BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VĂN THỊ PHƢƠNG NHƢ
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA
VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY LÚA
TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở TỈNH PHÚ YÊN

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62 42 01 07 Cần Thơ, 2015
1
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu trong khẩu phần dinh dưỡng cho
hơn 40% dân số thế giới. Năng suất cũng như sản lượng lúa tùy thuộc vào
khí hậu, loại đất, độ ẩm và nguồn dinh dưỡng. Cây lúa cần nhiều chất dinh
dưỡng khác nhau, chủ yếu là đạm, lân và kali. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu
dinh dưỡng cho cây lúa, nông dân phải sử dụng một lượng lớn phân bón
hóa học, chủ yếu là phân đạm, lân và kali. Tuy nhiên hiệu suất sử dụng
phân bón chỉ khoảng 35 - 40%, còn lại 60 - 65% lượng phân bón bị mất đi.
Trong số lượng phân bón cây trồng không sử dụng được, một phần bị rửa
trôi theo nước và gây ô nhiễm nguồn nước ngầm, một phần bị bay hơi do
tác động của nhiệt độ hay quá trình phản nitrate hóa gây ô nhiễm không khí
(Nguyễn Đức Khiển, 2002).
Trước sức ép của vấn đề an ninh lương thực, người dân luôn đặt ra mục
đích phải thu nhiều sản phẩm. Song do ý thức và trình độ canh tác chưa cao
nên tình trạng lạm dụng phân bón hóa học đã xảy ra khá phổ biến. Kết quả
điều tra của Sở Nông Nghiệp và PTNT Phú Yên trong năm 2012 cho thấy,
chi phí mà nông dân mua phân bón để sản xuất lúa lên đến 6.000.000
đồng/ha/vụ, chi phí này > 50% tổng chi phí trong sản xuất lúa. Điều này đã
tác động bất lợi đến chi phí sản xuất, đến môi trường dẫn đến kết quả sản
xuất không mang lại hiệu quả kinh tế cao và chưa có nền sản xuất bền
vững. Để khắc phục những tác động bất lợi này thì việc sử dụng phân bón
sinh học trong quá trình sản xuất nói chung và sản xuất lúa nói riêng thật sự
rất có ý nghĩa. Trong khi đó vi khuẩn nội sinh có nhiều đặc tính tốt, có vai
trò quan trọng đối với cây trồng và được ứng dụng trong sản xuất phân vi
sinh. Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh có ích trong
sản xuất phân bón vi sinh phục vụ cho sản xuất nông nghiệp rất có ý nghĩa
và cần thiết. Hơn nữa, hiện nay ở tỉnh Phú Yên chưa có một công trình
nghiên cứu nào về vi khuẩn nội sinh trong cây lúa. Chính vì vậy đề tài:

đặc tính của vi khuẩn nội sinh và tình hình nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn
nội sinh trong sản xuất nông nghiệp, với các nội dung chính như sau:
- Tổng quan về tình hình sản xuất lúa ở Phú Yên.
- Hiện trạng sử dụng phân bón ở Việt Nam và Phú Yên.
- Tổng quan về vi khuẩn nội sinh, đặc tính và vai trò của vi khuẩn nội
sinh.
- Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong sản xuất
phân vi sinh.
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu
+ Mẫu lúa thu từ 7 huyện và thành phố Tuy Hòa tỉnh Phú Yên từ tháng
8/2011 đến 8/2012, giống lúa Ma Lâm 213 đang được trồng phổ biến ở tỉnh
Phú Yên.
+ Môi trường phân lập vi khuẩn: môi trường LGI (Cavalcante và
Döbereiner, 1988), môi trường Nfb (Krieg và Döbereiner, 1984) và môi
trường RMR (Elbeltagy et al., 2001).
+ Môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005), môi trường NBRIP
(Nautiyal, 1999), thuốc thử Salkowsky đo IAA (Glickmann và Desseaux,
1995), môi trường dinh dưỡng khoáng Yoshida (Yoshida, 1978)
3.2. Phƣơng pháp
3.2.1 Phân lập
Xử lý mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh theo qui trình của Barraquio et
al., (1997). Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc, quan sát tế bào,
nhuộm Gram và trữ mẫu (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2009). 3
3.2.2. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR khuếch đại vùng 16S rDNA được thực hiện với cặp mồi
p515FPL và p13B được thiết kế (Zinniel et al., 2002), cặp mồi: mồi 1:

trình tự nucleotide cũng được phân tích bằng phần mềm DNASP 5.10
(Rozas et al., 2003).
3.2.5. Đo lƣợng Acethylen bị khử
Đo lượng ARA (Acetylene Reduction Assay) hình thành khi vi khuẩn
được nuôi trong môi trường Burk lỏng không đạm và hàm lượng ARA hình
thành khi vi khuẩn được bổ sung vào hạt lúa và trồng lúa vào môi trường
Burk không đạm có bổ sung 0,8% agar bằng máy sắc khí theo
(Somasegaran và Hoben, 1985), (Elbeltagy et al., 2001). Mẫu được đo
ARA tại phòng thí nghiệm Chuyên sâu (Trường Đại học Cần Thơ).
Nhận diện gen nifH của 22 dòng vi khuẩn có hoạt tính nitrogenase cao
bằng cách thực hiện các phản ứng PCR với cặp mồi PolF 5’
TGCGAYCCSAARGCBGACTC 3’ và PolR 5’
ATCGCCATCATYTCRCCGGA 3’ để khuếch đại gen nif theo quy trình
của Poly et al. (2001).
3.2.6. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các
dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong ống nghiệm 4
Hạt lúa nảy mầm bổ sung vi khuẩn được trồng trên môi trường dinh
dưỡng khoáng Yoshida. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn
ngẫu nhiên, với 24 nghiệm thức (NT). Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
- Thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn được bố trí
như sau: NT1 (Đối chứng âm): môi trường Yoshida không bổ sung đạm và
không vi khuẩn. NT2 (Đối chứng dương): môi trường Yoshida có bổ sung
đạm và không vi khuẩn. NT3 đến NT24: môi trường Yoshida không bổ
sung đạm và lần lượt bổ sung các dòng vi khuẩn.
- Thí nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó tan của vi khuẩn. NT1
(Đối chứng âm): môi trường Yoshida không có 10 mg/l NaH
2

.2H
2
O bổ sung 20 mg/l Ca
3
(PO
4
)
2
và lần lượt bổ sung các dòng vi
khuẩn.
Cây lúa được thu sau 28 ngày trồng để đánh giá các chỉ tiêu về chiều
cao cây và trọng lượng khô cả cây.
3.2.7. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn
Phản ứng catalase, khả năng sinh trưởng của các dòng vi khuẩn trên các
nguồn đường khác nhau (D-glucose, Sucrose, Maltose, Manitol, Fructose)
và nguồn chitin. Khả năng sinh trưởng trên môi trường nước trích khoai tây
(BMS).
3.2.8. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các
dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lƣới
Hạt lúa đã được bổ sung vi khuẩn và trồng trong chậu theo các nghiệm
thức. Thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm được bố trí theo thể thức
hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại với 45 nghiệm thức (Bảng 3.1. Thí
nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn được
bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại với 25 nghiệm thức
(Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát đạm và lân

Thí nghiệm khảo sát đạm
Thí nghiệm khảo sát lân
TT

0
VK1…
0P
2
O
5
-VK1…
0
VK1….
3
0N-VK8
0
VK8
0P
2
O
5
-VK4
0
VK4
4
30N-0VK
30
0VK
20P
2
O
5
-0VK
20

40P
2
O
5
-0VK
40
0VK
8
60N-VK1…
60
VK1…
40P
2
O
5
-VK1…
40
VK1…
9
60N-VK8
60
VK8
40P
2
O
5
-VK4
40
VK4
10

60
VK4
13
120N-0VK
120
0VK
80P
2
O
5
-0VK
80
0VK
14
120N-VK1…
120
VK1…
80P
2
O
5
-VK1…
80
VK1….
15
120N-VK8
120
VK8
80P
2

5

0VK
2
0N0P
2
O
5
-VK1
0N0P
2
O
5

VK1
3
0N0P
2
O
5
-VK2
0N0P
2
O
5

VK2
4
0N0P
2

5

VK1
7
60N40P
2
O
5
-VK2
60N40P
2
O
5

VK2
8
60N40P
2
O
5
-VK1+VK2
60N40P
2
O
5

VK1+VK2
9
120N80P
2

5

VK2
12
120N80P
2
O
5
-VK1+VK2
120N80P
2
O
5

VK1+VK2
3.2.9. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các
dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng
+ Chuẩn bị đất: đất được cày xới, san bằng mặt và làm sạch cỏ dại. Đắp
bờ phân ô, mỗi ô có diện tích 20 m
2
. Chuẩn bị mạ: hạt lúa được ngâm trong
nước sạch trong 24 giờ và ủ 36 giờ trước khi đem gieo mạ. Chuẩn bị dịch 6
vi khuẩn: nuôi vi khuẩn trên môi trường Burk lỏng không đạm, mỗi dòng
20 lít với mật số vi khuẩn 10
8
tế bào/ml.
+ Thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm: thí nghiệm bố trí theo

VK2, VK1+VK2 và đối chứng, lặp lại 4 lần (4 khối).
+ Cấy lúa: mạ 21 ngày tuổi, ở lô có bổ sung vi khuẩn: rễ lúa được ngâm
trong dịch vi khuẩn (riêng biệt cho từng dòng) trong 6 giờ, nghiệm thức đối
chứng (ngâm trong nước). Mạ được cấy theo khoảng cách 15 x 15 cm, 2
tép/bụi. Mỗi nhóm công nhân (3 người) chỉ cấy cho 1 dòng vi khuẩn riêng
biệt.
+ Chăm sóc, bón phân và đánh giá các chỉ tiêu về chiều cao cây, số
bông/bụi, số bông/m
2
, chiều dài bông, số hạt chắc/bông, tỷ lệ hạt lép/bông,
trọng lượng 1000 hạt, trọng lượng rơm, năng suất thực tế của lúa. Hàm
lượng N trong gạo và rơm phân tích bằng phương pháp Micro-Kjeldahl,
phân tích hàm lượng P trong gạo và rơm (thực hiện ở phòng Phân tích Đất,
BM. Khoa học Đất - Khoa Nông Nghiệp - Đại học Cần Thơ).
3.3. Xử lý số liệu:
Bằng chương trình Excel, phần mềm MEGA 6.0, BioEDit, DNASP 5.10
và thống kê số liệu bằng phần mềm Minitab 16, MSTATC.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập và đặc điểm sinh học của vi khuẩn nội sinh cây lúa
4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn
Tổng cộng có 593 dòng vi khuẩn phân lập được từ thân và rễ của 119
mẫu lúa thu được ở 7 huyện và thành phố Tuy Hòa trên 3 loại môi trường
nuôi cấy LGI, Nfb và RMR. Số dòng vi khuẩn phân lập từ rễ là 372 dòng
chiếm tỷ lệ 62,73%, số dòng vi khuẩn phân lập từ thân là 221 dòng chiếm
tỷ lệ 37,27%. Khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường bán đặc, sau 48 giờ
vi khuẩn phát triển thành vòng pellicle cách bề mặt môi trường 2 - 5 mm
(Hình 4.1).

- Hình dạng tế bào của các dòng vi khuẩn được phân lập trên 3 loại môi
trường đa số có dạng hình que ngắn, một số ít vi khuẩn dạng que dài và một
ít vi khuẩn có dạng hình cầu (Hình 4.3). Đa số các dòng vi khuẩn đều có khả
năng chuyển động, Gram âm.
vòng pellicle
8
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
900 bp
500 bp
1000 bp
1500 bp
bpbp

TAMa1 TAN18
Hình 4.3. Hình tế bào vi khuẩn chụp dƣới kính hiển vi điện tử (SEM) độ phóng đại 14.000 lần
4.2. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
Kết quả có 556/593 dòng vi khuẩn cho sản phẩm nhân bản DNA ở vị trí
900 bp so với thang chuẩn chiếm tỷ lệ 93,76% (Hình 4.4). Như vậy 556
dòng vi khuẩn này là các dòng vi khuẩn nội sinh (Zinniel et al., 2002). Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc nhân lên từ DNA của các dòng vi
khuẩn với 2 mồi p515FPL và p13B trên gel agarose 1,5%
M: thang chuẩn 100bp, 1-15: lần lượt là các dòng vi khuẩn nội sinh TALa14,
TAL1, TAL4, TAL5, TAL22, TAL30, SHL70, PHL87, PHL103, PHL105,
DHL105, TANa5, PHN85, TAMa9, TAM18 và 16: đối chứng âm (không vi
khuẩn).

Có 137/533 dòng vi khuẩn phát triển chậm hơn hàm lượng NH
4
+
đạt mức
cao nhất vào ngày thứ 6 và một số dòng vi khuẩn phát triển rất chậm thì
hàm lượng NH
4
+
tăng theo thời gian. Ngoài ra một số dòng vi khuẩn có
hàm lượng NH
4
+
được tạo ra cao nhất vào ngày 2 sau đó giảm vào ngày 4
và tăng lại ngày 6 hoặc ngày 8. Những dòng vi khuẩn này có lẽ rất nhạy
(0,432x1,28
4
(0,628x0,98
9 9
cảm với hàm lượng NH
4
+
hình thành. Theo kết quả nghiên cứu của Van và
Sloger (1981) trong quá trình tổng hợp NH
4
+
, sự hoạt động của enzyme
nitrogenase bị tác động ức chế bởi hàm lượng NH

11
16
82
239
100
182
320
139
248
225
99
59
174
110
32
0
50
100
150
200
250
300
350
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8
Số dòng
0 - 0.99
1.00 - 1.99
2.00 - 2.99
> 2.99


biến thiên hàm lượng P
2
O
5
tạo ra là do tốc độ phát triển của các dòng vi
khuẩn không giống nhau, một số dòng vi khuẩn có tốc độ phát triển rất
nhanh nên chỉ sau 5 ngày nuôi cấy hàm lượng P
2
O
5
đạt mức cao nhất như
dòng DHL136 (252,23 mg/l), DHL138 (230,27 mg/l), TALa12 (220,72
mg/l) và DHL74 (218,45 mg/l). Một số dòng có khả năng hòa tan lân khó
tan rất cao sau 10 ngày nuôi cấy như dòng TAL1 (634,11 mg/l), dòng
TAL4 (454,32 mg/l), … Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Kumar et
mg/l 10
al., (2008) khi phân lập Enterobacter sp. trong môi trường pH = 7 có khả
năng hòa tan lân khó tan 229 mg/l, theo Chen et al., (2006) tùy thuộc vào
môi trường pH vi khuẩn hòa tan lân khó tan dao động từ 31,5 mg/l đến 898
mg/l và theo báo cáo của Nguyễn Thị Thu Hà và Cao Ngọc Điệp (2008) vi
khuẩn nội sinh trong cây cỏ có khả năng hòa tan lân tốt nhất với lượng lân
hòa tan là 283,33 mg/l sau 10 ngày nuôi.

255
129
117
198

của 457 dòng vi khuẩn theo thời gian
4.3.3. Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn
Kết quả khảo sát tại 4 thời điểm là 2, 4, 6 và 8 ngày nuôi, cho thấy tất cả
457 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp IAA (Hình 4.7). Hàm lượng
IAA được tổng hợp ở 4 thời điểm khảo theo 4 chiều hướng khác nhau. Nhiều
dòng có khả năng tổng hợp IAA khá cao sau 4 ngày nuôi cấy như dòng
SHL63 (38,75 µg/ml), PHL86 (37,77 µg/ml), … Kết quả khảo sát này tương
tự với các kết quả nghiên cứu trước đây. Sự tổng hợp IAA của vi khuẩn
Azospirillum brasilense ít hơn 2 µg/ml trong môi trường không đạm nhưng
trong môi trường có NH
4
+
và có bổ sung tryptophan đạt được 24 µg/ml
(Tien et al., 1979). Malik et al., (1997) nhận thấy Pseudomonas có khả
năng tổng hợp IAA khá cao (35 µg/ml).

66
18
27
113
185
112
121
235
182
256
284
105
24
71

+
dao động từ
2,23 - 6,26 mg/l, P
2
O
5
dao động từ 28,92 - 371,31 mg/l và IAA dao động
3,56 - 22,90 µg/l. Tất cả các trình tự 16S rDNA của 90 dòng vi khuẩn đã
được phân tích và so sánh với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen
(NCBI) bằng công cụ BLAST nucleotid được ghi nhận ở (Bảng 4.1).
Bảng 4.1. Mối tƣơng quan di truyền giữa các dòng vi khuẩn phân lập với các dòng vi
khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA
Nhóm vi
khuẩn
Chiều dài
(bp)
Các loài quan hệ
Mã số
Tƣơng
đồng
Bacilli
%
TALa14
760
Bacillus megaterium strain p16_B11
JQ833394
99

DXL136
860
Bacillus subtilis Gr5
KC813165
99
THM60
847
Bacillus subtilis M18SP4Q(ii)
KC886741
99
PHN 89
860
Bacillus subtilis CHP610B
JF262038
99
TAMa7
860
Bacillus subtilis GHt1-7
GU434357
99
TAM18
849
Bacillus methylotrophicus VSD607
KC534272
99
TAN17
900
Bacillus methylotrophicus LZ023
JQ023616
99

TAN18
835
Bacillus pumilus vit bac1
KC845305
98
PHM104
769
Bacillus sp. Y19(2013)
KC708569
99
PHM85
720
Bacillus sp. B-23286
AF169504
99
THN114
870
Paenibacillus hunanensis Fek21
EU741031
98
THN128
800
Staphylococcus arlettae IHB B 8022
KF475813
97
PHN105
856
Exiguobacterium acetylicum PNS-30
JQ218452
99

Burkholderia kururiensis LUC24
AY586518
100
PHL87
850
Burkholderia kururiensis PR1
JX083379
99
PHL103
838
Burkholderia vietnamiensis RPB3
HQ606073
99 12
PHN 86
850
Burkholderia vietnamiensis NSP-35
JQ743669
99
TAL5
865
Burkholderia pyrrocinia A12
JQ283970
99
PHN 91
860
Burkholderia cepacia SB335
FJ608711

SHIN83
802
Pantoea ananatis 3Pe76
EF178449
99
PHL 76
862
Pantoea ananatis LN-4
GU937431
99
PHN90
862
Pantoea ananatis LN-1
GU937430
99
PTHL 168
849
Pantoea ananatis O-2-2
GU324770
98
TAN14
860
Pantoea cypripedii Dc-08
KC153127
99
PHM93
720
Pantoea agglomerans T224
KC764985
99

TAL1
853
Pseudomonas putida C-S-TSA6
HM755575
99
TAMa15
870
Pseudomonas hibiscicola R4-722
JQ659712
99
TAMa6
865
Pseudomonas hibiscicola 4-790
JQ659719
98
TAN22
869
Pseudomonas sp. ZR3
JQ433923
99
PHN101
856
Klebsiella pneumoniae R3
KC990817
99
TAM1
800
Klebsiella pneumoniae 6
KC434997
98

DXM125
856
E. cancerogenus 46 (C2P1)
KF254599
99
THN113
788
E. cancerogenus, NMB8-2
AB776824
99
SHM47
749
Enterobacter aerogenes p62_A05
JQ829356
99
DXN142
889
Enterobacter aerogenes gx-32
FJ823005
99
PTHM159
854
Enterobacter aerogenes gx-32
FJ823005
99
SHN52
720
Enterobacter aerogenes DCH-2
KC166865
99
13
TAN15
872
Enterobacter sp. YR2-2
JQ229706
98
TAN26
871
Enterobacter sp. isolate CCM6B
FN433019
99
DHM139
876
Stenotrophomonas maltophilia L1
KF358247
99
SHM53
856
Stenotrophomonas maltophilia TWNG12
KF312295
99
TAN6
889
Stenotrophomonas maltophilia G8
KC136825
99
TAM6
851

Chryseobacterium indologenes N6
KC189901
99
TAM3
813
Chryseobacterium gleum AOLR31
GQ916521
98
TAM20
846
Chryseobacterium. kwangyangense Cb
EU169201
99
ĐHM134
850
Chryseo. indologenes ZYF120413-7
KF017580
99
Kết quả từ Hình 4.8 cho thấy 90 dòng vi khuẩn phân lập rất đa dạng về
loài thuộc 5 nhóm khác nhau, phù hợp với những kết quả của Olivares et
al., (1996), Reinhold-Hurek và Hurek (1998), Prakambang et al., (2009).

Bacilli, 27.78%
Alphaproteobacteria,
1.11%
Betaproteobacteria,
11.11%
Gammaproteobacteria,
53.33%
Bacteroidetes, 6.67%

4
0,75318
438,000 ± 238,909
5
Enterobacter
18
0,71459
185,489 ± 53,928
6
Klebsiella
4
0,73996
416,182 ± 227,008
7
Pantoea
11
0,70470
244,796 ± 83,578
8
Pseudomonas
5
0,67562
360,960 ± 173,261
9
Stenotrophomonas
3
0,74182
532,667 ± 355,111
vi khuẩn đƣợc tuyển chọn
Tất cả 40 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH
4
+
cao nhất đều thể
hiện hoạt tính nitrogenase với hàm lượng nitrogenase dao động từ 0,1208
µM đến 0,2961 µM và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1%. Có 22/40
dòng vi khuẩn có hoạt tính nitrogenase cao và bổ sung trên cây lúa trồng
trong ống nghiệm có hàm lượng nitrogenase dao động từ 0,1410 µmol -
0,3276 µmol, khác biệt có ý nghĩa thống kê kê ở mức 1% và cao nhất là
dòng SHL70 (0,3276 µmol), kế đến PHL87 (0,2871 µmol) và TALa14
(0,2757 µmol).
Từ kết quả đo hoạt tính nitrogenase đã tuyển chọn được 22 dòng vi
khuẩn có hoạt tính nitrogenase cao nhất và tiến hành nhận diện gen nifH.
Kết quả điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR phát hiện gen nifH với
cặp mồi PolF và PolR (Hình 4.9) cho thấy: tất cả 22 dòng vi khuẩn đều cho
sản phẩm nhân bản gen với vạch DNA có kích thước khoảng 360 bp so với
thang chuẩn 100 bp plus. Điều này chứng minh rằng cả 22 dòng vi khuẩn này
đều có chứa gen nifH (Poly et al., 2001). A B C D
Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 22 dòng vi khuẩn trên gel agarose
Ghi chú: M: Thang chuẩn 100 bp, 1:TAMa9, 2: TAM14, 3: TAM18, 4: SHM53, 5: PHM89,
6: PTM164, 7: ĐC (không vi khuẩn), 8: TANa5, 9: PHN86, 10: DXN146, 11: PTHN179,
12: PTHN195, 13: TALa14, 14: ĐC, 15: TAL1, 16: TAL4, 17: TAL5, 18: TAL22, 19:
TAL30, 20: SHL70, 21:ĐC, 22: PHL87, 23: THL103, 24: THL105, 25: DHL154.
4.6. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi
khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong ống nghiệm
4.6.1. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn

vi khuẩn: SHL70, PHL87, TAL4, TALa14, TAL1, THL105, THL103 và
TANa5 có hiệu quả cố định đạm cao hơn các dòng vi khuẩn khác và 4 dòng
vi khuẩn: TAL4, TAL1, TALa14 và PHL87 ngoài khả năng cố định đạm,
tổng hợp IAA còn có khả năng hòa tan lân khó tan cao.
4.7. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn đƣợc
tuyển chọn
Bảng 4.3. Đặc tính sinh lý sinh hóa của 8 dòng vi khuẩn tiềm năng
Đặc tính
TAL1
TAL4
TANa5
TALa14
PHL105
SHL70
PHL87
PHL103
Chuyển động
+
+
+
+
+
+
+
+
Gram
-
+
+
+

+
Manitol
+
+
+++
+++
+++
+
+
+
D-Fructose
+
+
+
+
+
+
+
+
Maltose
+
+
+
+
+
-
-
-
acid Malic
+

trọng lượng khô của cây cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức
1% so với các nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn. Tất cả 8 dòng vi
khuẩn đều tác động hữu hiệu đối với cây lúa trong suốt thời gian sinh
trưởng và phát triển. Kết quả khảo sát các sinh tiêu chỉ sinh trưởng của cây
lúa ở giai đoạn 48 ngày cho thấy, ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn
đã giúp cho cây sinh trưởng phát triển tốt, tăng sinh khối so với nghiệm
thức không bổ sung vi khuẩn. Giai đoạn 48 ngày cây lúa bắt đầu phân hóa
đồng nên việc tăng sinh khối của cây thật sự rất có ý nghĩa, liên quan chặt
chẽ và tỷ lệ thuận với số bông/bụi, số hạt chắc/bông và đây là những chỉ
tiêu rất quan trọng quyết định đến năng suất thực tế của lúa.
Kết quả cho thấy cả 8 dòng vi khuẩn đều có tác động hữu hiệu đến các
thành phần năng suất và năng suất lúa. Năng suất lúa trên chậu ở tất các
nghiệm thức không bón đạm, có bổ sung vi khuẩn đều cao hơn và tăng lên
từ 9,09% - 38,26%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với nghiệm
thức không bổ sung vi khuẩn và cao nhất là dòng SHL70 (60,6 g/chậu), kế
đến là dòng PHL87 (56,5 g/chậu).
Ở mức bổ sung 30 kg N/ha thì hầu hết các nghiệm thức có bổ sung vi
khuẩn đều cho năng suất lúa cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở
mức 1% so với nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn (trừ nghiệm thức
30N-TANa5 và 30N-TAL4). Đặc biệt là dòng vi khuẩn SHL70 và PHL87
chỉ bổ sung 30 kg N/ha đã cho năng suất lúa khác biệt không có ý nghĩa
thống kê so với nghiệm thức 120N-0VK và khi bổ sung 50% N (60 kg
N/ha) thì hai dòng này cho năng suất cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống
kê ở mức 1% so với nghiệm thức 120N-0VK (100% N). Điều này cho thấy
2 dòng vi khuẩn SHL70 và PHL87 có hiệu quả rất cao trong việc cố định
đạm để cung cấp cho cây lúa.
Ở mức phân đạm 90 kg N/ha, 120 kg N/ha, tất cả các nghiệm thức có bổ
sung vi khuẩn đều cho năng suất cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê
ở mức 1% nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn. Đặc biệt khi lượng phân
đạm tăng từ 90 kg N/ha lên 120 kg N/ha, các thành phần năng suất và năng

quả tích cực đối với cây lúa ở giai đoạn 48 ngày, đã làm tăng các chỉ tiêu về
chiều cao, chiều dài bông, trọng lượng rơm/bụi và các thành phần năng suất
như số bông/bụi, số hạt chắc/bông và năng suất lúa cao hơn, khác biệt có ý
nghĩa thống kê so với các nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn ở giai đoạn
thu hoạch. Các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn và không bón lân đều cho
năng suất lúa cao hơn và tăng lên từ 4,09% - 32,55% so với nghiệm thức
không bổ sung vi khuẩn, cao nhất là dòng TAL4 (58,6 g/chậu), kế đến là
dòng TAL1 (57,2 g/chậu). Đặc biệt là dòng vi khuẩn TAL4 và TAL1 chỉ
cần bổ sung 40 kg P
2
O
5
/ha (50% P
2
O
5
) đã cho năng suất cao hơn và khác
biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 80P
2
O
5
-0VK (100% P
2
O
5
).
Trong 4 dòng vi khuẩn được khảo sát, có 2 dòng có hiệu quả trội hơn là
dòng TAL1 (tương đồng 99% Pseudomonas putida) và dòng TAL4
(Bacillus subtilis) có khả năng cung cấp 50% lượng phân lân cho cây lúa
mà năng suất lúa vẫn khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với bón 100%

Bên cạnh việc tăng năng suất, hai dòng vi khuẩn này còn gia tăng hàm
lượng N trong hạt gạo, hàm lượng protein trong hạt gạo và hàm lượng N
trong rơm. Trong cùng một mức phân đạm hóa học, các nghiệm thức có bổ
sung vi khuẩn có giá trị % protein trong hạt gạo cao hơn và khác biệt có ý
nghĩa thống kê ở mức 1% so với nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn. Ở
các nghiệm thức không bón phân đạm, hàm lượng protein trong hạt gạo
tăng từ 9,06 - 11,59% so với nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn. Cả hai
nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn chỉ cần bổ sung 50% N (60 kg N/ha) đều
có giá trị % protein trong hạt gạo khác biệt không có ý nghĩa thống kê so
với nghiệm thức 120N-0VK. Các nghiệm thức không bón phân đạm có bổ
sung vi khuẩn SHL70 hoặc PHL87 có giá trị % N trong rơm tăng từ 17,2 -
20,7% so với nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn.
Bảng 4.4. Hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học
lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ngoài đồng ở phƣờng Phú
Thạnh, Tuy Hòa
Nghiệm thức
Số bông
/m
2

Số hạt
chắc/bông
Tỷ lệ hạt
lép (%)
TL.1000
hạt (g)
Năng suất
(tấn/ha)
0N-0VK
231,0

126,3
fg

15,0
e

23,8
5,93
h

30N-0VK
250,8
e

121,3
h

15,2
e

23,5
5,53
i

30N-SHL70
268,4
d

136,0
bc

e

24,1
5,96
gh

60N-SHL70
283,8
c

139,0
ab

12,6
c

24,2
6,94
d

60N-PHL87
279,4
c

137,9
abc

12,6
c



24,2
7,39
b

90N-PHL87
303,6
a

138,7
ab

10,7
b

24,1
7,25
c

120N-0VK
292,6
b

132,2
de

13,5
d

24,1


F (Phân x VK)
**
**
**
ns
**
0VK
264,0
c

124,5
b

15,1
b

23,9
6,02
b

SHL70
286,0
a

137,5
a

12,0
a

1,80
0N
250,8
e

125,5
d

15,7
d

23,7
b

5,78
e

30N
261,8
d

130,5
c

13,7
c

23,8
ab


a

7,03
b

120N
302,9
a

138,2
a

11,0
a

24,2
a

7,31
a

F (Phân)
**
**
**
**
**
CV (%) (Phân)
1,78
1,80

235,4
e

117,8
e

15,9
a

23,6
f

5,38
f

0P
2
O
5
-TAL1
276,1
cd

125,2
d

12,7
c

24,1

270,6
d

124,7
d

13,7
b

23,8
e

6,09
de

40P
2
O
5
-TAL1
299,2
b

138,3
a

9,37
f

24,2

303,6
ab

134,6
b

11,6
d

24,2
c

6,91
c

80P
2
O
5
-TAL1
310,2
a

138,1
a

9,13
f

24,3

**
**
**
**
0VK
269,9
c

125,7
b

13,7
a

23,8
b

6,13
b

TAL1
295,2
b

133,8
a

10,4
c


1,07
2,18
1,16
1,81
0P
2
O
5

265,1
c

123,4
b

14,8
a

24,0
c

5,85
c

40P
2
O
5

291,5


7,34
a

F (Phân)
**
**
**
**
**
CV (%) (Phân)
1,71
1,64
2,77
1,06
1,94
* Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu có chữ số theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa
thống kê ở mức độ ý nghĩa 1%. 0P
2
O
5
= 0 kg P
2
O
5
, 40P
2
O
5
= 40 kg P

/ha) cho cây lúa nhưng vẫn đảm bảo năng suất.
Bên cạnh việc gia tăng năng suất lúa, tất cả các nghiệm thức có bổ sung
vi khuẩn và bón cùng mức phân lân đều có giá trị % protein trong gạo, hàm
lượng P trong rơm, trong gạo cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở
mức 1% so với nghiệm thức chỉ bón phân lân mà không bổ sung vi khuẩn.
4.10. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp
2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà
lƣới và ngoài đồng
4.10.1. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết
hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện
nhà lƣới
Hai dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 đã tác động hữu hiệu lên cây lúa
trồng trong chậu và ngoài đồng, tiếp tục được khảo sát hiệu quả tác động
kết hợp của 2 dòng này. Trước khi tiến hành thí nghiệm bổ sung kết hợp 2
dòng vi khuẩn này lên cây lúa đã kiểm tra tính đối kháng của 2 dòng. Kết
quả kiểm tra cho thấy 2 dòng vi khuẩn không đối kháng với nhau khi cấy
chung trên 1 đĩa môi trường.
Kết quả thí nghiệm trong chậu cho thấy mỗi mức phân bón các nghiệm
thức có bổ sung vi khuẩn riêng rẽ hay kết hợp đều có chiều cao cây, chiều
dài bông, số hạt chắc/bông, trọng lượng rơm/bụi và năng suất lúa/chậu cao
hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các nghiệm thức 21
không bổ sung vi khuẩn và cao nhất là nghiệm thức có bổ sung kết hợp 2
dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4. Ở mức phân bón 60N40P
2
O
5
, cả 3 nghiệm

khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với nghiệm thức không bổ sung
vi khuẩn và cao nhất là nghiệm thức có bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn
(Bảng 4.6 và Bảng 4.7). Trong các nghiệm thức không bón phân có bổ
sung vi khuẩn năng suất lúa trồng ở huyện Đông Hòa tăng từ 9,62% đến
24,62%, huyện Tuy An tăng từ 27,87% đến 62,36% so với nghiệm thức
không bổ sung vi khuẩn và khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Ở mức phân bón 60 kg N - 40 kg P
2
O
5
/ha, nghiệm thức có bổ sung vi
khuẩn dòng SHL70 hoặc TAL4 cho năng suất lúa và trọng lượng rơm khô
khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với nghiệm thức bón
120N80P
2
O
5
-0VK. Riêng nghiệm thức có bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn
thì có năng suất lúa và trọng lượng rơm khô lớn hơn và khác biệt có ý nghĩa
thống kê ở mức 1% so với nghiệm thức 120N80P
2
O
5
-0VK. Kết quả này
cho thấy, khi bổ sung vi khuẩn kết hợp hay riêng rẽ thì các dòng vi khuẩn
này đều có khả năng cung cấp 50% N và 50% P
2
O
5
cho nhu cầu sinh

Năng suất
lúa (tấn/ha)
0NOP
2
O
5
-0VK
245,3
g

100,3
f

5,53
h

5,20
g

0NOP
2
O
5
-SHL70
276,1
e

104,0
f



118,3
d

6,65
de

6,48
d

60N40P
2
O
5
-0VK
284,9
d

109,2
e

6,50
ef

6,08
e

60N40P
2
O

5
-SHL70+ TAL4
321,2
a

145,4
a

7,10
ab

7,16
b

120N80P
2
O
5
-0VK
304,7 c
120,1
d

6,68
d

6,66
c

120N80P

2
O
5
-SHL70+ TAL4
323,4 a
143,4
a

7,20
a

7,54
a

F (Phân x Vi khuẩn)
**
**
**
**
0N0P
2
O
5

274,2
c

106,1
c



133,1
a

6,95
a

7,13
a

F (Phân)
**
**
**
**
CV% (Phân)
2,07
2,39
1,17
1,00
0VK
278,3
c

109,9
d

6,23
c


316,8
a

135,7
a

6,98
a

7,06
a

F (Vi khuẩn)
**
**
**
**
CV% (Vi khuẩn)
1,39
2,65
1,55
1,41 23
Bảng 4.7. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân
hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở huyện Tuy An
Nghiệm thức

Số

O
5
-SHL70
288,2
fg

75,8
ef

5,64
g

4,45
f

0N0P
2
O
5
-TAL4
283,8
g

74,8
f

5,54
h

4,46

5,96
f

5,23
e

60N40P
2
O
5
-SHL70
297,0
cde

99,8
c

6,51
d

6,10
c

60N40P
2
O
5
-TAL4
294,8
ef

5
-0VK
303,6
bcd

91,9
d

6,34
e

6,04
c

120N80P
2
O
5
-SHL70
304,7
ab

119,9
b

6,81
c

6,69
b

a

7,48
a

F (Phân x Vi khuẩn)
**
**
**
**
0N0P
2
O
5

282,43
c

78,6
c

5,70
c

4,51
c

60N40P
2
O


F (Phân)
**
**
**
**
CV% (Phân)
1,28
4,59
1,23
1,98
0VK
227,93
d

81,5
c

5,85
d

4,91
c

SHL70
296,63
b

98,5
b

6,65
a

F (Vi khuẩn)
**
**
**
**
CV% (Vi khuẩn)
1,81
4,23
1,06
2,43
* Trong cùng một cột, các số liệu có chữ số theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở
mức độ ý nghĩa 1% (**),