BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGHIÊN CỨU ĐỘC ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG
TRÊN KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT THựC NGHIỆM CỦA
DẪN XUẤT ARTEMISININ GẮN FLUOR
( KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHÓA 2000- 2005 )
Người hướng dẫn : TS. NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG
TS. TRƯƠNG VĂN NHƯ
Nơi thực hiện ; VIỆN SỐT RÉT KST - CT TW
Thời gian thực hiện : 10/2004 - 4/2005
HÀ NỘI 5- 2005
í è s € ẩ m ( 0 M
(Đểẩạt được những quả trong quá trình nghiên cứu ểề tài nảy, tồi ấã
ấược các thầy cô ßido ẫưóng ấẫn chi sảo nũỉệt tìníi. Vói ßnß ^n fi trọng và
Siết ơn sâu sắc, tôi jận chân tíiành cầm ơn:
Ts. 9i£uyen Xuân Thtdnß
‘25’. Trươtĩ£ Văn íNíiư
Là nẫững người trực tữ ị hưóng cC ẩ n tôi trong quá trình tdực íiiện ^ o ấ
íuận này.
‘Toi jận cíiân tíiành cảm ơn các tdầy cô, anh cfd nßimn cứu, ^ tíiuật
vừn tại Viện Sốt %ySinH ‘Trùng Côn Tninß Trung Vơng, Sộ môn ấược
[ý, các Sộ môn và cácpãòng San trường đại học (Dược !Hâ !Nọi đã tận tìníi
fiu0nß dẫn, ßitip đõ và tạo ấ i ề u tíiuận Cợi cho tôi hoàn thàníi ^ o á Cuận
tốt ngßiäp nảy.
Xin cầm ơn cíia mẹ, người tẫân và Sạn Sè ấãgiúp đd, ấộng viên tồi trong
suốt quá trìníi tíiực hiện đề tài này.
Hà Nội ngày 27 tháng 5 năm 2005
SinH vữn: (Đô ĩCữu ‘Tài
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
- KSTSR
- BNSRAT


4
1.2.1. Nguồn gốc, cấu trúc và tích chất của artemisinin
4
1.2.2. Một số dẫn xuất của artemisinin 4
1.2.3. Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin và dẫn xuất 5
1.2.4. Cơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất

5
1.2.5. Nhược điểm của artemisinin và các dẫn xuất
6
1.3. Tình hình nghiên cứu dẫn xuất artemisinin gắn fluor

7
1.3.1. Sơ lược qui trình tổng hợp các dẫn xuất artemisinin gắn fluor 7
1.3.2. Đặc điểm và quá trình nghiên cứu các dẫn xuất artemisinin gắn
fluor 8
1.4. Các kỹ thuật liên quan đến nghiên cứu

12
1.4.1. Kỹ thuật nghiên cứu in vitro 12
1.4.2. Kỹ thuật nghiên cứu in vivo
13
Phần 2.Thực nghiệm và kết quả
.
14
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 14
2.1.1. Nguyên vật liệu 14
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 14
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 18

rét. Trong khuôn khổ công trình nghiên cứu hcfp tác giữa Viện SR KST- CT
TW và nhóm nghiến cứu CNRS- BIOCIS, Khoa dược, Đại học Paris XI,
Chatenay- Malabry 92296, France về đề tài “ Tổng hợp và phát triển tiền lâm
sàng các dẫn xuất gắn flúor”, chúng tôi thực hiện một phần nhánh đề tài:
''Nghiên cứu độc tính cấp và đánh giá tác dụng trên ký sình trùng sốt rét
của dẫn xuất artemisinin gắn flúor BB 134” với mục tiêu:
1. Xác định độc tính cấp (LD50) của BB 134.
2. Đánh giá tác dụng trên KSTSR p. falciparum nuôi cấy và trên
chuột nhắt trắng nhiễm KSTSR p. bergei của chất BB 134.
PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam
1.1.1.Tình hình sốt rét trên thế giới:
Ngày nay trên thế giới sốt rét (SR) vẫn là một bệnh truyền nhiễm phổ
biến, ảnh hưởng rất lớn đến sức khoẻ con người cũng như sự phát triển kinh tế
xã hội của các nước trên thế giói. Bệnh SR phân bố rộng khắp tất cả các vùng
trên thế giới nhưng chủ yếu tập trung ở vùng khí hậu nhiệt đói và cận nhiệt đới
như: các nước phía nam sa mạc Sahara, Đông Nam Á, Ấn Độ, Châu Đại
Dương, Trung và Nam Mỹ [24]. Hiện nay SR lưu hành ở hơn 100 quốc gia và
vùng lãnh thổ, mỗi năm có từ 300 - 500 triệu ngưctì mắc SR và khoảng 1 -1,5
triệu người tử vong vì SR [29, 30].
WHO đã đề ra chiến lược thanh toán SR toàn cầu vào năm 1955 với việc
kết hợp sử dụng DDT diệt muỗi, sử dụng thuốc chống SR và giám sát chặt chẽ
dịch bệnh. Tuy nhiên chỉ sau đó vài năm dịch bệnh lại bùng phát trở lại [23].
Nguyên nhân chủ yếu gây bùng phát trở lại của dịch SR trên thế giới là
do sự gia tăng kháng thuốc của KSTSR, đặc biệt là KST p. falciparum. Chủng
KST p. falciparum không chỉ kháng chloroquin mà còn kháng nhiều loại
thuốc khác như hỗn hợp pyrimethamin- sulfadoxin, giảm nhạy với quinin,
mefloquin. Những vùng có tỷ lệ kháng cao là Thái Lan, Việt Nam,
Campuchia, vùng Amazon của Nam Mỹ và đang gia tăng ở Đông Phi [21].
Chính sự kháng thuốc hiện nay đang là một trở ngại lớn cho công tác phòng

50
2003
164.706 423
2
50
Việc bùng phát SR ở nước ta như vậy nguyên nhân chủ yếu cũng là do
KSTSR kháng thuốc đặc biệt là p . falciparum. Năm 1961 đã phát hiện KSTSR
p. falciparum kháng chloroquin tại Nha Trang , cho đến năm 1995 đã xác
định p. falciparum kháng chloroquin tại 100% vùng SR ở các tỉnh miền Nam
và lan rộng ra nhiều tỉnh miền Bắc [16]. KST p. falciparum đã kháng
chloroquin và hầu hết các thuốc điều trị sốt rét khác như: hỗn hcfp sulfadoxin-
pyrimethamin, primaquin, quinin Đối với artemisinin và các dãn xuất như
artesunat, dihydroaitemisinin, chưa thấy hiện tượng kháng thuốc nhưng
trong điều trị thường xảy ra tái phát với tỷ lệ khá cao như artemisinin; tái phát
36,9% [11], artesunat liệu trình 5 ngày: tái phát sớm khoảng 30% [13]. Tình
hình KSTSR kháng thuốc ở Việt Nam ngày càng phức tạp và lan rộng. Chính
vì vậy việc nghiên cứu và tổng hợp ra những thuốc diệt KSTSR kháng thuốc
trong thời điểm hiện nay là rất cần thiết.
1.2. Tình hình nghiên cứu artemisinin và các dẫn xuất
1.2.1. Nguồn gốc, cấu trúc và tích chất của artemisinin
Artemisinin là một hoạt chất chống SR được chiết xuất từ cây Thanh hao
hoa vàng tên khoa học là Artemisia annua L., họ cúc Arteraceae.
Artemisinin có công thức phân tử là CjsHjiOj, với công thức cấu tạo
đươc xác đinh như sau:
15 C H 3
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của artemisinin
Artemisinin là 1 sesquiterpen lacton có cầu peroxid nội phân tử, trong đó
hoạt tính chống SR chủ yếu dựa vào cầu peroxid này. Trong công thức trên
vòng A là dạng cycloxan, vòng D là vòng lacton, còn vòng B và c đều là dị
vòng bão hoà trong đó vòng c là một trioxan, dạng có liên quan đến hoạt tính

giao bào p. falciparum khi non (ở nồng độ gấp 1 00- 1000 nồng độ diệt thể vô
tính) và không có tác dụng với thể tiền hồng cầu cũng như với thoa trùng. Do
đó trong điều trị artemisinin và các dẫn xuất thường được kết hợp vói các loại
thuốc khác như: primaquin nhằm diệt hết các thể của KSTSR.
1.2.4. Cơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất
Theo Meshnick, artemisinin và các dẫn xuất đều có một cơ chế tác dụng
chung, đó là thông qua cầu peroxit nội phân tử (hình 1.3). Khi vào máu thuốc
gắn với hemozoin- dạng polymer của hem được tích luỹ trong các không bào
tiêu hoá sau khi KST sốt rét tiêu hoá hemoglobin, hemozoin (có chứa Fe^"^)
khử nhóm peroxit tạo ra các gốc tự do. Chính các gốc tự do này gây ra các tổn
hại tế bào KST sốt rét như: peroxy hoá lipid, oxy hoá protein, alkyl hoá
protein, và tiêu diệt chúng [28]. Do hemozoin là sản phẩm của KSTSR sau
khi tiêu hoá Hb nên thuốc chủ yếu tập trung trong các hồng cầu nhiễm. Điều
này giải thích tại sao nhóm thuốc này lại diệt KST sốt rét nhanh hơn hẳn các
nhóm thuốc trước đó. Cơ chế tác dụng này được củng cố thêm nhờ rất nhiều
thí nghiệm như sự ức chế tác dụng của thuốc bằng các chất khử (phá huỷ cầu
peroxit) như: a - tocoferol, vitamin c, trái lại các chất ức chế tổng hợp
glutathion lại tăng cường tác dụng của thuốc. Ngoài ra, nghiên cứu cấu trúc p.
falciparum còn cho thấy các tổn thương của KST ở không bào tiêu hoá, ti lạp
thể và màng tế bào [28].
H^c
Activatmn
Fe
(fre® or
h#rri©-boynci)
(fr®# radical m
@iectrophiỉỉc
intermediate)
A lkvtn tton
lyialaria target

: 16-piperazinoethanol 10a-trifluormethyl-
anhydrodihydroaitemisinin (BB 134)
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của các dẫn xuất artemisinin gắn fluor [24]
Để tổng hợp ra các dẫn xuất artemisinin gắn fluor, từ BB 101 người ta
loại nước tạo ra 10-trifluoromethyl anhydrodihydroartemisinin, từ đó tổng hợp
ra các dẫn xuất khác theo sơ đồ sau:
\
H,c
NBS
I
lÒỊ 16
CF,
Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất artemisinin gắn Flour [24]
1.3.2. Đặc điểm và quá trình nghiên cứu các dẫn xuất artemisinin
gắn flúor
Để khắc phục nhược điểm kém bền tại vị trí Cjo của artemisinin và các
dẫn xuất trước các nhà khoa học đã tìm cách thay thế nhóm -C=0, nhóm
acetal và hemiacetal ở Cio bẵng các nhóm chức bền vững hơn nhằm tăng độ
bền với các enzm oxy hoá và ngăn cản sự thuỷ phân của acid dạ dày đối với
thuốc.
Trong các nghiên cứu ban đầu, các nhà khoa học tiến hành thay thế các
liên kết kém bền với chuyển hoá là c=0 (artemisinin), C-O (acetal và bán
acetal) tại Cio bằng liên kết C-C bền vững hcfn. Kết quả cho thấy rằng một
loạt các dẫn xuất của artemisinin chứa liên kết C-C ở vị trí c 10 (dẫn xuất
không acetal) có độ bền gấp 15 đến 20 lần so với những dẫn xuất cùng loại có
chứa nhóm acetal -C-O ở vị trí Cio trong điều kiện thí nghiệm axit gần giống
trong dạ dày. Dưới đây là kết quả cho thấy điều đó [20].
Bảng 1.2. Độ ổn định của các dẫn xuất artemisinin dạng acetal C-O và
không acetal C-C trong dung dịch acid lmg/ml(HCl 0,01N; pH=2,0;37‘*C)
Hợp Chất

9H3
H+
Hình 1.6. Cơ chế proton hoá của acid dịch vị [24].
Theo sơ đồ trên, do nhóm -CF3 là nhóm hút điện tử nên nó ngăn cản quá
trình proton hoá của acid dịch vị tại vị trí Cjo, do đó tăng cường độ bền vững
của nhóm dẫn xuất này trước tác động của acid dịch v ị.
Như vậy với việc gắn nhóm -CF3 bền vững vói chuyển hoá sẽ làm tăng độ
bền của thuốc trước các tác nhân thuỷ phân và oxy hóa góp phần làm tăng
SKD, giảm thời gian hấp thu thuốc và giảm các tác dụng gây độc đối với thần
kinh [24]. Nhiều thử nghiệm ban đầu trên BB 101 đã được tiến hành tại Pháp
cũng như Việt Nam cho thấy những ưu điểm đặc biệt của chất này trên
KSTSR cả in vitro và in vivo.
Thử nghiệm tại Pháp cho thấy BB 101 không có dấu hiệu độc thần kinh
đối với chuột thí nghiệm. Còn thử tác dụng in vivo và in vitro BB 101 cho tác
dụng hơn hẳn DHA và các dẫn xuất của chúng trên cả đường uống và đường
phúc mạc [24].
Tại Việt Nam, BB 101 đã được thử nghiệm tại Viện sốt rét - KST- CT
T ư năm 1999. Kết quả nghiên cứu cho thấy BB 101 có tác dụng diệt KST
mạnh và nhanh hơn artemisinin (ART). Nồng độ ức chế 50% KST phát triển
(IC50) là 4,4 nmol/1 với chủng nhạy chloroquin và 4,6 nmol/1 với chủng kháng
chloroquin, nồng độ này thấp hơn ART 3 lần. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
của BB 101 là 10 nmol/1, thấp hơn MIC của ART 3 lần. Trên chuột nhắt trắng
nhiễm
p. berghei BB 101 có tác dụng với liều 50 mg/kg, 100% chuột sạch
KST sau 24 giờ điều trị và tỷ lệ khỏi bệnh 100%, chưa thấy KST tái phát
trong vòng 60 ngày đối với cả chủng nhạy và kháng chloroquin [2 0 ]
Tuy nhiên điểm hạn chế của BB 101 là vẫn còn nhóm methyl tại Cj6, do
đó độ tan của BB 101 kém, điều này sẽ ảnh hưởng tới SKD của thuốc, đặc biệt
khi dùng đưòỉng uống. Để khắc phục nhược điểm này các nhà khoa học Pháp
đã tiến hành gắn các nhóm thế khác nhau vào vị trí Cj6 nhằm cải thiện độ tan

0,5 37
5/5
Bảng 1.5. Thử in vivo đối với chủng kháng chỉoroquỉn p. bergei N trên
chuột nhắt trắng theo đường uống
Hợp Chất
ED5Q
(mg/kg)
ED9Q
(mg/kg)
Tỷ lệ giảm mật độ KST ở ngày
thứ 4 với liều lOmg/kg (%)
Artesunat
2 , 8 10,5
90
BB 134
< 1 0
< 1 0
1 0 0
Bảng 1.6. Các thông số dược động học thử nghiệm trên chuột cống với
liều tiêm tĩnh mạch 1 0 mg/kg hoặc đường uống 50 mg/kg
Các thông số dược động học
Artemether BB 134
T i/2 (ph)
52,2 ± 5,8
55,3
Cl (ml.ph'\kg'^)
114,1 ±20,6
148,7
V, (L.kg-1)
8,4 ± 1,7

RPMI). Nhờ phương pháp này mà nhiều chủng p. falciparum nhạy và kháng
trên thí nghiệm được duy trì liên tục nhằm phục vụ nhu cầu nghiên cứu in
vitro [27].
Kỹ thuật đánh giá hoạt tính của thuốc in vitro, hai kỹ thuật hay được
dùng phổ biến hiện nay là kỹ thuật microtest của WHO do Rieckemann cải
tiến từ kỹ thuật macrotest và kỹ thuật thử đáp ứng của Thaithong- Beale. ư u
điểm của kỹ thuật microtest là lượng máu thử ít và rất tiện lợi khi lấy máu để
nuôi cấy( mỗi thử nghiệm chỉ cần khoảng 50ụ 1 máu chứa p . falciparum) [26].
Kỹ thuật nghiên cứu của Thaithong- Beale (ra đời năm 1981, hoàn thiện vào
năm 1983) cũng được sử dụng khá phổ biến trong việc thử đáp ứng của thuốc
trên KSTSR, Các chỉ số đánh giá trong thử nghiệm in vitro là IC50 (Inhibitory
Concentration 50%- nồng độ ức chế 50% KST phát triển) và MIC (Minimum
Inhibitory Concentration- nồng độ tối thiểu ức chế KST phát triển).
1.4.2. Kỹ thuật nghiên cứu ỉn vivo
Đây là phương pháp thử tác dụng của thuốc đối vói KSTSR trên động vật
gây SR thực nghiệm. Trong lịch sử nghiên cứu in vivo có rất nhiều chủng
KSTSR gây bệnh trên động vật đã được ứng dụng để nghiên cứu về thuốc SR.
Phổ biến nhất là KSTSR gây bệnh ở loài lông vũ (do Danilevski tìm ra năm
1890), KSTSR gây bệnh trên chuột (do Vinke và Lips tìm ra năm 1948) và
trên khỉ (Maier phát hiện ra năm 1907). Mở đầu cho nghiên cứu trên mô hình
SR thực nghiêm là thử thuốc trên p.relictum à ngan do Poehl đề xuất năm
1926 [19]. Cho đến nay chủ yếu chỉ có 3 loại vật chủ trên (lông vũ, chuột, khỉ)
được sử dụng trong nghiên cứu. Tuy nhiên mô hình nghiên cứu trên
Plasmodium bergei ờ chuột vẫn được sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu
hiện nay do sự đơn giản, thuận tiện và kinh tế của nó. Mô hình này còn tỏ ra
hiệu quả hơn khi các nhà khoa học đã phân lập thành công các chủng p.
bergei kháng chloroquin trong phòng thí nghiệm. Điều này góp phần rất quan
trọng trong quá trình nghiên cứu các thuốc SR mới khi mà hiện nay ngày càng
xuất hiện nhiều chủng p . falciparum kháng chloroquin trong quá trình điều trị
SR.

giữa các liều là 50 mg/kg.
Theo dõi các triệu chứng và dấu hiệu của chuột, tính số chuột chết trong
thời gian 72 giờ.
Từ số liệu tính số chết trung bình giữa 2 liều kế tiếp, tỷ lệ % chết. Từ đó
tính LD50 và sai số chuẩn theo công thức;
Ea-d
LD.n = LD,
ntb
J
k sd
n
rijj,: Số chuột thử trung bình mỗi nhóm.
a: số chuột chết trung bình của 2 nhóm liên tiếp,
d: khoảng cách giữa các liều.
k: hằng số Behrens- Karber bằng 0,564
s: phân phối chuẩn, s =
Trong đó LDg4 và LDịộ được xác định thông qua đồ thị tỷ lệ chết- liều
thử.
* Thử tác dụng in vitro của BB 134 trên chủng KST Plasmodium
falciparum nuôi cấy
- Nuôi cấy KST p. falciparum dài ngày bằng phương pháp bình nến
Träger- Jensen:
+ Chuẩn bị môi trường đầy đủ: cho thêm vào môi trưòrng nuôi cấy
(RPMI + glucose + nước cất) dung dịch natri bicarbonat 5% (40|al/ml môi
trường), gentamycin (40|al/ml môi trường) và huyết thanh với nồng độ 10-
15% tuỳ theo nhu cầu.
+ Chuẩn bị HC: HC được rửa 2 lần bằng môi trường không có huyết
thanh và lần thứ 3 bằng môi trường đầy đủ. Tiếp đó pha thành dịch treo 50%,
bảo quản ở 4°c.
+ Chuẩn bị HC nhiễm: Máu nhiễm KST p. falciparum được rửa như

(Wemsdorfer) để tính IC50.
• Sau 72 giờ cũng kéo lam giọt mỏng và tiến hành như trên để
xác định MIC.
+ Các chỉ số đánh giá:
• Xác định IC50 (Inhibitory Concentration 50%- nồng độ ức
chế 50% KST phát triển):
_ (MĐ KST mẫu chứng-MĐKST mẫu thử)
—
.

.
I I X IUU( /€>)
MĐKSTmẫuthử
• Xác định MIC (Minimum Inhibitory Concentration- nồng độ
ức chế tối thiểu).
* Thử tác dụng của BB 134 đối vói chủng KST Plasmodium bergei
trên chuột nhắt trắng.
Đánh giá tác dụng của BB 134 trên mô hình chuột trắng nhiễm p. bergei
dựa theo phương pháp in vivo test 28 ngày của tổ chức y tế thế giới (WHO).
- Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành các lô khác nhau,
- Gây nhiễm KST p. bergei cho chuột nhắt bằng đường phúc mạc, mỗi
chuột 0,2 ml hồng cầu nhiễm KST p. ¿ergezjjtumg ứng với lOx íò^:^
- Sau 24 giờ gây nhiễm, chuột được xét nghiệm máu (ngày No). Tiếp đó
cho chuột uống thuốc với các phác đồ như sau:
Thí nghiệm I: vói liều 50mg/kg X 5 ngày
+ Lô đối chứng: uống dung môi gôm arabic 1%, số chuột =10 con.
+ Lô điều trị bằng aitesunat: 50mg/kg X 5 ngày, số chuột = 10 con.
+ Lô điều trị bằng BB 134 : SOmg/kg X 5 ngày, số chuột =10 con.
Thí nghiệm II: với liều lOOmg/kg X 3 ngày
+ Lô đối chứng: uống dung môi gôm arabic 1%, số chuột =10 con.

(mg/kg)
SỐ
chuột
thử
ntb
SỐ
chuột
chếit
Hiệu 2
liều kế
tiếp
(d)
Số chết
trung
bình2
iiều kế
tiếp
(a)
Tích sô
(a.d)
Tỷ lệ
%
chết
1 1 0 0 1 0
0
- -
0
2 150
1 0
1 50 0.5

LD50 = 288,55 ± 11.08 (mg/kg).
- Kết quả này cho thấy độc tính của BB 134 cao hofn so với các dẫn
xuất khác của artemisinin đang sử dụng trong điều trị.
Hình 2 .1 . Hình ảnh chuột chết khỉ uống BB134 liều 500mg/kg(chết 100%)
Hình 2.2. Hình ảnh chuột chết khỉ uống BB 134 liều 350mg/kg (chết 70%)
2.2.2. Thử nghiệm ỉn viừ‘0 trên Plasmodium falciparum nuôi cấy
Sau khi pha mỗi thuốc thành dãy nồng độ là:
1.25 X 10-®; 2.5 X 10'^; 5 X 10'^; IQ-*; 2 X 10'^
Chúng tỏi tiến hành thử tác dụng của thuốc trên KST nuôi cấy F.
falciparum theo phương pháp của Thaithong- Beale. Kết quả được thể hiện ở
các bảng và đồ thị sau.
Bảng 2.2. Nồng độ ức chế 50% IC5 0 trên KST p. falciparum nuôi cấy
' X ± Sp, n= 6 )
Chủng p. falciparum
ICso (nmol/L)
p
Artesunat (1)
BB 134 (2)
(1) - (2 )
Chủng nhạy chloroquin (T96) 6 ,6 ± 0,1
8 ,0 ± 0 ,2
<0,05
Chủng kháng chloroquin (Kl) 7,8 ± 1,0
4,8 ± 0,8
<0,05
IC5010
(nmol/1)
^ Artesunat
■ BB 134
Chủng nhạy Chủng kháng