ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
NGUYỄN THỊ QUY

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT SILUMARIN TỪ HẠT KẾ SỮA
VÀ AXIT AMIN TỪ ĐẬU TƯƠNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC
PHẨM CHỨC NĂNG TĂNG CƯỜNG CHỨC NĂNG GAN

Ngành: Sinh học

2015


1

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự
nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hƣớng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô,
cũng nhƣ sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học
tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm Việt
Cƣờng- Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển, ngƣời đã hết lòng
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này.
Đồng thời, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tớ
các anh chị em trong phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển đã tận
tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành đề tài luận văn.
Xin chân thành biết ơn đến toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn Vi sinh
vật học đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng nhƣ tạo mọi điều
kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và cho đến
khi thực hiện đề tài luận văn.
Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè,


1.1.4.

ủa silymarin và ứng dụng .................................... 15

1.1.5

...........................................18

1.1.6. Những thành tựu trong nghiên cứu chế phẩm silymarin ...................... 18
.............................................................. 20
1.2.1. Cây đậu tƣơng ....................................................................................... 20
............................................. 20
.................................................................................. 21
1.2.3.1. Thành phần Protein đậu tƣơng ........................................................... 21
1.2.3.2. Tính chất của Protein đậu tƣơng ........................................................ 21
ậu tƣơng .......................... 23
............................................... 26
2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 26
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 26
2.1.2. Hoá chấ

............................................................................... 26

2.2. Phƣơng pháp............................................................................................ 27


3

silymarin


..................................................................... 32

CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ ................................................................................ 33
................................................. 33
ết xuất silymarin ....................... 33
3.1.2. Kết

sắc kí HPLC ............................................................................ 37
ả

........... 39
ận axit amin tự

tƣơng................................................................................................................ 42
3.4. Một số đặc tính sinh học của chế phẩm chứa sylimarin .......................... 47
............................................................................ 48
............................................................................. 49
3.4.3.

................................................................................... 52

3.4.3.1. Tác dụng trên lƣu lƣợng mật .............................................................. 53
3.4.3.2. Tác dụng trên hàm lƣợng cắn khô và bilirubin trong dịch mật.......... 54
.................................................. 56
4.1. Kết luận .................................................................................................... 56
.................................................................................................. 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 57



NaCl
cAMP

C

-

TFN-α

-

LD50

u năng cao

HPLC
SKLM
Cs
CN

Công nguyên

TPCN
WHO
UV

-


5

Bảng 3.11: Lƣu lƣợng mật ở các lô chuột thí nghiệm .................................... 53
Bảng 3.12: Hàm lƣợng cắn khô trong dịch mật của chuột thực nghiệm ........ 54
Bảng 3.13: Hàm lƣợng bilirubin trong dịch mật của chuột thực nghiệm ....... 54


6

...................................................10
.....37
3.2: Sắc ký đồ mẫu silymarinthu đƣợc sau khi tách chiế
................................................................................38
3.3: Sắc ký đồ mẫu silybin chuẩn...........................................................38
3.4:

..................................................40

3.5

..................................44


7

V

dùng thuốc có nguồn gốc từ thảo dƣợc hoặc phối hợp sử dụng

thuốc đông dƣợc và tân dƣợc hiện

cộng đồng

[62],
[63].


8

Đã có những bằng chứng cho thấy silymarin

có tác

dụng chữa bệnh xơ gan do rƣợu. Một trong những hoạt tính triển vọng của
silymarin là chống ung thƣ, vì vậy có thể sử dụng silymarin kết hợp với
phƣơng pháp hóa trị liệu. Silymarin hoạt động nhƣ chất chống oxy hóa, bảo
vệ mô và loại bỏ chất gây độc cho gan [5], [10].
Protein đậu tƣơng đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một thành phần chức năng
trong rất nhiều loại thực phẩm chế biến bởi khả năng tạo gel và các tính chất
hóa lý, cảm quan và dinh dƣỡng cao. Việc thủy phân protein các hạt họ đậu
cải thiện các đặc tính dinh dƣỡng của chúng nhƣ làm chậm quá trình hƣ hỏng,
cải thiện cấu trúc, tăng hoặc giảm độ hòa tan, ngăn cản những tƣơng tác
không mong muốn, loại mùi khó chịu và các thành phần độc. [27], [57].
, để có thể sản xuất một số loại sản phẩm tăng cƣờng chức năng
gan cũng nhƣ hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến gan tại Việt Nam, thay thế
các sản phẩm nhập ngoại,

là cơ sở để chúng tôi thực hiện đề tài:

“

axit amin
.”

các lá phía trên và ở giữa ôm lấy thân; các lá ở dƣới rất to, có phiến chia thuỳ
và có cuống. Cụm hoa đầu đơn độc, rộng 3-10cm. Lá bắc ngoài và giữa có
một phần phụ hình tam giác màu lục thu lại thành một gai to, ở gốc có 4-6 gai
nhỏ, ngắn hơn, ở mỗi bên. Hoa màu tím, hiếm gặp màu trắng, hơi giống nhau,
đều có 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 1 ô với 2 lá noãn và 2 vòi nhuỵ phình ở gốc.
bế hình bầu dục thuôn, dài 7-8mm, màu đen bóng có vân vàng nhiều
hoặc ít, tùy thuộc vào

giống S.marianum

[15],

[24], [26]. Ra hoa vào tháng 5 đến tháng 8 của năm thứ hai.
Cây có nguồn gốc ở Địa Trung Hải và mọc hoang dại ở nhiều nơi trên
thế giới nhƣ miền Nam và Trung Âu, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung
Quốc, Bắc và Nam Mỹ [26].
1.1.2.
Thành phần ho

ính của

. Sily
.

Dịch chiết của hạt cây chứa khoảng 70-80% silymarin flavonolignans và
khoảng 20-30% thành phần không xác định, chủ yếu là các hợp chất
polyphenol oxy hóa và trùng hợp. Thành phần chính của tổ hợp silymarin là
silybin, đồng nghĩa với silybinin. Ngoài silybin là hỗn hợp của 2
diastereomers A và B với tỉ lệ khoảng 1:1, một lƣợng lớn các flavonolygnants


11

“flavonoid”. Tuy nhiên, một số sắc tố có màu xanh, đỏ, tím hoặc không màu
nhƣng cũng đƣợc sắp xếp vào nhóm flavonoid vì nó cũng có đặc điểm về cấu
trúc giống nhau [2], [10].
 Tính chất lý học
Flavonoid là một hợp chất phenol có một số tính chất sau:
Flavonoid tinh khiết có dạng tinh thể hoặc dạng vô định hình, có nhiệt độ
nóng chảy nhất định, có màu vàng nhƣ flavon, chalcon hoặc không màu nhƣ
isoflavonoid, catechin, hay có màu sắc thay đổi tùy thuộc pH môi trƣờng nhƣ
antoxyanidin (ở môi trƣờng acidcó màu đỏ, ở môi trƣờng kiềm có màu xanh).
Các aglycon (nhân phenol) của flavonoid hòa tan trong dung môi hữu cơ
nhƣ ether, cồn etylic, aceton và hầu nhƣ không tan trong nƣớc.
dạng liên kết (glycosid) hòa tan đƣợc trong nƣớc nhƣng
không tan trong ether và chloroform. Flavonoid có hƣơng thơm và vị đắng.
Có khả năng hấp thụ tia tử ngoại nhờ hai vòng benzen A và B. Có hai dải hấp
thụ cực đại: Dải I ở bƣớc sóng 320-380nm, dải II ở bƣớc sóng 220-280nm.
 Tính chất hóa học
Do đặc điểm cấu tạo của flavonoid có các nhóm hydroxyl phenolic,
nhóm carbonyl, vòng thơm benzen nên chúng có khả năng phản ứng rất lớn.
Tính chất hóa học của flavonoid còn phụ thuộc vào vị trí nhóm OH, hệ nối
đôi liên hợp và các nhóm thế.
phản ứng hóa học đặc trƣng của flavonoid:
*Phản ứng của nhóm hydroxyl (OH)
Tính oxy hóa: Dƣới tác dụng của các chất oxy hóa ( nitrat bạc,
ferricyanit, persulfate, các gốc tự do…) hay enzym polyphenoloxydase
,flavonoid sẽ bị oxy hóa thành các gốc phenoxy ArO* (gốc tự do bền). Các
gốc này có thể dimer hóa hay phản ứng oxy hóa và các phản ứng làm bẻ gãy
vòng.


Flavonoid có nhiều ứng dụng quan trọng trong y học. Những flavonoid
có hoạt tính sinh học gọi là bioflavonoid phụ thuộc vào cấu trúc của chúng.
Khi đƣa flavonoid vào cơ thể sẽ sinh ra các gốc tự do bền vững hơn các gốc


13

tự do hình thành trong quá trình viêm nhiễm bệnh lý. Chúng có khả năng giải
tỏa các điện tử tự do trên mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên
hợp, làm triệt tiêu các nguồn gốc tự do sinh ra trong quá trình viêm nhiễm, do
tính bền vững về mặ

a học nên chúng không tham gia vào dây chuyền

phản ứng oxy hóa [23].
Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ cho adrenalin hoạt động một cách bình
thƣờng do chúng có khả năng tạo phức với Cu2+, có tác dụng là chất xúc tác
cho phản ứng oxy hóa adrenalin, leucholamin [23].
Flavonoid ảnh hƣởng đến hệ thống nội tiết, làm tăng sức đề kháng của
cơ thể đối với tác dụng gây độc bất kể loại nào, tăng chức năng thải độc của
gan, tăng trao đổi glucose, tăng tổng hợp glucogene, ảnh hƣởng đến quá trình
tổng hợp prothrombin của gan [25].
Các chất thuộc nhóm flavonoid có tác dụng làm giảm sức thấm của mạch
mao nhƣ sinh tố P, một trong những chất quan trọng đó là rutin. Rutin có tác
dụng chữa các bệnh xuất huyết mao

n, làm cho thành mạch đƣợc bền

vững, chữa cao huyết áp tăng, cƣờng công hiệu vitamin khỏi bị oxy hóa. Nó
còn ảnh hƣởng tốt đến chuyển hóa canxi và còn chống đƣợc tia phóng xạ.

Dioscorides, một nhà dƣợc thảo học Hy Lạp thế kỷ thứ I đã viết rằng,
pha thành trà uống có thể chữa đƣợc rắn độc cắn. Pliney The Elder (năm
23-79 sau CN) ghi lại rằng, nƣớc ép cây

trộn với mật ong làm thuốc lợi

mật rất tốt. Đây có thể là ghi nhận đầu tiên về tác dụng của cây

liên

quan đến gan [20].
Nhiều thế kỷ sau,

đã trở thành một cây thuốc quen thuộc ở Đức

và đã đƣợc nhắc đến trong một bản thảo tiếng Đức cổ “Physica” của
Hildegarde viết năm 1150 và đƣợc xuất bản vào năm 1533. Tác giả đã viết về
công dụng của rễ, toàn cây và lá

. Một số tác giả khác nhƣ Otto

Brunfels (1534), Hieronimus Bock (1595), Jacobus Theodorus (1664) và
Adam Lonicerus (1679) đã giới thiệu dùng

để trị bệnh về gan [24] .

Vào cuối thế kỷ XVIII, Culpepper (1787) cho rằng

là thứ thuốc


Đức lên tới trên 180 triệu đôla/năm. 31% số bệnh nhân mắc bệnh về gan ở
Mỹ đã dùng dƣợc thảo mà chủ yếu là dùng
1.1.4.2.
Hạt củ

[20] .

của silymarin và ứng dụng
(Sylibum marianum (L.) Gaernt.) đã đƣợc sử dụng

hơn 2000 năm nay để chữa các bệnh rối loạn gan và túi mật nhƣ viêm gan, xơ
gan, vàng da và bảo vệ gan khỏi tác động có hại của hóa chất và các chất độc
ngoài môi trƣờng nhƣ nọc rắn, côn trùng, ngộ độc nấm hoặc rƣợu [43], [52].
 Hiệu

bảo vệ gan:
s
. Đã có những bằng chứng cho thấy silymarin có tác dụng

chữa bệnh xơ gan do rƣợu. Cơ chế của quá trình này do silymarin phục hồi
alanin transaminase, aspartate transaminase và bilirubin huyết thanh về mức
bình thƣờng, giảm γ-glutamyl transpeptidase, làm tăng đáng kể vận tốc biến
đổi của lymphhoccytes và giảm rõ ràng lƣợng tế bào CD8+. Có thể thấy cơ
chế này dựa trên hoạt tính điều biến miễn dịch của silymarin. Silymarin cũng
đƣợc dùng để chữa xơ gan do biến chứng tiểu đƣờng và viêm gan C mãn tính
cùng với các chất khác, gan nhiễm mỡ và đều cho kết

khả quan [18].

Các cơ chế bảo vệ chống bệnh gan


polymerase nội bào.
- Cytokine và chức năng miễn dịch: Hiệu

kháng viêm và kháng xơ

hóa là do silymarin hoạt hóa tế bào hình sao (stellate) của gan và ổn định tế
bào lớn (mast). Silymarin có thể làm giảm lƣợng và hoạt tính cytotoxic
lymphocytes và các tế bào natural killer trong máu, điều đó cho thấy
silymarin có chức năng điều biến miễn dịch.
 Chất bảo vệ và chống ung thư : Silymarin/silybin ức chế tác dụng gây
ung thƣ của nhiều loại hóa chất. Một số khối u phụ thuộc hormone steroid
cũng bị ức chế. Những kết

nhận đƣợc khi thử nghiệm với các dòng tế

bào ung thƣ tuyến tiền liệt, buồng trứng…cho rằng điều chỉnh xuống thụ thể
phát triển màng trong mạch (vascular endothelial growth recptor 4 – VEGR)
và điều chỉnh lên angiopoietin-2 là các cơ chế tiềm năng chịu trách nhiệm cho
hoạt tính của các chất này [28], [45], [58].


17

Chất hỗ trợ trong liệu pháp chống ung thƣ: Một trong những hoạt tính
triển vọng của silybin là chống ung thƣ, vì vậy có thế sử dụng kết hợp với
phƣơng pháp hóa trị liệu. Silybin hoạt động nhƣ chất chống oxy hóa và bảo
vệ mô và loại bỏ chất độc cho gan.
 Bảo vệ thần kinh: Nhờ hoạt tính chống oxy hóa của chất này.
Silymarin ức chế sựu tạo thành các chất trung gian gây viêm nhƣ TFN-α và

là đáp ứng quá mẫn tức thì [40].

 Bảo vệ da: Cả silymarin và silybin đều biểu hiện hi

bảo vệ

chống ung thƣ do ánh sáng gây ra trên mô hình chuột. Cơ chế bảo vệ da đƣợc
chứng minh do khả năng làm giảm và ức chế tác dụng có hại của tia UV mặt
trời nhƣ stress oxy hóa, viêm, đáp ứng miễn dịch và tổn thƣơng DNA cũng
nhƣ cảm ứng chƣơng trình tự chết của tế bào [40].


18

 Tương tác với các thụ thể hormone steroid: Cả silymarin và silybin
đều biể

hoạt tính antiandrogenic trong dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền

liệt, chúng ức chế sựu tăng sinh của tế bào ung thƣ phụ thuộc thụ thể
homonee steroid.
 Điều biến sự vận chuyển thuốc: Một cơ chế nhờn thuốc quan trọng là
do protein màng, ví dụ Pgp trong tế bào động vật. Silymarin ức chế protein
này và làm tăng sự tích tụ của thuốc trong tế bào.
 Điều khiển chương trình tự chết tế bào (apoptosis) và quá trình viêm:
Silybin biết

cảm ứng chƣơng trình tự chết của tế bào màng trong

(endothelial) và ức chế hình thành mạch, là quá trình quan trọng để khối u

Thuốc viên: Nature,
Nature,s Bounty.

, N- Acetyl Cy
.
Viên nang:

: Viên

công ty US Trusted LLC.
, Inc
Bột: Hepatis B Xintai của

ng Châu, Trung Quốc có 5 loại thảo

dƣợc khác nhau: Dành dành (gardenia); rễ hòe (sophora), cành cây
amoorcom, rễ danshen và silymarin.
Thuốc tiêm: Muối meglumine là sản phẩm của phản ứng giữa silibin và
amine hữu cơ. Muối Di-meta-succinate sodium có chức năng bảo vệ gan
mạnh.
Các sản phẩm khác: Hỗn hợp β-cyclodextrin (β-CD) với silymarin; chất
phân bố silymarin rắn là PVP hoặc PEG; liposome; hỗn hợp phospholipid; các
hạt nano.


20

Có nhiều phƣơng pháp để chiết silymarin nhƣ ép lạnh và chiết bằng các
loại dung môi khác nhau [51] hoặc sử dụng n-hexane [52]. Mỗi phƣơng pháp
có những lợi thế và những bất lợi khác nhau.


Protein 35-45%, Lipid 15-20%, Hydratecarbon 15-16%, Cellulose 4-6%,
Vitamin A 710 UI, Vitamin B1 300 UI, Vitamin B2 90 UI, Vitamin C 11 UI,
Muối khoáng 4,6%. Hàm lƣợng axit amin không thay thế trong protein


21

tƣơng

: Tryptophan 1,1%, Leucine 8,4%, Isoleucine 5,8%, Valine 5,8%,

Threo
ác acidbéo không thay thế có giá trị dinh dƣỡng cao,
acidkhông no: linoleic 52-65%, oleic 25-36%, linolenoic 2-3%,

acid

no: Acidpanmitic 6-8%, stearic 3-5%, arachidoic 0,1-1,0% [7], [12], [13].
Carbohydrates trong

thƣờng có : Các polysaccharide không

hòa tan nhƣ hemicellulose, các peptin, cellulose và các oligosaccharide nhƣ
hexose, rafinose, stachiose, verbascose. Tro của

rất giàu sắt và kẽm

[7], [12], [13].
1.2.3. Protein

đến 1000C thì các phân tử của chúng sẽ phân li thành các dƣới đơn vị mà
không kèm theo các hiện tƣợng tập hợp phân tử.
Khi gia nhiệt đến 1000C dung dịch glixinin có nồng độ loãng(
xảy ra sự oxy hóa. Sự ôxy hóa này có thể gây ra
sản phẩm. Nó cũng có thể

sự phá hủy màu sắc và vì thế

gây ra sự oxy hóa những nhóm sunfit tự do từ liên kết disunfua. Cả 2 chức
năng này đều quan trọng trong việc chuẩn bị bột nguyên liệu cho công nghiệp
làm bánh.
1.2.4.

Protein hydrolysate đậu tƣơng

Protein hydrolysate ( PHs:

hỗn hợp của oligopeptides, polypeptides

và axit amin tự do) đƣợc sử dụng để chữa các bệnh về trao đổi chất, các công
thức cho chế độ ăn kiêng và cho trẻ em, ngƣời già và vận động viên [30]. Quá
trình thủy phân protein đậu tƣơng tạo ra các peptides nhỏ
đƣợ

ng minh

ng, các peptides ngắn hấp thụ trong đƣờng ruột với tốc độ cao hơn so

với các axit amin tự do. Điều này cho thấy lợi thế của protein hydrolysate với
cùng một lƣợng axit amin đƣợc sử dụng trong chế độ dinh dƣỡng của bênh
nhân sau mổ hoặc cho ngƣời có tuổ

cũng đƣợc sử dụng


phì của protein và peptides đậu tƣơng đã đƣợc Nakamori (2002) tổng quan
[36]. Một số nghiên cứu chúng minh peptides đậu tƣơng ức chế thu nhận thức
ăn và làm sạch ruột bằng cách tiết ra cholecystokinin kích thích (CCK). Kết
này cho rằng cơ chế hoạt động của peptides đậu tƣơng là điều chỉnh thu
nhận thức ăn bằng cách cảm ứng sự no thông qua việc hoạt hóa các thụ thể
opioid và CCK trong ruột [38].
Hiện có khá nhiều nghiên cứu liên quan đến thủy phân protein đậu tƣơng
để thu các peptides ngắn, chủ yếu s dụng phƣơng pháp nhiệt để thủy phân
bằng enzymes. Các enzymes proteases thƣờng đƣợc sử dụng bao gồm papain,
alcalase, bromelain, pancreatin hoặc trypsin, trong đó papain đƣợc sử dụng
bởi nhiều tác giả [30], [31], [37], [48]. Trong quá trình thủy phân các peptides
có axit amin kỵ nƣớc ở đầu N hoặc C đƣợc tạo ra và chúng làm cho
hydrolysate có vị đắng. Để giảm vị đắng, sử dụng aminopeptidase để tách các