Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh viêm gan virus C do virus viêm gan C (Hepatitis C Virus - HCV) gây ra. Hậu
quả trầm trọng nhất của bệnh là tình trạng xơ gan và ung thư gan. Hiện nay trên thế giới
có khoảng 170 triệu người nhiễm HCV và mỗi năm lại có thêm hàng triệu người nhiễm
mới. Khoảng 80% người nhiễm HCV sẽ chuyển sang tình trạng nhiễm mạn tính, trong đó
10 – 20% sẽ chuyển sang xơ gan và 1 – 5% sẽ chuyển thành ung thư gan. HCV còn làm
trầm trọng thêm bệnh viêm gan do các loại virus khác khi đồng nhiễm. Theo đánh giá của
các chuyên gia thuộc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thì bệnh viêm gan virus C là một mối
đe dọa sức khỏe cộng đồng lớn nhất trong thế kỷ này và có lẽ cả ở thế kỷ sau.
HCV lan truyền trong cộng đồng qua con đường truyền máu và các sản phẩm của
máu, quan hệ tình dục, mẹ truyền sang con. Hiện nay, chưa có vaccine để phòng chống
HCV do tính biến động di truyền cao của virus này.
Trước khi quyết định điều trị, việc xác định nồng độ HCVRNA trong cơ thể sẽ
cung cấp các thông tin tiên lượng giúp cho việc quyết định phương cách và thời gian điều
trị. Nếu người bệnh nhiễm HCV type 1 và có nồng độ HCVRNA trong cơ thể lớn hơn
2x10
6
copies/ml máu thì thời gian điều trị là 48 tuần thay vì 24 tuần như các trường hợp
khác.
Theo Phạm Hoàng Phiệt (2000), các biểu hiện lâm sàng, các xét nghiệm chức năng
gan thậm chí cả hình ảnh mô học của gan cũng không cho phép xác định nguyên nhân
gây viêm gan virus C. Việc chẩn đoán nhiễm HCV buộc phải dựa vào các xét nghiệm
sinh học có tính đặc hiệu đó là các kỹ thuật miễn dịch học và các kỹ thuật sinh học phân
tử nhằm phát hiện kháng nguyên, kháng thể và các acid nhân của virus .
Các xét nghiệm miễn dịch hiện nay cho phép phát hiện phần lớn trường hợp nhiễm
HCV mạn tính nhưng hoàn toàn không hiệu quả trong giai đoạn “cửa sổ”. Các kỹ thuật
phân tử, đặc biệt là các kỹ thuật nhân bản vật liệu di truyền với độ nhạy và độ đặc hiệu
cao cho phép phát hiện bệnh sớm và chính xác trước khi kháng thể kháng HCV xuất hiện

Hepatitis C virus (HCV) thuộc họ Flaviviridae, có đường kính 55 – 65 nm. Trọng lượng
phân tử vào khoảng 4.016 Dalton, hệ gen gồm một dây xoắn đơn RNA, nằm bên trong phần
nucleocapsid hình đa diện. Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các protein E1 và E2 (Hình 2.1).
Hình 2.1. Cấu trúc của HCV (www.expertreviews.org/)
Protein E1 (37 kDa) và E2 (61 kDa) là hai glycoprotein của lớp vỏ. Ở protein E2 có hai
vùng siêu biến (HVR: hypervariable region) là HVR1 và HVR2. Vùng siêu biến này thường
xuyên bị biến đổi qua mỗi lần virus nhân đôi tạo ra sự khác biệt giữa các genome của HCV
(Bùi Hữu Hoàng, 2000).
Trong chu kỳ nhân đôi của virus phải sử dụng men RNA polymerase mà men này
không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp RNA từ đó làm cho bộ gen của virus khá
đa dạng nên người ta đã phân lập được nhiều type khác nhau
(www.drthuthuy.com/research/VGClipa.htm).
Theo Bùi Hữu Hoàng (2000), genome của HCV là một chuỗi đơn RNA, gồm khoảng
9400 nucleotide, được chia làm 3 vùng (hình 2.2):
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
3
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hình 2.2. Những protein mã hóa cho bộ gen của HCV (www.expertreviews.org/)
- Đầu 5’ không mã hóa (5' NCR: non-coding region, 5' UTR: untranslated region,
5’NTR: non-translated region) gồm 341 – 344 nucleotide.
- Vùng được mã hóa nằm giữa hai đầu 5’ và 3’. Vùng này chỉ có một khung đọc duy
nhất gồm 9379 – 9481 nucleotide.
- Đầu 3’ không mã hóa gồm: vùng đầu tiên có chiều dài từ 28 – 42 nucleotide, tiếp theo
là vùng poly U hoặc poly A để báo hiệu kết thúc quá trình giải mã.
Cho đến nay, theo Dev (2002) và Mindie H. Nguyen (2004), để thực hiện chính xác
type HCV là phải phân tích trên đoạn Core hoặc NS5B của bộ gen HCV
( />2.1.2. Các loại type và yếu tố nguy cơ nhiễm HCV
2.1.2.1. Các loại type của HCV
Theo Châu Hữu Hầu (2006), các tương đồng trình tự giữa các thành viên của các type
khác nhau là 55 – 72%. Các type được gọi bằng chữ số Ả Rập (type 1, 2…). Việc xếp loại các

(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hstat4.section.22114); điều này phù hợp với một
nghiên cứu ở châu thổ sông Nile, nơi có tần suất viêm gan C mạn khá cao thì nam có nguy cơ
nhiễm viêm gan C mạn cao gấp 2,5 lần nữ (Habib et al., 2001).
Theo Lorenzo Rosaro, M.D Đại học California, những tác nhân ảnh hưởng đến bệnh
viêm gan virus C là: nam, tuổi, HBV và HIV (www.youtube.com/watch?v=kfIu9uQODgQ).
 Tình trạng kinh tế xã hội
Theo Desmond (2000), người càng nghèo tỷ lệ nhiễm HCV càng cao
(www.medscape.com/viewarticle/500414).
 Tuổi
Nhiễm HCV ở người lớn trên 40 tuổi thường có bệnh mạn tính tiến triển nhanh hơn.
Ngược lại, nhiễm dưới 10 tuổi chỉ có 50% nguy cơ phát triển viêm gan C mạn và thường có
bệnh gan nhẹ hơn. Nhiễm HCV tăng theo tuổi. Trẻ em dưới 16 tuổi, nhiễm HCV hiếm gặp ở
các nước đã phát triển nhưng hay gặp ở nhiều vùng Châu Phi và Châu Á. Tại Việt Nam, theo
công trình của Lã Thị Nhẫn, anti-HCV tăng dần theo tuổi: 10 – 19 tuổi là 0,72%; 20 – 29 là
1,54%; 30 – 39 là 3,22%; 40 – 49 là 3,81% và trên 50 tuổi là 11,18%. Nhưng công trình của
Trương Xuân Liên lại không thấy hình ảnh này với tỷ lệ nhiễm anti-HCV theo nhóm tuổi như
sau: dưới 15: 2,6%; 16 – 25: 3,2%; 36 – 45: 1,2% và trên 45: 3,4%. Sự khác biệt này có lẽ do
số liệu nghiên cứu còn ít.
Một nghiên cứu ở Mỹ cho thấy chỉ có 30% trẻ mang anti-HCV (+) là có HCVRNA, cho
thấy tỷ lệ mạn tính của HCV ỏ trẻ em chỉ bằng phân nửa ở người lớn. Điều này khác với viêm
gan B, tỷ lệ trở thành viêm gan B mạn ở trẻ em cao hơn rất nhiều so với người lớn (Châu Hữu
Hầu, 2006).
 Các yếu tố nguy cơ khác
Theo Bùi Hữu Hoàng (2000) và Châu Hữu Hầu (2006), liên quan với các yếu tố nguy
cơ lây truyền bệnh, người ta nhận thấy type 1b thường gặp ở những BN bị nhiễm HCV do
truyền máu, còn type 3a thường thấy ở những BN chích xì ke (bảng 2.2).

Bảng 2.2 Type của HCV và các yếu tố nguy cơ lây nhiễm
Ý (1) Pháp (2,3)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

-
-
-
-
-
103
36%
12%
-
4%
44%
4%
-
-
-
5-10%
41
7%
56%
4%
-
21%
5%
-
-
-
5%
75
11%
65%

7
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hatzakis et al (1996) Hy Lạp 17 3,8 (1,1-14,0)
Donato et al. (1997) Ý 172 2,9 (0,9-10,0)
Theo Châu Hữu Hầu (2006), hành vi tình dục có nguy cơ, trình độ văn hóa thấp, tình
trạng hôn nhân có vấn đề, hút thuốc, uống rượu cũng là các yếu tố nguy cơ. Một nghiên cứu ở
Mỹ nhận thấy tiểu đường type 2 ở người nhiễm HCV cao hơn gần 4 lần người không nhiễm
HCV trên 40 tuổi.
Tuy vậy, khoảng 50% nguồn nhiễm HCV còn chưa được hiểu rõ. Lan truyền trong gia
đình có thể xảy ra nhưng hiếm gặp. Nhiễm virus có thể do dùng chung dao cạo râu, bàn chải
đánh răng, ống tiêm và kim tiêm không vô khuẩn với những người nhiễm virus, tiêm chích ma
túy, châm cứu, cắt lễ (Bùi Đại và cộng sự, 2008).
2.1.3. Cách thức xâm nhập và sinh sản của HCV
2.1.3.1. Cách thức xâm nhập
HCV xâm nhập thẳng vào cơ thể qua đường máu; rồi tấn công tế bào gan và sinh sôi
nẩy nở tại đây. HCV làm cho tế bào gan sưng lên và đồng thời phá vỡ các tế bào gan. Có đến
85% những người bị nhiễm HCV có khả năng trở thành bệnh mạn tính (có nghĩa là 6 tháng
sau khi bị nhiễm, bệnh vẫn không hết). Ða số những người bị viêm gan C mạn tính không thấy
có triệu chứng nào và vẫn có cuộc sống bình thường. Tuy nhiên, trong số 10 – 25% người có
HCV mạn tính, bệnh sẽ âm thầm tiến triển trong khoảng 10 – 40 năm, và có thể làm hư gan
trầm trọng, xơ gan, hoặc ung thư gan ( ).
2.1.3.2. Sự sinh sản của HCV
HCV có thể xâm nhập vào tế bào gan và các tế bào khác như: tế bào đơn nhân máu
ngoại vi và hạch bạch huyết. Tuy nhiên, sự sao chép của HCV chưa được biết nhiều (Châu
Hữu Hầu, 2006).
Theo PG, AKI, Zurich (2002) và Châu Hữu Hầu (2006), HCV xâm nhập vào các tế bào
theo cơ chế nhập bào. Tuy nhiên, sự nhập bào cũng như các thụ thể liên quan chưa được biết
nhiều. Khi HCV vào bên trong, glycoprotein E2 không đủ để dung hợp màng tế bào và một
vùng kỵ nước của glycoprotein E2 được cho là giúp dung hợp vỏ ngoài virus vào màng. Lúc
nhập bào, sự kết hợp của lõi virus với tiểu đơn vị 60S của ribosom vật chủ có thể góp phần

Phi; tỉ lệ nhiễm ở Indonesia là 3,9%; Yemen 6%, Lebanon 0,11%; Ai Cập 21%. Ở các nước
phát triển, HCV là nguyên nhân của 20% các ca viêm gan cấp độ virus , 70% viêm gan ghép
gan (Trần Ngọc Bảo, 2000).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
9
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hình 2.4. Phân bố HCV trên thế giới
(http://international_abbotmolecular.com/HepatitisCDemographics_2562.aspx)
Theo WHO, tình hình nhiễm HCV trên thế giới cho thấy có sự khác nhau nổi bật giữa
các vùng, các nước.
Bảng 2.4. Tình hình nhiễm HCV trên thế giới
Các nước Dân số (triệu) Tỷ lệ nhiễm (%) Số người nhiễm (triệu)
Châu Phi 602 5,3 31,9
Mỹ 785 1,7 13,1
Trung Đông 466 4,6 21,3
Châu Âu 858 1,0 8,9
Đông Nam Á 1.500 2,2 32,3
West Pacific 1.600 3.9 62,2
Tổng 5.811 3,1 169,7
Viêm gan virus C lây nhiễm chủ yếu do tiếp xúc trực tiếp từ máu hoặc các sản phẩm từ
máu của người mang virus C với máu của người bị lây nhiễm. Các đường lây nhiễm khác
chiếm tỉ lệ không đáng kể (Trần Ngọc Bảo, 2000). HCV là tác nhân gây bệnh viêm gan C mạn
tính lây truyền qua đường máu phổ biến nhất ở Mỹ. Theo Trần Ngọc Bảo (2000), xấp xỉ 40%
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
10
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
những ca viêm gan mạn có liên quan đến nhiễm HCV, và ước tính 8.000 – 10.000 người chết
mỗi năm liên quan đến HCV (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hstat4.section.22114;
www.hcvadvocate.org/hepatitis/hepC/Vietnamese_info.htm).
Theo Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát bệnh (Center for Disease Control and

+ Subtype 4c thường gặp ở Trung Phi Châu
+ Subtype 5a chỉ hay gặp ở Nam Phi, nhưng hiếm gặp ở nhiều nơi trên thế giới
+ Subtype 6a giới hạn ở Nam Á (Hồng Kong, Macau và Việt Nam)
+ Subtype 7a và 7b thường gặp ở Thái Lan
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
12
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
+ Subtype 8a, 8b và 9a được tìm thấy ở Việt Nam
+ Subtype 10a và 11a gặp ở Indonesia
Dựa vào phân tích trình tự protein E1 và vùng NS5B, các biến dị HCV mới được tìm
thấy ở Việt Nam, cũng như các nước Đông Nam Á khác được xếp vào các type 7, 8, 9, 10 và
11. Ngày nay, các type 7, 8, 9, 11 được nhập chung vào kiểu 6a và type 10 được xếp chung
với kiểu 3a.
Sự phân bố type theo các vùng địa dư tương đối ổn định. Tuy nhiên, hiện nay do vấn đề
di dân và du lịch xảy ra khá phổ biến cho nên có thể ảnh hưởng phần nào đến bản đồ phân bố
type của HCV trên thế giới.
Các type được nhận diện nhờ vào các phương pháp như: PCR gián biệt, định type huyết
thanh, phương pháp lai ghép đặc hiệu của các subtype, RFLP….
Type HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước có
những type HCV vượt trội riêng (Dev et al., 2002; Doris B. Strader et al., 2004; Eugene R.
Schiff et al., 1999; Johannes Bircher et al., 1999; Mindie H. Nguyen et al., 2004; Hepatitis-
central.com/hcv/genotype).
2.2.2. Tại Việt Nam
Việt Nam là nước nằm trong vùng dịch tễ của virus gây bệnh viêm gan C
(www.drthuthuy.com/research/VGClipa.htm). Theo các số liệu đã được công bố, tỉ lệ nhiễm
HCV ở Việt Nam là từ 4 – 9% (Trần Ngọc Bảo, 2000; Châu Hữu Hầu, 2006). Theo ghi nhận
về tình hình nhiễm HCV thì tỷ lệ người bình thường ở Việt Nam nhiễm HCV là khoảng 5 –
10% (Alter MJ, 1995), xem như là thuộc nhóm các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HCV cao thứ nhì
trên thế giới.
Theo một nghiên cứu của Châu Hữu Hầu tại cộng đồng dân cư huyện Tân Châu, An

hợp
Type
1 (%)
Type 1b
(%)
Type 6a
(%)
Không định type
được (%)
Ghi chú
T.K.Anh. TP
HCM
42 47,6 23,8 0 9,6 Primer-Specific
N.T.Hảo. Hà
Nội
123 69,8 48,8 14,6 2,4 Lipa
Tokita.HCM 83 54 5 Type 6-9: 36%
P.Trimoulet.
Mỹ.1999
11 50 40 50 9 Sequencing. 5’UTR
Mindie H.
Nguyen.USA
308 44,1 ? 14 0
Sequencing.Core.Type 7
(14,3%), 8/9 (3,2%)
Anouk. Dev.
SEA.
70 77 60 10 0 Sequencing.Core.Type 1b:
36% là type 7,8, type 9: 10%
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
16
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Hình 2.8. Diễn tiến nhiễm HCV
( />2.3.2. Những triệu chứng của bệnh viêm gan virus C
2.3.2.1. Viêm gan C cấp tính
Những BN nhiễm HCV nhưng có hệ miễn dịch tốt thường bệnh sẽ chuyển sang dạng
nhiễm cấp. Hầu hết BN nhiễm cấp thường không có triệu chứng, tuy nhiên 25 – 35% những
BN nhiễm có những triệu chứng như: cúm, mệt mỏi, buồn nôn, ăn không ngon hoặc đau bụng.
Những BN cũng có thể có biểu hiện vàng da (Adrian, 2009).
2.3.2.2. Viêm gan mạn tính
Khoảng 85% BN duy trì tình trạng viêm gan C cấp sau 6 tháng và trở thành mạn tính.
Một nghiên cứu trên 90 người nhận máu đã nhiễm HCV cho thấy rằng 77% BN (+) cả với
anti-HCV và HCVRNA. 17% BN chỉ có anti-HCV và 7% không có dấu hiệu phân tử hoặc
huyết thanh học về nhiễm HCV sớm hơn. Điều này có nghĩa 23% BN đã khỏi bệnh hoàn toàn.
Tỷ lệ viêm gan mạn ở nữ thấp hơn nam và có sự tương quan tỷ lệ nghịch về tuổi (Adrian,
2009).
2.4. Xét nghiệm đặc hiệu chẩn đoán bệnh viêm gan virus C
2.4.1. Các xét nghiệm sinh hóa
2.4.1.1. Tăng aminotransferase trong nhiễm HCV
Aminotransferase được dùng thường nhất và là chỉ thị đặc hiệu của hoại tử tế bào gan.
Các enzyme này bao gồm:
+ Aspartate aminotransferase (AST, SGOT): có ở nhiều mô khác nhau: tim, cơ
vân, thận, não và gan. Trong gan, AST hiện diện ở ty thể và phần bào tương tế bào.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
17
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
+ Alanine aminotransferase (ALT, SGPT): chủ yếu ở trong gan và trong phần
bào tương tế bào.
Các enzyme này chuyển nhóm α–amino của aspartate và alanine thành nhóm α–keto

Aminotransferase giảm xuống nhanh có thể do số lượng tế bào gan còn sống giảm và
đây là một tiên lượng xấu trong viêm gan bạo phát. Aminotransferase tăng cao có thể là bằng
chứng đầu tiên của bệnh gan và việc sàng lọc là cần thiết nhằm phát hiện bệnh gan dưới lâm
sàng. Bởi vậy, BN có mức amintransferase bình thường vẫn có thể có tổn thương gan nặng.
Tỷ suất AST/ALT có thể hữu ích trong chẩn đoán:
+ AST/ALT > 2: bệnh gan do rượu. Lý do tăng AST do với ALT có thể do thiếu
hụt một đồng yếu tố, đó là pyridoxine-5-phosphate. Thực vậy, khi BN bệnh gan do rượu uống
đồng yếu tố này thì thấy ALT huyết thanh tăng.
+ AST/ALT ≤ 1: bệnh gan ứ mỡ không do rượu thường có ALT lớn hơn AST.
Trong viêm gan virus, tỷ suất AST/ALT thường ≤ 1 nhưng có thể tăng > 1 khi có xơ gan.
2.4.1.2. Bilirubin trong nhiễm HCV
Bilirubin là anion hữu cơ nội sinh có nguồn gốc chủ yếu từ sự thoái biến hemoglobin
của hồng cầu. Tăng bilirubin huyết được xếp vào hai loại: liên kết hay không liên kết.
+ Bilirubin liên kết: ở BN tăng bilirubin huyết do rối loạn chức năng tế bào gan hoặc ứ
mật, và vì tan trong nước, cho phép bài tiết dễ dàng qua thận.
+ Bilirubin không liên kết: tăng bilirubin huyết quá cao (> 25mg/dL) thường giải thích
cho bệnh gan nặng kết hợp với một nguyên nhân tăng bilirubin huyết không liên kết (như bệnh
tan máu).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
18
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
2.4.1.3. Albumin huyết thanh trong nhiễm viêm gan virus
Albumin là một protein lưu thông quan trọng nhất được tổng hợp bởi gan, chiếm ¾ áp
lực thẩm thấu dạng keo của huyết tương. Gan là nơi tổng hợp duy nhất với khoảng 12-15 gam
mỗi ngày ở người lớn khỏe mạnh. Nồng độ albumin huyết tương giảm xuống ở bệnh gan cấp
nặng và bệnh gan mạn và là một trong các tiểu chuẩn xếp loại của Child-Pugh được dùng để
phân độ xơ gan. Mặt khác, giảm albumin máu có thể do rối loạn tiêu hóa, rối loạn chức năng
thận, biến đổi kích tố, tăng thoái biến và tăng γ globulin huyết, có thể ức chế tổng hợp
albumin.
2.4.1.4. Thời gian protromblin (PT) và các yếu tố đông máu trong nhiễm

 Kỹ thuật NASBA (nucleic acid sequence based amplification)
Là kỹ thuật khuếch đại trực tiếp RNA của virus ở nhiệt độ thường. Thực tế khi sử dụng
với virus C không cho kết quả như mong muốn nên còn ít được sử dụng. NASBA đã được
dùng để phát hiện HIV với độ nhạy cao và độ tin cậy lớn.
 Kỹ thuật LCR (ligase chain reaction)
Là kỹ thuật chuyển RNA của virus sang cDNA và cũng dùng mồi và các chu kỳ nhiệt
tương tự như PCR nhưng enzyme để nhân DNA lên là DNA ligase. Kỹ thuật bị giới hạn về độ
nhạy và tính đặc hiệu nên chưa được ứng dụng nhiều.
 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)
Đây là kỹ thuật mà RNA đích phải được phiên mã ngược thành cDNA, rồi sau đó sẽ
dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự
này. Kỹ thuật RT-PCR dùng để phát hiện RNA của virus C với độ nhạy cao có thể cho kết quả
dương tính với 100 đến 1000 bản sao RNA trong 1ml (Phạm Hoàng Phiệt, 2000).
Ngày nay, một số nhà sản xuất đã thành công tạo các bộ kit chẩn đoán các bệnh dựa
vào kỹ thuật RT-PCR. Trong đó, có bệnh viêm gan virus C, B, bệnh sốt xuất huyết Dengue…
 Nhóm kỹ thuật khuếch đại tín hiệu: kỹ thuật DNA nhánh
Kỹ thuật bDNA (branched DNA) có hạn chế là độ nhạy thấp hơn, mức phát hiện là
khoảng 200.000 bản sao/ml. Bởi lý do này nên không dùng để chẩn đoán (sót các trường hợp
lượng virus thấp: âm tính giả) cũng như theo dõi đáp ứng sau điều trị (âm tính chưa đảm bảo
có đáp ứng về virus ). Tuy nhiên kỹ thuật bDNA áp dụng vào định lượng virus có độ lặp lại
và độ chính xác cao.
2.4.2.2. Định lượng virus C bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR
Theo Phạm Hoàng Phiệt (2000), các thử nghiệm phát hiện kháng thể (cả EIA và RIBA)
không cho phép ước định lượng virus, kỹ thuật phát hiện kháng nguyên hiện chưa được áp
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
20
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
dụng trong thực tế nên kỹ thuật sinh học phân tử có vị trí độc tôn trên lãnh vực này. Cả hai
nhóm kỹ thuật: khuếch đại mục tiêu và khuếch đại tín hiệu đều có thể dùng để định lượng
virus .

 Định type HCV bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR
 Phương pháp Realtime PCR
Taqman probe được gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) ở đầu 5’ và một chất dập
tắt (quencher) ở đầu 3’ sao cho tín hiệu huỳnh quang của chất phát huỳnh quang bị hấp thu bởi
chất dập tắt. Trong bước bắt cặp và kéo dài mạch của một chu kỳ PCR, Taqman probe đặc
hiệu cho một type HCV sẽ bắt cặp với mạch bổ sung của trình tự tương ứng. Hoạt tính 5’-3’
exonuclease của Taq polymerase trong phản ứng sẽ loại bỏ nucleotide ở đầu 5’ có gắn chất
phát huỳnh quang của Taqman probe. Chất này tách rời khỏi probe, không còn chịu tác động
của chất dập tắt và sẽ phát huỳnh quang.
Các Taqman probe đặc hiệu cho từng type HCV sẽ được đánh dấu bằng các chất phát
huỳnh quang khác nhau (Cy5, VIC, TAMRA, FAM, HEX…). Mỗi tín hiệu huỳnh quang đặc
hiệu sẽ đánh dấu sự có mặt của một type HCV trong mẫu thử.
 Định type HCV bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR
Kit HCV định type dựa trên kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman đặc
hiệu cho HCV. Một cặp mồi được thiết kế trong vùng 5’ không mã hóa của bộ gen HCV để
nhân bản một trình tự mục tiêu có kích thước 103 cặp base. Phản ứng Realtime PCR còn sử
dụng thêm mẫu dò Taqman đặc hiệu cho các type HCV 1, 2 và 6 được đánh dấu huỳnh quang.
Mỗi bản sao của trình tự mục tiêu được nhân bản tương ứng với một tín hiệu huỳnh quang. Tín
hiệu này sẽ được đầu dò của máy ghi nhận. Như vậy, số lượng bản sao trình tự mục tiêu HCV
tạo ra ở từng thời điểm sẽ được ghi nhận chính xác trong suốt quá trình PCR. Dựa vào một
đường cong chuẩn thiết lập với những hàm lượng bản sao HCV xác định, có thể tính được số
bản sao HCV hiện diện trong mẫu ban đầu và xác định chính xác các type HCV.
CHƯƠNG III
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
22
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Dụng cụ, thiết bị
Máy ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút dùng cho tube 1,5 ml, tủ thao tác vô trùng, máy

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT
Chọn mẫu toàn bộ những BN theo tiêu chuẩn chọn mẫu trong thời gian từ 1/2009 đến
8/2010.
3.2.4. Cách chọn mẫu
- Chọn mẫu nghiên cứu ngẫu nhiên không xác suất.
3.2.5. Các biến số cần thu thập
+ Thông tin chung về bệnh nhân: tuổi, giới, địa dư.
+ Dấu hiệu lâm sàng của BN khi được chẩn đoán.
+ Xét nghiệm anti-HCV (+).
+ Các xét nghiệm cận lâm sàng (AST, ALT, GGT).
+ Tỷ lệ HCV-RNA (+) và (-).
+ Nồng độ của HCVRNA.
+ Type HCV trên BN
3.2.6. Cách thu thập số liệu
+ Phỏng vấn bệnh nhân trực tiếp
+ Ghi nhận kết quả anti-HCV (+)
+ Tiến hành kỹ thuật Realtime RT-PCR định lượng và định type HCV tại phòng thí
nghiệm SHPT, khoa Vi sinh, BVĐKTWCT.
3.2.7. Các bước tiến hành kỹ thuật Realtime RT-PCR
- Rút máu
Rút 1ml máu cho vào ống nghiệm
- Ly trích huyết thanh
Mẫu máu được quay ly tâm 1.500 vòng/phút/15 phút. Sau đó, tách huyết thanh và tiến
hành làm các xét nghiệm cần thiết.
- Kỹ thuật Realtime RT-PCR định lượng và định type HCV
Định lượng hay định type HCV đều cần tiến hành 2 giai đoạn chung là: tách chiết RNA
và thực hiện phản ứng RT. Sau khi thực hiện kỹ thuật RT, dùng sản phẩm cDNA này tiến hành
kỹ thuật Realtime PCR định lượng hoặc định type HCV.
3.2.7.1. Tách chiết RNA
+ Chuẩn bị tube eppendorf 1,5ml và đánh dấu bằng ký hiệu mẫu

+ Đánh dấu các tube bằng ký hiệu mẫu.
+ Cho 8 µl RT-Mix vào 1 tube RT-Tube
+ Cho tiếp 15 µl chứng (+), chứng (–) hoặc dịch RNA tách chiết vào tube.
+ Đậy nắp tube thật kỹ và đặt vào máy PCR.
+ Sinh tổng hợp cDNA được thực hiện trên máy PCR với quy trình 25
0
C/5 phút,
42
0
C/30 phút và 85
0
C/5 phút, giữ ở 4
0
C.
+ Sản phẩm cDNA sẽ được sử dụng trong phản ứng khuếch đại gen.
3.2.7.3. Phản ứng Realtime RT-PCR định lượng HCV
+ Định lượng HCV bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng Taqman probe.
+ Cho 2,5µl dịch cDNA từ phản ứng RT ở trên vào từng tube
iVA
HCVqPCR mix.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
25