BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN CHỊU NHIỆT
TỪ MEN CƠM RƯỢU
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS. NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG HUỲNH QUỐC KHÁNH
MSSV: 3102818
LỚP: CNSH TT K36
Cần Thơ, tháng 12/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS. TS. Ngô Thị Phương Dung Huỳnh Quốc Khánh
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học LỜI CẢM TẠ
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần
Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng quý thầy
cô đã tận tình giảng dạy em trong thời gian học tập vừa qua.
Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của em đến cô Ngô Thị Phương
Dung, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em thực
hiện đề tài nghiên cứu.
Xin gửi lời cảm ơn đến cô cố vấn học tập lớp Công nghệ Sinh học tiên
tiến khóa 36, cô Trần Thị Xuân Mai.Sự hỗ trợ nhiệt tình cùng những lời khuyên của cô
Hansenspora. Có 27 chủng nấm men phát triển được mức nhiệt độ 43
o
C, 29 chủng
nấm men phát triển được ở nồng độ ethanol 12%. Ba chủng nấm men CT1, HG2 và
TO1 nấm men có khả năng lên men mạnh hơn hẳn các chủng còn lại trong thí nghiệm
lên men đường glucose 2%. Ba chủng nấm men CT1, HG2 và TO1 có khả năng tạo
ethanol được khi nhiệt độ lên đến 42
o
C với nồng độ ethanol lần lượt là 3,03% v/v,
2,69% v/v và 2,77% v/v. So sánh mức độ tương đồng chuỗi nucleotide giữa vùng ITS1,
5.8S rDNA và ITS2 với cơ sở dữ liệu của ngân hàng gene, chủng nấm men TO1 được
xác định là loài Saccharomyces cerevisiae với độ tương đồng 93%.
Từ khóa: chịu ethanol, chịu nhiệt, lên men ethanol, nấm men chịu nhiệt,
Saccharomyces cerevisiae
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT i
LỜI CẢM TẠ ii
TÓM LƯỢC iii
MỤC LỤC iv
DANH SÁCH HÌNH vii
DANH SÁCH BẢNG ix
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
3.2.1. Phân lập nấm men 22
3.2.3. Thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men 24
3.2.4. Thử nghiệm khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men 24
3.2.5. Sơ tuyển nấm men có hoạt tính lên men tốt 25
3.2.6. Khảo sát khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao của các chủng nấm men đã
tuyển chọn 25
3.2.7. Định danh các chủng nấm men có đặc tính tốt 26
3.2.8. Xử lý số liệu, phân tích thống kê 26
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
4.1. Phân lập nấm men 27
4.3. Thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men 44
4.4. Thử nghiệm khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men 46
4.5. Sơ tuyển nấm men có hoạt tính lên men tốt 49
4.6. Khảo sát khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao của các chủng nấm men đã
tuyển chọn 50
4.7. Định danh các chủng nấm men có đặc tính tốt 52
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
5.1. Kết luận 54
5.2. Đề nghị 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
PHỤ LỤC
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Hình 29: Tế bào nấm men TO1 53
Hình 30: Kết quả định danh chủng nấm men TO1 53
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ix Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Các dạng nấm men đã phân lập 36
Bảng 2: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men đã phân lập 37
Bảng 3: Khả năng lên men 3 loại đường của các chủng nấm men 39
Bảng 4: Khả năng phân giải urea của các chủng nấm men sau 48 giờ 41
Bảng 5: Kết quả định danh sơ bộ đến cấp độ CHI của 40 chủng nấm men dựa vào đặc
điểm hình thái và đặc tính sinh lý 43
Bảng 6: Khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men 44
Bảng 7: Khả năng chịu cồn của các chủng nấm men 47
Bảng 8: Chiều cao cột khí sinh ra ở các chủng nấm men 49 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học x Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TỪ VIẾT TẮT
2002).
Việc sử dụng nấm men tạo ra ethanol từ đường có tiềm năng rất lớn bởi đường
có thể thu được từ các phụ phẩm nông nghiệp như rơm, thân bắp, rỉ đường, các
nguồn nguyên liệu này rẻ và đa dạng ở các nước nông nghiệp. Tuy nhiên, có nhiều yếu
tố ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm men như nguồn carbon, nguồn nitơ, pH, nồng độ
ethanol, nhiệt độ,
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình lên men
ethanol, nhất là ở những nước vùng nhiệt đới, nơi có nhiệt độ trung bình cao trong suốt
cả năm. Lợi thế của việc lên men ở nhiệt độ cao là quá trình lên men sẽ diễn ra nhanh
hơn, giảm được nguy cơ nhiễm vi sinh vật, tiết kiệm chi phí làm mát, (Roehr, 2001).
Tuy nhiên, khi nhiệt độ hoặc nồng độ ethanol quá cao vượt khả năng chịu đựng
của nấm men, quá trình lên men sẽ bị ức chế, dẫn đến hiệu quả lên men không cao. Do
đó, việc tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng phát triển và lên men ethanol
ở nhiệt độ cao, đồng thời kết hợp được đặc tính chịu được nồng độ ethanol cao rất có
triển vọng cho việc sản xuất ethanol.
Khí hậu vùng ĐBSCL của Việt Nam nóng ẩm quanh năm, rất thích hợp cho sự
phát triển của nấm men, quần thể nấm men rất phong phú và đa dạng. Khả năng thu
được nhiều chủng nấm men có các đặc tính mong muốn làm giống gốc cho sản xuất
công nghiệp và các nghiên cứu về khả năng lên men ethanol trong điều kiện nhiệt độ
cao là hoàn toàn có tính khả thi.
Hiện tại, trong nước còn ít công trình nghiên cứu về nấm men chịu nhiệt trong
men cơm rượu, nên rất cần những nghiên cứu tìm hiểu, phân lập và đưa các chủng
nấm men có triển vọng cao ứng dụng vào quá trình sản xuất ethanol. Do đó đề tài
“Phân lập và tuyển chọn nấm men chịu nhiệt từ men cơm rượu” được thực hiện.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
1.2. Mục tiêu đề tài
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là phân lập và tuyển chọn được giống nấm men
thuốc bắc được sản xuất từ một số vị thuốc bắc và bột gạo và bánh men lá được sản
xuất từ bột gạo và các loại lá, củ, quả rừng được thu hái theo kinh nghiệm cổ truyền.
Số lượng và chủng loại thuốc hay cây rừng bổ sung vào bánh men luôn là bí quyết
riêng của từng vùng, thậm chí của từng gia đình.
Hình 1: Bánh men cổ truyền
Thành phần quan trọng nhất của bánh men là hệ vi sinh vật. Trong quá trình sản
xuất bánh men, men giống của mẻ trước được truyền cho mẻ sau và cứ như vậy từ thế
hệ này qua thế hệ khác. Ở mỗi địa phương khác nhau người ta chuẩn bị bánh men theo
những công thức khác nhau và với men gốc của riêng mình. Với một truyền thống văn
hóa lâu đời và đa sắc tộc, sự đa dạng trong các loại bánh men của Việt Nam cũng như
hệ vi sinh vật trong đó là rất lớn. Hệ vi sinh vật trong bánh men Việt Nam chủ yếu
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
thuộc các chi: Chi Rhizopus; Mucor; Saccharomycopsis, Aspergillus; Saccharomyces
cerevisiae và vi khuẩn Lactic acidbacteria
Quy trình sản xuất bánh men cổ truyền:
Gạo ← Nước
↓
Ngâm
↓
Xay thành bột
↓ ← Men giống
Nhào trộn
↓
Định hình bánh men
↓
Ủ 30
những sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hay khuẩn ty giả (pseudo mycelium). Tuy nhiên,
hình dạng của nấm men không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của tế bào, điều kiện môi
trường và điều kiện nuôi cấy (Kurtzman và Piškur, 2006).
Kích thước tế bào: kích thước của tế bào nấm men khác nhau rất nhiều, tùy
theo loài, độ tuổi của tế bào, điều kiện nuôi cấy. Kích thước trung bình của tế bào thay
đổi trong khoảng chiều dài 9-10 µm và chiều rộng 2-7 µm (Nguyễn Lân Dũng, 1998).
2.2.2. Cấu tạo của nấm men
Tế bào nấm men được cấu tạo chủ yếu từ các thành phần cơ bản sau:
- Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau, trong đó chủ yếu là
glucan, protein, lipid và một số thành phần khác như kitin, volutin,… Thành tế bào
nấm men trong suốt, nhờn và dày khoảng 1.000 Å, gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng có cấu
tạo chủ yếu là lipoprotein, lớp giữa cấu tạo chủ yếu là manan protein, lớp trong chủ
yếu là glucan.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Màng nguyên sinh: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipid,
enzyme permease,…độ dày màng nguyên sinh khoảng 200 Å, chức năng chủ yếu là
điều hòa việc hấp thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất.
- Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu từ nước, protein, glucid, lipid,
các muối khoáng, enzyme và có các bào quan bên trong.
- Nhân tế bào: hình bầu dục, được bao bọc bởi dịch nhân. Nhân tế bào nấm men
là nhân điển hình, có màng nhân. Cũng như nhân tế bào của vi sinh vật bậc cao, nhân
tế bào nấm men ngoài DNA còn có protein và nhiều loại enzyme. Hạch nhân của tế
bào nấm men không chỉ gồm một phần DNA như vi khuẩn và đã có cấu tạo nhiễm sắc
thể điển hình và có quá trình phân bào nguyên nhiễm.
- Các thành phần khác:
+ Không bào: trong tế bào nấm men có chứa một hoặc nhiều không bào được
hình thành từ thể Golgi hay mạng lưới nội chất, không bào chứa đầy dịch tế bào, bên
trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số giống Saccharomyces bao gồm
Endomyces và Schizosaccharomyces.
Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti – nấm men bất hoàn): Crytococus (toscula,
tornlopsis). Mycoderma, Eandida, Geotrichum (đã xếp vào lớp nấm mốc) và
Rhodotorula.
* Khóa phân loại nấm men (Kurtzman và Fell, 1998)
Phân loại các giống nấm men dựa vào một số đặc điểm về hình thái, sinh lý
nấm men: sự nảy chồi của nấm men, hình dáng nấm men, sự hình thành bào tử, khả
năng lên men các loại đường, khả năng đồng hóa urea.
Chi Saccharomyces: tế bào nảy chồi nhiều hướng, đôi khi có khuẩn ty giả. Sinh
sản hữu tính: túi khá bền và hình thành trực tiếp từ một tế bào lưỡng bội. Mỗi túi chứa
1-4 bào tử túi hình ellipse hoặc tròn nhẵn.
Chi Hanseniaspora: nảy chồi có hai cực hoặc một cực, có thể có khuẩn ty giả.
Không tạo khuẩn ty thật. Sinh sản hữu tính, các túi không tiếp hợp. Mỗi túi chứa 1-4
bào tử hình mũ hay hình cầu, nhẵn hoặc xù xì, có hoặc không có gờ ở giữa.
2.2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men.
Nấm men là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, chúng hô hấp như một cơ thể hiếu khí
bậc cao, khi môi trường hết oxy chúng chuyển sang hô hấp kỵ khí, gọi là quá trình lên
men. Khi phản ứng lên men bắt đầu phát triển, tốc độ sinh sản của tế bào nấm men bị
kìm hãm và đến một giai đoạn nhất định hầu như không còn nữa. Về cơ chế sinh học,
đây là một quá trình sử dụng không hết năng lượng trong các chất dinh dưỡng có trong
môi trường. Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đường hấp thụ chọn lọc trên bề mặt
của tế bào và sau đó khuếch tán vào bên trong. Màng và lớp bao bọc nguyên sinh chất
của tế bào đóng vai trò màng bán thấm ngăn cách, điều hòa các chất dinh dưỡng vào tế
bào và thải các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài. Các chất dinh dưỡng sau khi hấp thụ
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
vào trong tế bào sẽ xảy ra những phản ứng hóa học để chuyển hóa thành các hợp chất
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
gốc amonium trước, gốc acid còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng và sẽ làm môi
trường acid hóa, giảm pH.
Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ
Trong nuôi cấy nấm men, phospho được quan tâm trước hết, sau đó là kali,
magie, lưu huỳnh,…
Phospho tham gia vào thành phần quan trọng của tế bào (nucleoproteid, acid
nucleic, phospholipid,…). Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các phản
ứng sinh hóa, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocarbon và vận chuyển năng lượng.
Lưu huỳnh tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và
enzyme.
Magie và mangan tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men.
Kali chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham
gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện hồi phục phosphoryl hóa của acid pyruvic.
Trong phòng thí nghiệm vi sinh vật, người ta thường sử dụng muối KH
2
PO
4
và
K
2
HPO
4
làm nguồn phospho và kali. Còn trong sản xuất, thường sử dụng dịch chiết từ
superphosphate làm nguồn phospho.
Dinh dưỡng các chất kích thích tăng trưởng
Để cho nấm men phát triển và lên men được bình thường cần phải có các
rệt, quá trình lên men rượu cũng bắt đầu.
- Giai đoạn thoái hóa (Death Phase): số lượng tế bào giảm xuống. Lượng
protein và acid nucleic giảm xuống, glycogen và treganose hoàn toàn biến mất. Như
vậy, có thể thấy số lượng tế bào nấm men đạt cao nhất ở giai đoạn logarit, song sinh
khối tế bào lại đạt cao nhất ở giai đoạn ổn định vì khối lượng tế bào ở giai đoạn này
lớn.
Hình 4: Quá trình sinh trưởng của nấm men
(Dulce María Díaz-Montaño, 2013)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.2.6. Các yêu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men trong
điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào
a. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn carbohydrate,
nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lượng như K, Na, Mg, Ca và vitamin.
b. Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, hoạt tính trao đổi chất của nấm men và
chất lượng của sản phẩm lên men. Các nhà sản xuất cần chọn nhiệt độ lên men thích
hợp để tăng năng suất và chất lượng sàn phẩm cao nhất, đồng thời tiết kiệm được chi
phí sản xuất. Thông thường, quá trình lên men ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài. Ngược lại,
lên men ở nhiệt độ quá cao sẽ làm giảm bất thuận nghịch hoạt tính trao đổi chất của vi
sinh vật. Nếu chúng ta lên men thực phẩm ở nhiệt độ cao thì sự tổn thất các cấu tử
hương trong sản phẩm sẽ gia tăng. Trong công nghệ lên men thực phẩm, nhiệt độ tối
ưu của quá trình lên men có thể không trùng với nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của
vi sinh vật. Ví dụ như trong sản xuất bia, khi sử dụng nấm men chìm thì nhiệt độ thích
hợp của quá trình lên men chính và lên men phụ lần lược là 6-14°C và 0-2°C. Còn
nhiệt độ tối ưu của nấm men chìm là 28-30°C. Lên men bia ở nhiệt độ thấp nhằm mục
chúng tăng nhanh lượng sinh khối tế bào. Trong quá trình trao đổi chất của hầu hết
nấm men đều không sinh ra độc gây hại cho sức khỏe con người và vật nuôi nên chúng
đươc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm như sản xuất rượu, bia,
nước giải khác có cồn, làm men bánh mì, chế biến các thực phẩm sữa lên men,… cho
người và thức ăn gia súc. Trong đó, việc ứng dụng nấm men vào việc lên men các sản
phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol rất đáng được quan tâm, nguồn ethanol giá
thành rẽ sẽ đóng góp đáng kể vào việc giải quyết các vấn đề về nhiên liệu và ô nhiễm
môi trường.
Trong quá trình lên men, ngoài ethanol, CO
2
, các sản phẩm khác cũng tạo ra
như glycerol, ester, acid hữu cơ, aldehyde,…Sự hiện diện của các sản phẩm này phụ
thuộc vào chủng nấm men và điều kiện lên men.Chúng góp phần quan trọng trong việc
tạo hương vị cho rượu. Để sản xuất sản phẩm lên men có đặc tính đặc trưng, thì cần
phải chọn lọc chủng nấm men thích hợp cho từng sản phẩm.
Người ta còn sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào, sản xuất vitamin,
enzyme,…và đặc biệt là chủng Saccharomyces cerevisiae đang được sử dụng để mang
các DNA tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới trong ngành
Công nghệ Sinh học hiện đại. Tuy nhiên, cũng có một số chủng nấm men gây bệnh
cho người và gia súc như Candida albican, Cryptoccocusneoforman,…gây hư hỏng
thực thực phẩm như Endomycopisis fiibuligera, Saccharomyces bisporus,…
Việc chọn lọc các chủng nấm men thường dựa vào hai yếu tố:
- Tốc độ lên men: để so sánh khả năng lên men của các chủng nấm men,
phương pháp thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm là phương pháp lên
men trong chai Durham. Phương pháp này so sánh cường độ lên men dựa vào khí CO
2
sinh ra trong quá trình lên men rượu. Trong cùng thời điểm lượng CO
2
sinh ra nhiều
phát triển ở nhiệt độ 47ºC (Anderson et al., 1986), 40ºC (Hughes et al., 1984), thậm
chí là 52ºC (Banat et al., 1992) và sản sinh ethanol ở nhiệt độ cao trên 40ºC (Fonseca
et al., 2008). Hơn nữa, K. marxianus còn có thuận lợi là tốc độ phát triển cao (Pecota
et al., 2007) và khả năng sử dụng rộng rãi các cơ chất trong công nghiệp như đường
mía, bắp, nước trái cây, rỉ đường, (Nonklang et al., 2008). Ngoài Kluyveromyces
marxianus, quá trình lên men ở nhiệt độ cao còn có thể kể đến Saccharomyces uvarum
Copyright: Tài liệu đại học ©