
ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của hầu hết dược liệu. Hoạt
tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng
cách đo quang ở bước sóng λ= 517nm [15].
 Cơ chế dọn gốc tự do DPPH
Là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển gốc tự do
sang trạng thái ổn định. Như vậy khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ khử gốc tự
15

do DPPH làm cho dung dịch giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm
[36].

 Tiến hành:
Mẫu thí nghiệm gồm: Cao hạt Vải toàn phần, Quercetin (chất đối chiếu)
Hỗn hợp phản ứng:
90 μl DPPH 150 μM (pha trong methanol)
10 μl Mẫu thí nghiệm (pha trong methanol)
Để trong bóng tối 30 phút ở 30
o
C. Sau đó đo giá trị mật độ quang (OD) bằng
máy đọc ELISA của hãng Labsystems tại bước sóng 517nm.
Mẫu thử: Mẫu thí nghiệm pha trong methanol + DPPH.
Mẫu trắng: Mẫu thí nghiệm pha trong methanol.
Mẫu chứng DPPH : DPPH pha trong methanol.
 Tính kết quả
Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH.
HTDG (%)=


×100

+ H
+
+ T
+
→ 2O
2
+ FH.
Trong đó:
MP
+
: 5-methylphenazonium cation của PMS.
MPH: 5,10-dihydro-5-methylphenazine .
T
+
: tetrazolium ion.
FH: Dạng formazan tương ứng của tetrazolium cation.
 Tiến hành:
Mẫu thí nghiệm gồm: Cao hạt Vải, Superoxid dismutase (chất đối chiếu)
Hỗn hợp phản ứng:
1ml NBT 100 μM(pha trong đệm phosphat pH 7,4)
1ml NADH 468 μM (pha trong đệm phosphat pH 7,4)
1ml mẫu thí nghiệm
Phản ứng bắt đầu xảy ra khi cho 100 μl PMS 60 μM (pha trong đệm phosphat
pH 7,4).
Để yên 15 phút. Sau đó đem đo mật độ quang (OD) bằng máy đọc ELISA của
hãng Labsystems tại bước sóng 560nm.
Mẫu thử: mẫu thí nghiệm + hỗn hợp phản ứng chứa NBT, NADH, PMS.
Mẫu trắng: chỉ có mẫu thí nghiệm pha bằng methanol + hỗn hợp phản ứng
chứa NBT, NADH.
Mẫu chứng: methanol+ hỗn hợp phản ứng chứa NBT, NADH, PMS.