BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ược HÀ NỘI
----- o ó o -----

NGUYỄN HẢI LINH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NIFEDIPIN
TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ ĐE ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ
DỤNG VIÊN NÉN NIFEDIPIN TÁC DỤNG KÉO DÀI

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC
KHOÁ 1997-2002

Giáo viên hướng dẫn : TS. Võ Xuân Minh
ThS. Phạm Thị Minh Huệ
Nơi thực hiện
: Bộ môn Bào chế - ĐH Dược
Trung tâm kiểm nghiệm
dược quân đội
Thời gian thực hiện : 01/03 đến 25/5/2002

Hà N ội-5/2002


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới
các thầy giáo, cô giáo:
TS: Vỗ Xuân Minh
ThS: Phạm Thị Minh Huệ
Và các thầy cô giáo, cán bộ công nhân viên bộ môn bào chế, bộ môn
dược lý, bộ môn dược lâm sàng, phòng thí nghiệm GMP trường Đại học


RSD

Độ lệch chuẩn tương đối.

SD

Độ lệch chuẩn.

SKD

Sinh khả dụng.

t°c

Nhiệt độ.

TB

Trung bình.

TDKD

Tác dụng kéo dài.


MỤC LỤC
ĐẶT VÂN ĐỂ
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Nifedipin...........................................................

20
2.2.1. Khảo sát một số hệ dung môi pha động để định lượng nifedipin
trong huyết tương chó bằng HPLC............................................................... 20
2.2.2. Xây dựng đường chuẩn nifedipin trong huyết tương chó........23
2.2.3. Xác định tính chính xác và độ lặp lại của phương pháp............ 24
2.2.4. Xác định hiệu suất chiết của nifedipin trong huyết tương chó . 26
2.2.5. Định lượng nifedipin trong huyết tương chó...............................27
2.3. Bàn luận...........................................................................
34

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT.
3.1. Kết luận..........................................................................
3.2. Đề xuất.................................................................................

35
35


Đ Ặ T V Ấ N ĐỂ
Một chế phẩm thuốc mới bào chế, đặc biệt là thuốc tác dụng
kéo dài thì việc so sánh sinh khả dụng in vivo với chế phẩm đối
chiếu (đã có uy tín về hiệu quả điều trị) là việc làm thực sự cần
thiết để chứng minh tính khả dụng sinh học của nó. Hiện nay, rất
ít các xí nghiệp sản xuất dược phẩm và trung tâm nghiên cứu về
dược trong nước nghiên cứu vấn đề này vì khó khăn về trang thiết
bị và phương pháp nghiên cứu...
Nifedipin là thuốc chẹn kênh calci, dùng để điều trị cao huyết
áp và đau thắt ngực, đây là bệnh đòi hỏi người bệnh phải sử dụng
thuốc thường xuyên, kéo dài. Nifedipin có thời gian bán thải ngắn
(t1/2 = 2-5 giờ) nên cần được bào chế dạng thuốc tác dụng kéo dài.

TLPT: 346,34
Tên khoa học:

3,5 Pyridine dicarboxylic acid, 1,4- dihydro-

2,6- dimethyl - 4- (2- nitrophenyl) - dimethyl ester.
(Dimethyl 1,4- dihydro- 2,6 dimethyl- 4(0- nitrophenyl) - 3,5
- pyridine dicarboxylate)
Tinh thể bột màu vàng, hầu như không tan trong nước, tan
trong methanol, ethanol, 10 phần aceton, dễ tan trong cloroform.
Dưới

tác

dụng

của

ánh

sáng

dễ

bị

biến

đổi


- Chống loạn nhịp tim.
- Điều trị cao huyết áp thể vừa và nhẹ.
- Điều trị triệu chứng các hiện tượng Raynaud sơ hay thứ phát.
1.1.5. Tác dụng bất lợi [12]
ít xảy ra, thường xảy ra đối với những người mới dùng thuốc,
xảy ra khi ngay mới bắt đầu điều trị. Có thể gây cơn bốc hoả đỏ

3


bừng mặt, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, buồn nôn, đầy bụng, hạ
huyết áp thế đứng, chậm nhịp tim, bloc nhĩ thất, phù chi dưới,...
Triệu chứng bất lợi tăng trong chứng thiếu máu cục bộ đau
thắt ngực, tăng nhạy cảm với thuốc khi chức năng thận suy giảm.
1.1.6. Liều dù ng [1 2],[1]
- Liều thường dùng là lOmg

X

3 lần/ ngày. Uống sau bữa ăn và

tăng dần liều nếu cần.
- Liều tối đa : 180mg/ ngày- Dùng theo chỉ dẫn của bác sĩ.
- Với bệnh nhân cao tuổi hoặc khi dùng kèm thuốc khác, liều bắt
đầu là 5mg X 3 lần/ ngày.

- Dạng đặt dưới lưỡi hoặc ngậm cho hiệu quả nhanh sau 5 - 10
phút. Uống nhắc lại sau 5-15 phút.
- Trong cơn tăng huyết áp: Uống 10- 20mg, hiệu quả sau 15 - 20
phút, uống nhắc lại sau 30 phút.

đến khi màu hồng biến mất.
Phương pháp vât lv: T221 sử dụng phương pháp HPLC.
Nguyên tắc của phương pháp: Các chất trong hỗn hợp được
tách dựa trên khả năng phân bô khác nhau của chúng vào hai pha
không hòa lẫn vào nhau luôn tiếp xúc, một pha tĩnh và một pha
động.
- Pha động gồm: nước/acetonitril/ methanol với tỷ lệ 50: 25 :
25 v/v.
- Detector UV: 235 nm.
- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được pha bằng cách hoà
tan chất chuẩn và chất thử trong methanol, sau đó pha loãng bằng
pha động. Tiến hành chạy sắc ký, ghi sắc đồ. Tính kết quả dựa
trên các pic chuẩn.
b - Định lượng nifedipin trong viên nén
+ Phương pháp đo quang[16]:

5


- Dung dịch thử: Nghiền viên chứa niíedipin thành bột mịn,
hoà tan trong methanol, lọc lấy dịch trong sau đó pha loãng bằng
nước cất
- Dung dịch chuẩn: Tiến hành song song cùng điều kiện với
dung dịch thử.
Tiến hành đo quang dựa vào mật độ quang của chất chuẩn,
chất thử ta tính được hàm lượng niíedipin trong viên.
+ Phương pháp HPLC[22]:
- Pha động: nước/acetonitril/ methanol với tỷ lệ 50:25:25 v/v,
- Detector UV: 235 nm.
- Dung dịch thử: Nghiền viên chứa niíedipin thành bột mịn,

gồm: phương pháp sắc kí khí, sắc kí lỏng hiệu năng cao.
* Phương pháp sắc kí khí để định lượng niíedipin trong huyết
tương gặp một số khó khăn: Nhiệt độ cao sẽ ảnh hưởng đến
nifedipin, độ lặp lại thấp. Kết quả của phương pháp này sẽ bị giảm
khi xuất hiện một lượng đáng kể các chất có nguồn gốc từ pyridin
trong mẫu sinh học.
* Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao để định lượng niíedipin
trong huyết tương đã được nghiên cứu nhiều. Nó có khả năng định
tính, định lượng với hàm lượng niíedipin hàng nanogam trong lm l
huyết tương.
Với sắc kí lỏng

" hiệu năng cao thì việc lựa chọn pha động

để chạy sắc kí rất quan trọng. Nó ảnh hưởng đến thời gian lưu, khả
năng tách và diện tích pic.
Một số pha động được sử dụng trong định lượng niíedipin.
+ Acetonitril /đệm acetat pH=4
+ M ethanol/ nước/acid acetic (thêm triethylamin)
+ M ethanol/ đệm phosphat (pH=6,l hoặc 6,7)
+ M ethanol/ nước
+ M ethanol/ dung dịch amoni/đệm acetat

7


* Một số phương pháp định lượng nifedipin trong huyết tương
bằng HPLC.
Phương pháp 1:
- Pha động: Acetonitril : đệm acetat pH=4


SKD được phản ánh bằng đường cong biến thiên của nồng độ
dược chất trong máu ở dạng còn hoạt tính theo thời gian (hoặc
đường cong biểu diễn tổng lượng thuốc ở dạng hoạt tính hoặc dạng
đã chuyển hoá được thải trừ qua nước tiểu theo thời gian).
Đại lượng đặc trưng cho SKD là: diện tích dưới đường cong
của đồ thị biểu diễn sự biến thiên nồng độ thuốc ở dạng hoạt tính
trong máu theo thời gian.
Có hai cách để đánh giá SKD của một chế phẩm:
Sinh khả dụng tuyệt đối của một chế phẩm là tỉ lệ dược chất
vào được đại tuần hoàn ở dạng còn hoạt tính so với liều thuốc đã
dùng. SKD tuyệt đối được tính bằng tỉ số giữa tổng lượng chất
được hấp thu vào đại tuần hoàn từ dạng bào chế của nó (ở liều
dùng nhất định) và tổng lượng dược chất vào được hệ tuần hoàn từ
dạng thuốc tiêm động mạch hoặc tĩnh mạch (ở liều dùng tương
đương) . Vì thuốc tiêm động mạch hoặc tĩnh mạch được coi là có
SKD là 100%.
AUCThử X DIV
SKD tuyệt đối = -------- —----------- X 100%
AUCIV X DThử
Nếu liều của hai chế phẩm như nhau và trọng lượng người thử
thuốc như nhau ta có:
A U C Thử
SKD tuyệt đối = ----------------AUC I V

X 100%

Trong đó:
AUC Thử: Diện tích dưới đường cong của chế phẩm thử
AUC IV: Diện tích dưới đường cong của dung dịch tiêm tĩnh

Cmax(A)xl00
c max(B)

>

8Q

120

>

T max(A)xl00
T max(B)

>
~~

gQ

* Các đại
- Diện

lượng để đánh giá sinh khả dụng là:
tích dưới đường cong (AUC): biểu thị mức độ hấp thu

của dược chất từ chế phẩm.
- Nồng độ đỉnh ( Cmax ): thể hiện cường độ tác dụng của thuốc.
Nồng độ đỉnh phải vượt qua nồng độ tối thiểu có tác dụng thì
thuốc mới có đáp ứng lâm sàng nhưng nếu nồng độ đỉnh vượt quá
nồng độ an toàn thì thuốc dễ gây

11


Sơ đ ồ l: Quá trình giải phóng hoạt chất của viên nén theo
John G.Wagner.
1.2.3. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng [8], [9], [22]
Hiện nay có nhiều tiêu chuẩn để đánh giá sinh khả dụng như
thử SKD in vitro, chỉ tiêu SKD in vivo: theo dõi nồng độ thuốc
trong máu,trong nước tiểu., .sau đây là một số chỉ tiêu cơ bản.
*

Độ rã của thuốc được đánh giá bằng phép thử độ rã với các

thiết bị đặc biệt được mô tả trong các Dược điển. Việc đánh giá độ
rã đã được đưa vào tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam và cũng là một
tiêu chuẩn để kiểm tra chất lượng viên nén. Trong một thời gian
dài, độ rã được coi là tiêu chuẩn về giải phóng dược chất từ viên
nén. Nhưng hiện nay, người ta thấy không có sự tương quan chắc
chắn giữa tốc độ rã và tốc độ hoà tan, nên tốc độ rã nhanh hay
chậm của thuốc thường không phải là yếu tố quyết định tốc độ và
mức độ hoạt chất được hấp thu vào đại tuần hoàn. Nó là tiêu chuẩn
bước đầu về sinh khả dụng viên nén.

12


* Độ hoà tan của một thuốc là đại lượng đặc trưng do quá
trình dược chất được hoà tan vào môi trường hoà tan hoặc dịch
tiêu hóa.Sự hoà tan có thể là quá trình bậc không hoặc bậc một.
Theo Noyes- Whitney, bước đầu tiên của quá trình hoà tan là sự


13


hay vận chuyển thuận lợi. Trong thực tế, cơ chế phổ biến nhất là
vận chuyển theo gradient nồng độ và tuân theo định luật Fick:

dC_ = D .S.K
dt
a

(Co _ Ct)

Trong đó
dC/dt: Tốc độ hấp thu
S: Diện tích bề mặt màng
a: Bề dày màng
D: Hằng số tốc độ khuyếch tán
K: Hệ số phân bố dầu/nước
Co-Ct: Sự chênh lệch nồng độ trong và ngoài màng.
Để đánh giá sự hấp thu của thuốc, phải sử dụng phương pháp
in vivo. Thuốc cần nghiên cứu được đưa vào cơ thể sống (người
hoặc súc vật thí nghiệm) theo những đường khác nhau. Sau những
khoảng thời gian xác định, người ta lấy mẫu máu (máu, nước tiểu),
đem chiết lấy hoạt chất và xác định hàm lượng thuốc (có thể ở
dạng chuyển hoá hoặc chưa chuyển hoá). Để xác định thuốc trong
dịch sinh học, có nhiều phương pháp khác nhau nhưng hay được sử
dụng nhất là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vì
khả năng tách cao, định tính và định lượng đồng thời hoạt chất ở
hàm lượng rất nhỏ.

sự là một công việc khó khăn, phức tạp kể cả với các nước có công
nghệ phát triển.
Nói chung SKD in vitro chỉ là công cụ để dự doán SKD in
vivo.

15


PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHẤP THựC NGHIỆM.

.

2.1.1 Nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu và súc vật thí nghiệm.
* Nguyên vật liệu :
Nifedipin (Sankyo Pharma GmbH, Đức)
Methanol (HPLC grade- Merck)
Acetonitril (HPLC grade- Merck)
Acid acetic băng (PA- Merck)
Natri acetat (PA- Merck)
Trietylamin (PA- Merck).
Dicloromethan (PA- Merck),
n- pentan (PA- Merck).
Natrihydroxit 0,1M (Trung Quốc).
* Phương tiện nghiên cứu:
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (Dionex, Mỹ)
Cột sắc ký (Lichrospher RP -18 (5|im) 250x4, Merck - Đức)
Hệ thống bơm mẫu tự động.
- Cân phân tích (Mettle Toledo - Đức)
- Máy đo PH (Mettle Toledo - Đức)

7 bổ sung chất điện giải và dung dịch glucose 20%

bằng cách tiêm vàcKbụng).
Tiến hành thử chéo trên 3 chó, mỗi chó được uống 2 loại viên: niíedipin

TDKD và viên Adalat retard, thời gian giữa 2 lần thử là 2 tuần.
b. Phương pháp lấy mẫu:
Chó sau khi uống thuốc sẽ được lấy máu ở tĩnh mạch đùi tại các thời
điểm: Oh; 0,5h; lh; 2h; 4h; 6h; 9h; 12h (mẫu Oh được lấy trước lúc cho uống
viên thứ 7 - vào buổi sáng ngày lấy mẫu), số lượng mỗi mẫu máu là 3ml. Máu
cho vào ống nghiệm tráng sẵn heparin chống đông sau đó đem li tâm vói tốc
độ 5000 vòng/ phút, thời gian 10 phút.
Tách lấy phần huyết tương cho vào ống nghiệm đã được bọc giấy nhôm
bảo vệ chống ánh sáng, sau đó đem định lượng ngay hoặc bảo quản ở tủ lạnh
sâu - 20°c.
Các bước tiến hành vói mẫu huyết tương cần tránh ánh sáng hoặc thao
tác dưới ánh sáng đèn natri để tránh sự phân huỷ của niíedipin.

17


c.Phương pháp xây dựng đường chuẩn.
* Xây dựng đường chuẩn trong pha động:
Cân một lượng chính xác nguyên liệu nifedipin hoà tan trong pha động
(dùng máy siêu âm để hoà tan), thu được dung dịch chuẩn A. Từ dung dịch A,
dùng pha động để pha thành các dung dịch có nồng độ từ 10 - 320 ng/ml

Lọc qua màng millipor và tiến hành chạy sắc kí.
- Pha động: Tuỳ vào hệ dung môi khảo sát (pha động được lắc siêu âm 10 phút
để đuổi khí, chỉ sử dụng trong ngày).

khảo sát.
- Độ lặp lại của diện tích pic tại nồng độ khảo sát nằm trong giới hạn sai số
5%
- Các pic thu được phải gọn, tách riêng với các pic tạp, thời gian chạy mẫu
phải thích hợp để loại tạp tránh sai số khi định lượng mẫu tiếp theo.
d. Phương pháp định lượng nỉfedipin trong huyết tương.
Định lượng niíedipin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC vói hệ
sắc kí thu được sau khi khảo sát ở mục 2.1.2 b.
Mẫu huyết tương của chó đã uống thuốc được định lượng sau khi xử lý
theo sơ đồ 2 (không cho thêm niíedipin). Tiến hành định lượng song song
từng mẫu thử và chuẩn ở cùng thời điểm của cùng một chó.
Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic, từ diện tích pic tính được
nồng độ niíedipin trong máu theo phương pháp đường chuẩn.
e. Phương pháp xử lý số liệu.
Các số liệu thu được được xử lý theo phương pháp thống kê toán học dựa
trên phân bố student với khoảng tin cậy xác suất thống kê là 0,05.
Các thông số DĐH cơ bản: T1/2, AUC, MRT (hệ số lưu trú trung bình của
thuốc), Ke được tính trên phần mềm Winnolin.

.

2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

2.2.1. Khảo sát một số hệ dung môi pha động đ ể định lượng
niýedipin trong huyết tương chó bằng HPLC.
a. Pha động 1: Acetonitril/đệm acetat pH = 4 với tỷ lệ 55/45 v/v.
* Xây dựng đường chuẩn niíedipin trong pha động.
+ Cân lượng chính xác 20mg niíedipin cho vào bình định mức
25ml hoà tan bằng pha động (lắc siêu âm để hoà tan), thêm pha
động đến vạch lắc đều được dung dịch A. Pha loãng dung dịch A


6525

11626

20547

Từ bảng 1 xây dựng phương trình đường chuẩn niíedipin trong
hệ pha động 1

Nồng độ (ng/ml)
Hình 1: Đường chuẩn niíedipin trong hệ pha động 1

b. Pha động 2: Methanol/nước/acid acetic với tỷ lệ 65/35/1 (trộn
đều và thêm 300|il triethylamin trong lOOOml hỗn hợp trên).
+ Cân lượng chính xác 20mg niíedipin cho vào bình định mức
25ml hoà tan bằng pha động (lắc siêu âm để hoà tan), thêm pha

21