BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-----------

-----------

NGUYỄN THỊ NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN
ĐƯỢC GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM BẰNG CHỦNG VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN
(PRRSV-BN-10)

CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y
MÃ SỐ

: 60.64.01.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
PGS.TS. NGUYỄN HỮU NAM

HÀ NỘI – 2014


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung
thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được



MỤC LỤC
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

v

Danh mục các chữ viết tắt

vi

Danh mục bảng

viii

DBảng 1anh mục hình

ix

MỞ ĐẦU

1


Tình hình hội chứng PRRS tại Việt Nam

6

1.2

Virus PRRSV

8

1.2.1

Hình thái, cấu tạo

8

1.2.2

Phân loại virus PRRS.

11

1.2.3

Sức đề kháng của virus PRRS.

12

1.2.4


Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS

16

1.3.5

Bệnh tích của lợn mắc PRRS

17

1.3.6

Các phương pháp chẩn đoán PRRS

18

1.4

Các biện pháp phòng chống dịch

20

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


23

2.4.2

Động vật thí nghiệm

23

2.4.3

Hóa chất

24

2.4.4

Dụng cụ

24

2.5

Phương pháp nghiên cứu

24

2.5.1

Phương pháp gây bệnh thực nghiệm


29

2.5.7

Phương pháp thống kê, xử lý số liệu

32

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

33

3.1

Kết quả trước khi gây bệnh thực nghiệm cho lợn

33

3.1.1

Kết quả theo dõi thân nhiệt các lợn trước khi gây bệnh thực nghiệm.

33

3.1.2

Kết quả xét nghiệm kháng thể kháng virus PRRS bằng phương pháp
Elisa.

3.1.3

Page iv


3.2.3

Một số bệnh tích vi thể của lợn gây bệnh thực nghiệm chủng virus
PRRSV-BN-10

52

3.2.4

Kết quả xét nghiệm sự có mặt của PRRSV trong các cơ quan

56

3.2.5

Hàm lượng kháng thể kháng PRRSV bằng phương pháp ELISA

59

3.2.6

Sự phân bố của virus chủng PRRSV- BN-10 trong các cơ quan lợn sau
khi được gây bệnh thực nghiệm.

61

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ


Thí nghiệm

BED

Blue Ear Disease

cs

Cộng sự

ĐTB

Đại thực bào

ELISA

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

HLB

Hạch lâm ba

HE

Hematoxylin & Eosin

IPMA

Immuno – Peroxidase Monolayer Assay

RNA

Ribonucleic Acid

RT – PCR

Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction

BCĐNTT

Bạch cầu đa nhân trung tính

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC BẢNG

STT

Tên bảng

1.1

Protein cấu trúc của PRRSV

1.2

Sự tương đồng về nucleotide của các chủng PRRS khi so sánh với

bằng phương pháp RT – PCR

3.4

36

Thân nhiệt của lợn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus
PRRSV-BN -10 (0C)

3.5

38

Tần số hô hấp của lợn trước và sau khi gây bệnh thực nghiệm cho lợn
bằng chủng virus PRRSV-BN-10 (lần/phút)

3.6

41

Tần số tim của lợn trước và sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng chủng
virus PRRSV-BN-10 (lần/phút)

43

3.7

Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở lợn được gây bệnh thực nghiệm

45


Page vii


3.12

Hàm lượng kháng thể kháng PRRSV bằng phương pháp ELISA sau
khi gây bệnh thực nghiệm cho lợn

3.13

59

Sự phân bố virus trong các cơ quan của lợn được gây bệnh thực
nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

62

Page viii


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Trang


3.1

Đồ thị biểu diễn thân nhiệt của lợn trước khi gây bệnh thực nghiệm

34

3.2

Đồ thị biểu diễn hàm lượng kháng thể kháng PRRSV trước khi gây
bệnh thực nghiệm

3.3

35

Kết quả phản ứng RT – PCR với mồi ORF5 trước khi gây bệnh thực
nghiệm

36

3.4

Gây bệnh thực nghiệm cho lợn thí nghiệm

37

3.5

Đồ thị thân nhiệt độ của lợn trước và sau khi gây bệnh thực nghiệm
chủng virus PRRSV-BN-10

61

Page ix


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi đang ngày càng phát triển mạnh và
giữ một vị trí quan trọng trong nền kinh tế của nước ta. Đặc biệt, chăn nuôi lợn đã có
nhiều thay đổi đáng kể, đáp ứng được phần lớn nhu cầu về thực phẩm cho người dân.
Sản phẩm của ngành chăn nuôi lợn cung cấp nguồn thực phẩm chủ yếu cho nhân loại.
Ở nhiều nước trên thế giới, mức tiêu thụ thịt lợn tính trên đầu người chiếm tỷ lệ cao so
với các loại thịt khác. Ở Việt Nam, tỷ lệ thịt lợn hơi tính theo đầu người chiếm 72,94%
trên tổng số các loại thịt được tiêu thụ hàng năm. Chăn nuôi lợn đã trở thành nguồn thu
nhập quan trọng đối với các hộ nông dân và là một trong những nghề góp phần chuyển
dịch cơ cấu kinh tế trong nông nghiệp.
Cùng với sự phát triển của chăn nuôi, lưu lượng động vật và sản phẩm động
vật lớn, kèm theo đó là sự gia tăng về tình hình dịch bệnh. Đã có rất nhiều bệnh
được du nhập vào nước ta theo con đường lưu thông, vận chuyển trong đó có Hội
chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS). Đây là một bệnh truyền nhiễm
nguy hiểm gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi. Bệnh có tốc độ lây lan nhanh trên
đàn lợn mọi lứa tuổi với tỷ lệ ốm và tỷ lệ loại thải cao, gây thiệt hại nghiêm trọng về
kinh tế.
Để tìm môi trường phân lập virus phù hợp làm cơ sở khoa học cho việc
nghiên cứu sản xuất vacxin đặc hiệu phòng bệnh cho lợn thì việc hiểu rõ về biến
đổi bệnh lý, sự phân bố virus, đặc điểm bệnh lý một số cơ quan của lợn được gây
bệnh thực nghiệm là hết sức cần thiết.
Xuất phát từ yêu cầu trên của thực tiễn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn được gây bệnh thực nghiệm bằng
chủng virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV-BN-10)”.

gây bệnh khác, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh ở hệ hô hấp (Phạm Gia Ninh
biên dịch, 2000).
Kể từ khi xuất hiện cho đến nay, bệnh đã được gọi với nhiều tên khác
nhau. Thời gian đầu do chưa xác định được nguyên nhân nên người ta đặt tên
gọi cho dịch bệnh này là Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery swine disease – MDS);
một số tác giả khác căn cứ vào bệnh tích ở tai thì gọi là bệnh Tai xanh (Blue
Ear disease – BED); hoặc căn cứ vào các hậu quả dịch bệnh gây ra thì gọi là
Hội chứng hô hấp và xảy thai ở lợn (Porcine endemic abortion and respiratory
syndrome – PEARS).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


Đến năm 1992, tại Hội nghị Quốc tế về hội chứng này tổ chức tại
Minesota (Mỹ), tổ chức Dịch tễ học thế giới (OIE) đã thống nhất tên gọi là
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine respiratory and
reproductive syndrome - Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản). Kể từ đó cho
đến nay, tên này đã trở thành tên gọi chính thức của bệnh.
Về tình hình diễn biến dịch trên thế giới cho thấy, từ năm 2005 trở
lại đây, đã có 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới
đều có dịch Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản lưu hành (trừ châu Úc và
Newzeland). Do vậy, có thể khẳng định rằng Hội chứng rối loạn hô hấp và
sinh sản là một nguyên nhân gây tổn thất lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi
lợn của nhiều quốc gia trên thế giới (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2007).

Hình 1.1. Bản đồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới
Tại Trung Quốc, dịch bệnh PRRS đã xuất hiện trong những năm gần
đây và hiện đang còn tồn tại. Theo Tian và cs ( 2007) virus PRRS gây ra đại

nái vào giai đoạn thích hợp để chẩn đoán huyết thanh phát hiện Hội chứng rối
loạn sinh sản (Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản).
Segales.J và cs (1998) nghiên cứu siêu cấu trúc đại thực bào ở túi phổi
lợn bị nhiễm in – vitro với virut gây Hội chứng rối loạn sinh sản đối với
trường hợp có hoặc không có Haemophilus – Parasuis.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


Burch Reina Alemany và cs, (1997) tìm hiểu về chủng virut suy yếu
gây ra Hội chứng rối loạn sinh sản (Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản)
trên lợn, cùng với việc chế vacxin.
Van Niewstadt và cs, (2002) nêu ra loại kháng nguyên Hội chứng rối
loạn hô hấp và sinh sản dùng để phát hiện ra chuỗi peptide đồng đẳng của
virut Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản dùng trong điều chế vacxin hoặc
xét nghiệm chẩn đoán.
Calvert Jay G và cs, (2007) thuộc khoa Thú y trường Đại học Minesota
của Mỹ đã nghiên cứu về những đặc điểm phân loại, cấu tạo, khả năng gây bệnh
của virut cũng như những triệu chứng lâm sàng thường gặp khi lợn bị bệnh ở Mỹ
và một số nước Châu Âu thấy rằng các chủng virut ở Mỹ và châu Âu có sự khác
biệt nhau về bộ gen, tức là virut ở 2 nơi này đã có sự biến đổi về cấu trúc.
Calvert Jay G và cs, (2007) nghiên cứu về bản sao chuỗi AND bị nhiễm
virut Hội chứng rối loạn sinh sản trên lợn Bắc Mỹ cùng phương pháp sử dụng nó.
Joo Han - Soo và cs (2007) đi sâu vào tìm hiểu về phương pháp chuẩn
bị virut Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản, Protein lây nhiễm và bộ kít để
kiểm tra và phát hiện nó.
Lunney Joan K và cs (2007), X.J.Meng (2000) chỉ ra các thông số miễn
dịch giúp giải thích được nguyên nhân tại sao một số lợn trên cùng một đàn

triển mạnh tại 146 xã, phường thuộc 25 huyện, thị xã của 9 tỉnh là: Hải
Dương, Hưng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Bắc Kạn,
Nam Định và Hải Phòng. Số lợn mắc bệnh là 31.928 con, số lợn chết và xử lý
là 7.464 con.
Đợt dịch thứ 2: Ngày 25/6/2007, dịch bắt đầu xuất hiện tại tỉnh Quảng
Nam, sau đó dịch đã lây lan ra trên diện rộng: 178 xã, phường của 40 huyện,
thị xã thuộc 14 tỉnh, thành phố là: Cà Mau, Long An, Bà Rịa - Vũng Tàu,
Khánh Hoà, Bình Định, Quảng Ngãi, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên
Huế, Quảng Trị, Lạng Sơn, Hà Nội, Thái Bình, Hải Dương. Tổng số lợn ốm
là 57.017 con, số chết và xử lý là 11.753 con.
Như vậy, trong năm 2007, dịch PRRS đã xuất hiện tại 405 xã, thuộc 75

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


huyện của 21 tỉnh, thành phố. Tổng số gia súc mắc bệnh là 88.945 con, số
chết và phải tiêu huỷ là 19.217 con.
Năm 2008: tính từ ngày 20/3/2008 khi dịch xuất hiện ở nhiều xã thuộc
tỉnh Hà Tĩnh. Dịch đã xuất hiện ở 949 xã, phường của 99 huyện, thị xã thuộc 28
tỉnh là: Bạc Liêu, Lâm Đồng, Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Hà Tĩnh, Nghệ An,
Thanh Hoá, Ninh Bình, Nam Định, Thái Bình, Thái Nguyên… Tổng số lợn mắc
bệnh là 298.095 con, số chết và phải tiêu huỷ là 286.351 con.
Năm 2009: Từ đầu năm 2009 đến nay dịch xảy ra ở 49 xã thuộc 14
huyện của 8 tỉnh, thành phố: Hưng Yên, Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng
Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng Tầu và Đắk Lắk với 5.044 lợn mắc
bệnh và 4.363 lợn buộc phải tiêu huỷ.
Năm 2010: tháng 3/2010 dịch bệnh PRRS tái xuất hiện ở Hải Dương sau
một thời gian lắng xuống rất nhanh chóng phát tán cả 3 miền Bắc, Trung, Nam.

1.2. Virus PRRSV

1.2.1 Hình thái, cấu tạo
* Cấu trúc hạt: PRRSV là một virus có hình cầu, đường kính 50 70nm, chứa nucleocapsid cùng kích thước có cấu trúc đối xứng 20 mặt,
đường kính 35nm, được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ bọc dính chặt
với cấu trúc bề mặt giống như tổ ong, trên bề mặt có những gai nhô ra, vỏ
có chứa lipid.
Bộ gen của virus PRRS là chuỗi dương ARN có kích thước từ 1315kb. Sợi ARN của virus có đầu 5’ và đầu 3’. Gen ARN polymeraza chiếm
khoảng 75% đầu 5’ của bộ gen, gen này mã hoá cho các protein cấu trúc của
virus nằm ở đầu 3’.

Hình 1.2: Cấu trúc hạt của PRRS virus

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


Hạt virus bao gồm 1 protein nucleocapsid N có khối lượng phân tử
1.200bp, 1 protein màng không có đường glucose hình cầu M với khối lượng
phân tử 16.000bp, 2 protein peplomer N – glycosylate là GS có khối lượng
phân tử 25.000bp và GL có khối lượng phân tử 42.000.
Acid Nucleic: Sự nhân lên của virus không bị ảnh hưởng khi dùng
hợp chất ức chế tổng hợp ADN là 5-bromo-2-deoxyuridin, 5-iodo-2deoxyuridin và mitomycin C chứng tỏ axit nucleic đó là ARN. Sợi ARN
này có kích thước khoảng 15kb

Hình 1.3: Cấu trúc bộ gen của PRRS virus

Cấu trúc hệ gen của PRRSV bao gồm 7 khung đọc mở (ORF), gồm:
ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7. Trong đó, ORF1 được


GP 4

31 KD

ORF 4

GP 2

29 KD

ORF 2

GP 5

25 KD

ORF 5

Bám dính tế bào đa dạng nhất

M

19 KD

ORF 6

Có tính bảo tồn cao nhất

N

chức hệ gen, cũng như cách nhân lên của virus thì có thể xếp chúng vào nhóm
virus động mạch (Arterivirus) mới (Meulenberg và cs, 1993).
1.2.2. Phân loại virus PRRS.
Virus PRRS là một virus ARN chuỗi đơn, có màng bọc, thuộc giống
Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales (Cavanagh và cs, 1997). Hiện
nay có 2 kiểu gen PRRS chính được công nhận là:
Kiểu gen 1 (Nhóm 1): Các nhóm virus thuộc dòng Châu Âu với tên gọi
phổ thông là virus Lelystad (Meulenberg và cs, 1993).
Kiểu gen 2 (Nhóm 2): Các nhóm virus thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu
cho chủng này là chủng virus VR-2332 (Nelsen và cs, 1999).
Bảng 1.2: Sự tương đồng về nucleotide của các chủng PRRS khi so sánh với
chủng Bắc Mỹ VR2332

Chủng

Nước phát hiện

Tỷ lệ % tương đồng

VR2332

Hoa Kỳ

100

Taiwan

Đài Loan

97


subtyp: I 10 phân lập tại Hà Lan và Olot tại Tây Ban Nha. Chính sự khác biệt và
sự đa dạng về tính kháng nguyên, khả năng biến đổi cấu trúc kháng nguyên của
virus đã làm tăng khó khăn cho việc sản xuất vacxin chống lại chúng.
1.2.3. Sức đề kháng của virus PRRS.
Mặc dù virus PRRS có vỏ bọc, nhưng sự sống sót của chúng bên ngoài
vật chủ vẫn chịu tác động của nhiệt độ, pH và sự tiếp xúc với các chất tẩy uế.
PRRSV có khả năng sống sót trong khoảng thời gian dài hơn 4 tháng ở
nhiệt độ dao động trong khoảng – 700C đến – 200C, 20 phút ở 560C, 24 giờ ở
300C và 6 ngày ở 210C (Benfield và cs, 1992). Tuy nhiên khả năng sống của
virus PRRS giảm nhanh khi nhiệt độ tăng lên.
Bảng 1.3: Sức đề kháng của virus với điều kiện ngoại cảnh
Điều kiện môi trường

Khả năng đề kháng

Virus trong bệnh phẩm:
0

- 70 C đến -200C

Nhiều năm

0

1 tuần ở 4 C

Giảm 90% hiệu giá

1 tháng ở 40C

0

Vẫn phát hiện được virus
0

72 giờ ở 4 C hoặc – 20 C

PRRSV bền vững ở pH dao động trong khoảng 6,5 đến 7,5. Tuy
nhiên tính gây bệnh thực nghiệm giảm ở pH < 6,0 hoặc pH > 7,65 (Paton
và cs, 1991).
Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu
diệt virus. Ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


1.2.4 Khả năng gây bệnh
PRRSV chỉ gây bệnh cho lợn, lợn ở tất cả các lứa tuổi đều cảm
nhiễm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả. Lợn
rừng cũng mắc bệnh.
Về mặt độc lực, người ta thấy PRRSV tồn tại dưới 2 dạng:
Dạng cổ điển: có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì có tỷ lệ
chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tổng đàn.
Dạng biến thể độc lực cao: gây bệnh thực nghiệm và chết nhiều lợn
(Kegong Tian và Yu, 2007); (Tô Long Thành và Nguyễn Văn Long, 2008).
1.3. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản

1.3.1. Đặc điểm chung

dường như hiệu giá kháng thể kháng lại các loại virus và vi khuẩn khác không
liên quan trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của đại thực bào trong
hệ thống miễn dịch. Điều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc đánh giá
mức độ miễn dịch đối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn.
Khi tế bào đại thực bào bị virus phá huỷ, các phản ứng miễn dịch
không xảy ra được, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và
dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát. Có nhiều báo cáo về nhiễm trùng
kế phát ở đàn lợn trong ổ dịch PRRS, đặc biệt ở chuồng nuôi lợn sơ sinh. Tác
nhân chủ yếu liên quan đến nhiễm trùng kế phát là: Haemophilus parasuis,
Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Pasteurella multocida và
Actinobacillus pneuropneumoniae, SIV, EMCV, virus giả dại (Aujeszky),
Porcine cytomegalovirus, Porcine respiratory coronavirus và Porcine
paramyxovirus.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14


Điều này cũng có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt,
khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do
những vi khuẩn vốn sẵn có trong đường hô hấp.
Viêm phổi làm thiếu oxy nên gây rối loạn chuyển hóa của thai, thai bị
suy dinh dưỡng và gây chết thai, sảy thai. Lợn chửa kỳ cuối thì nhu cầu oxy
tăng cao vì phải nuôi thai, ở thời kỳ cuối thai tăng trưởng rất nhanh nên nhu
cầu về oxy tăng gấp bội, vì vậy lượng thiếu hụt oxy càng nghiêm trọng, nên
thai hay sảy vào kỳ cuối. Sau sảy thai tế bào nội mạc tử cung bị thoái hóa,
hoại tử nên làm chậm các quá trình sinh lý khác.
* Phương thức truyền lây
Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn ốm, hoặc