BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
----------------

TRẦN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG U
VÀ ĐIỀU BIẾN MIỄN DỊCH TỪ HAI LOÀI NẤM HẦU THỦ (Hericium erinaceus)
VÀ NẤM HƯƠNG (Lentinula edodes) NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa hợp chất thiên nhiên
Mã số: 62.44.01.17

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội, 2015


Công trình được hoàn thành tại: Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Mai Hương
2. TS. Lưu Văn Chính

Phản biện 1: GS.TSKH Phan Tống Sơn
Phản biện 2: GS.TS Phạm Văn Ty
Phản biện 3: PGS.TS Vũ Đình Hoàng

chất trong nấm có thể là các phân tử nhỏ như triterpenoids (hơn 130 loại) ở nấm linh
chi G. lucidum (Huie và cs., 2004), các hericinone (8 loại) và erinapyron của nấm hầu
thủ H. erinaceus (Arnone và cs., 1994), và đặc biệt là hoạt tính chữa bệnh chính là nhờ
các chất phân tử lượng lớn như polysaccharide và glycoprotein. Phần nhiều,
polysaccharide ở nấm có hoạt tính điều hòa đáp ứng sinh học (biological response
modifiers, BRM) với vai trò ngăn chặn và tiêu diệt tế bào lạ (ung thư, vi sinh vật
v.v…) mà không hây hại tế bào chủ.
Hiện nay chưa có loại thuốc đặc hiệu chữa ung thư. Các phương pháp điều trị ung thư
chủ yếu là áp dụng liệu pháp miễn dịch nhờ sử dụng các chất từ thiên nhiên (đặc biệt
beta-glucan từ nấm) kích hoạt, điều hòa hệ thống miễn dịch (đại thực bào, tế bào đơn
nhân …) của cơ thể tiêu diệt tế bào lạ (ung thư, vi sinh vật).
2. Đối tượng nghiên cứu và nội dung của luận án
Đối tượng nghiên cứu của luận án là nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) và nấm hương
(Lentinula edodes), với những nội dung chủ yếu sau:
Tách chiết một số hợp chất trao đổi thứ cấp, các polysaccharide giàu glucan từ
quả thể nấm.
Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, khả năng ức chế sự hình thành khối u trên
thạch mềm của các chất đã phân lập.
Tạo chế phẩm thử nghiệm trên động vật thực nghiệm.
Đánh giá độ an toàn và hiệu lực của chế phẩm trên động vật thực nghiệm (khả
năng kháng u và điều biến miễn dịch, khả năng bảo vệ, phục hồi chức năng gan của
sản phẩm)
3. Những đóng góp mới của luận án
3.1. Lần đầu tiên nghiên cứu có hệ thống 2 loài nấm (Hericium erinaceus, Lentinula
edodes) ở Việt Nam theo định hướng hoạt tính ức chế tạo u in vitro trong môi trường
thạch.
3.2. Lần đầu tiên đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên dòng ung thư gan (HepG2),
ung thư mô liên kết (RD) và hoạt tính ức chế tạo u in vitro trong môi trường thạch của
các polysaccharit phân lập từ 2 loài nấm (Hericium erinaceus, Lentinula edodes).


2.1.2. Nấm hầu thủ
Chủng nấm hầu thủ (Hericium erinaceus (Bull.:Fr.) Pers) được lưu giữ tại
Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
Nấm hầu thủ khô được cung cấp bởi Viện Di truyền Nông nghiệp.
2.2. Các phương pháp phân lập các hợp chất
Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) hợp chất đường.
Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký cột (CC)
2.3. Phương pháp tinh sạch β-glucan từ nấm hương và nấm hầu thủ
2.3.1. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hương
Theo phương pháp của Chihara và cs, 1970.
2.3.2. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ
Theo phương pháp của Mizuno và cs., 1999


3

2.3. Các phương pháp xác định cấu trúc hoá học
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp xác
định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:
 Phổ khối lượng (MS)
 Điểm nóng chảy (MP)
 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
2.6. Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide
Theo phương pháp của Dubois và cs., 1956.
2.7. Phương pháp thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng
-1,3-glucanase
2.8. Nghiên cứu bao curcumin (Cur) bằng β-1,3/1,6-glucan
2.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

4

2.10.3.4. Phương pháp thử hiệu lực kháng u thực nghiệm
Theo phương pháp của Irina G. Agafonova và cs., 2008 và được thử nghiệm tại Viện
Hàn lâm Khoa học Nga
2.10.4. Xử lý số liệu
Theo phương pháp thống kê dùng trong y-sinh-dược học. Sử dụng phần mềm
Microsoft Excel (Nguyễn Xuân Phách và cs, 1995)
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM
3.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương
Phần này trình bày cụ thể cách thức phân lập các chất từ nấm hương theo định hướng
hoạt tính ức chế sự hình thành khối u trong môi trường thạch.
3.1.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hương
Nấm hương khô
(2 kg)
Chiết siêu âm với EtOH 95%

Dịch
Bã nấm
0

Làm lạnh ở 4-10 C

Kết tinh

Cất loại
dm
Cặn chiết EtOH
(65 g)


NaOH
(5%), 60C

EtOH

Bổ sung EtOAc
P2
(50g)

Lớp etyl axetat

Lớp nước
Chiết BuOH

Cặn etyl axetat
(15g)

Cặn BuOH
(18 g)

Dịch chiết
kiềm
EtOH

P3
(221,6g)

Sơ đồ 3.1. Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm hương

Cặn


- Ly tâm 5000v/phút
- Loại bỏ cặn

Dịch
- Bổ sung EtOH 95% (tỉ lệ 3:1)
- Ủ 4C
- Ly tâm 10000v/phút

Cặn P4
(5,2 g)

Sơ đồ 3.3. Sơ đồ tách chiết polysaccharide từ dịch lên men nấm hương
3.1.3. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan (lentinan) từ nấm hương
P1 (25,2 g)
2L nước, khuấy. Tủa với CTAOH 0.2M
K. tủa
20% acetic acid
K. tủa CTA-OH
50% acetic acid
K. tủa
Hòa tan trong 6% NaOH
Dịch tan
Ethanol, 3 v
K. tủa
Loại protein bằng phương pháp Sevag
Polysaccharide tinh sạch (15,2 g)

NH-GL


(100C)

EtOH

- Bổ sung n-hexan

Lớp nước

Lớp n-hexan

P1
(120g)
Dịch chiết
axit

Cặn n-hexan
(15 g)

Bổ sung EtOAc

Lớp etyl axetat

EtOH

P2
(30g)

Lớp nước

NaOH


Silica gel CC

Silica gel pha
thường
và pha đảo

nHT-A3
HT-A1
HT-A2hexan/axeton
(900mg)
(4,5g)
9/11/1
Làm lạnh, kết Sephadex
tinh lại

HT2 Silica gel CC
HT1
- Lọc rửa nhiều
(52mg)
(500mg)
nlần bằng aceton
lạnh

HT3
(8 mg)

HT4
(20 mg)


(160 g)
Cột
DEAE cellulose (Cl -)

Tinh sạch 1
(40g)
Cột
Sapharose CL6B

Tinh sạch 2, β-1,3/1,6 glucan
(14,54g)

Sơ đồ 3.8. Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ
3.2.4. Thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng -1,3glucanase
Dịch -Glucan
5% beta glucan (5mg/ml) trong đệm citric 25mM
enzyme
5’
D1

15’

120’

60’

D2

D3


H O trao đổi ion (tỉ

EtOH tuyệt đối (tỉ
lệ 1:1)

2

lệ 1:1)

Dịch  glucan

Dịch Curcumin

Khuấy đều trên máy khuấy từ trong
o

điều kiện chân, t phòng, 48 giờ

Hỗn hợp A
Làm bay hơi từ từ dung môi ở nhiệt độ
trong phòng trong thời gian 24 h

DD B
Ly tâm 3 lần dung dịch Cur-Glucan rồi lọc và loại
bỏ phần Cur không được bao lắng xuống

Dung dịch Cur-Glu
Đông khô

Bột Cur-Glu

ăn tiêu thủ, lượng nước uống được theo dõi theo từng nhóm. Kết thúc đợt uống HG1,
động vật thí nghiệm được giết, phẫu tích bóc tách các tạng gan, lách, thận, đánh giá
các tổn thương đại thể bằng kính lúp. Khối lượng mỗi tạng được cân bằng cân phân
tích. Xử lý số liệu theo nghiệm pháp t-Student; so sánh từng cặp và test trước-sau. Sự
khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05.
Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 với các chỉ tiêu huyết học của động vật thí nghiệm
cho uống trường diễn
Các lô chuột nhắt trắng khỏe mạnh, trọng lượng 20 ± 2,0 g được dùng cho thí nghiệm
này. Cho uống HG1 liều 3,0 g/kg thể trọng, liên tục trong 42 ngày. Trước thí nghiệm
và sau khi thí nghiệm, lấy máu xét nghiệm. Số lượng hồng cầu, lượng haemoglobin, số
lượng bạch cầu, tiểu cầu được định lượng trên máy xét nghiệm tự động tại lab cận lâm
sàng - Viện Bỏng Quốc gia - Học viện Quân y. Đánh giá ảnh hưởng của HG1 đối với
các tế bào máu. So sánh giữa các nhóm thử và nhóm chứng. Xử lý theo nghiệm pháp tStudent, trước và sau dùng HG1 trong từng nhóm và giữa các nhóm với nhau.
Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 khi cho uống dài ngày đối với chức năng gan, thận
qua các thông số hóa sinh
Dùng các nhóm chuột, cho uống liên tục HG1, liều 3,0 g/kg thể trọng, nhóm chứng
dùng dung môi. Tại các thời điểm trước và sau thí nghiệm, các nhóm chuột được lấy
máu xét nghiệm. Định lượng các enzym transaminase (AST, ALT, gamma GT), định
lượng creatinin để đánh giá chức năng gan, thận theo phương pháp của Bergmeyer
H.U. (1986) trên máy xét nghiệm tự động tại lab cận lâm sàng - Viện Bỏng Quốc gia Học viện Quân y.
Nghiên cứu tác dụng của HG1 đối với các biến đổi mô bệnh học ở gan, thận, lách
động vật thí nghiệm
Các mẫu gan, thận, lách được lấy trước và sau khi cho động vật uống HG1 bằng cách
giết chuột, phẫu tích các mẫu gan, thận, lách, cố định bằng formol, đúc chuyển qua các
dung dịch để loại nước, rồi đúc trong khối parafin, cắt lát dày 56 µm bằng máy
Microtome Sartorius Werke. Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxylin - Eosin
(HE). Đọc tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100200 lần. Chụp
ảnh qua kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 200400 lần. Đánh giá các tổn
thương theo từng nhóm và so sánh. Xử lý số liệu thu được bằng phương pháp mô tả


nghiệm bằng cách chiếu xạ bằng nguồn chiếu xạ telecobalt 60 (60Co) suất liều 7,0 Gy
và được điều trị bằng chế phẩm HG1 cho uống trước để dự phòng.
Gồm các nhóm:
Đối chứng sinh học (ĐCSH): CNT được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm
(20C, 12/12 giờ sáng/tối, yên tĩnh).
Đối chứng SGMD: CNT được gây SGMD bằng cách chiếu xạ 7,0 Gy, sau đó
không dùng gi, nuôi như ĐCSH.
Nhóm NC: được gây SGMD thực nghiệm, cho uống HG1 với 2 mức liều ngoại
suy căn cứ vào kết quả nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn.
Các chỉ tiêu đánh giá:
Tỷ lệ (%) chuột sống/chết trong vòng 30 ngày kể từ sau khi chiếu xạ.
Khối lượng trung bình của tuyến ức, hạch lympho vùng nách và khối lượng của
lách so với trọng lượng cơ thể (TLCT). Đánh giá sự thay đổi mô học của tuyến ức,
hạch lympho và lách.
Số lượng tế bào tủy, bạch cầu, coloni lách ở chuột nhắt trắng.


11

Số lượng bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu máu ngoại vi.
Tỷ lệ thực bào và chỉ số thực bào.
Phản ứng quá mẫn với kháng nguyên (KN) đặc hiệu: gây mẫn cảm chuột nhắt
bằng kháng nguyên albumin lòng trắng trứng (OVA). 4 ngày sau khi gây mẫn cảm, thử
thách với kháng nguyên OVA bằng cách tiêm kháng nguyên vào dưới da gan bàn chân
chuột nhắt trắng. Đánh giá đáp ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên OVA tại các thời
điểm 24 h, 48 h, 72 h và 96 h sau thời điểm tiêm.
3.4.4. Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm trên động vật của sản phẩm
HG1
−
Động vật thí nghiệm



12

Ung thư EAC được phát triển ở chuột dòng CD1. Chuột đực của dòng CD1 từ 68
tuần tuổi với cân nặng 20g được sử dụng. Trong thí nghiệm này có 40 động vật thử
nghiệm. Mỗi nhóm thí nghiệm gồm 10 động vật thử nghiệm.
Tế bào ung thư Ehrlich được tiêm vào khoang cơ thể của chuột với nồng độ 2x106 tế
bào/mL. Cho chuột dùng chế phẩm HGC1 bắt đầu 1 ngày sau khi cấy khối u. Hỗn hợp
pha trong 1% DMSO và dầu olive với các liều 100, 10 và 1 g/kg được thêm vào mỗi
chuột 1 ngày 1 lần, trong 5 ngày (5 liều). Nhóm đối chứng chỉ có 1% DMSO và dầu
olive.
Đánh giá hoạt tính chống u trên tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC)
bằng MRI
Chuột BALB/c đực 68 tuần (trọng lượng khoảng 26 g) tuổi được sử dụng. Tế bào
Ehrlich được cấy vào chuột ở dưới xương đòn vai phải với nồng độ 5x106 tế bào/mL.
Cho chuột dùng mẫu thử nghiệm 1 ngày sau khi cấy khối u.
Sử dụng kỹ thuật MRI để ước tính khả năng kiềm hãm khối u Ehrlich sau mỗi 2 ngày
kể từ ngày thứ 7 sau khi cấy với tế bào ung thư (ở nhóm đối chứng và nhóm thử
nghiệm). Chuột được gây mê với xylazine (13 mg/kg trọng lượng cơ thể).
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương
Phần này trình bày về cách phân lập và xác định cấu trúc theo đinh hướng hoạt tính ức
chế sự hình thành khối u trong môi trường thạch của các hợp chất từ nấm hương.
4.1.1. Tách các phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học
Quả thể nấm hương khô được chiết và tách phân đoạn như miêu tả ở sơ đồ 3.1 (mục
3.1.1). Từ dịch chiết cồn đã tách được: 01 chất kết tinh NH1 và 3 phần chiết gồm: cặn
n-hexan, cặn ethyl axetat, cặn butanol. Từ bã nấm 03 phân đoạn polysaccharide (P1NH, P2-NH, P3-NH) được tách chiết (xem sơ đồ 3.1 ở mục 3.1.1). Ngoài ra, từ dịch
lên men nấm hương phân đoạn polysaccharide P4-NH được tách (xem mục 3.1.2).
Hàm lượng polysaccharide các phân đoạn tách từ nấm hương cũng được trình bày ở


13

độ hình thành khối u giảm tương ứng là 58,56 và 54,09%, kích thước trung bình của
khối u giảm tương ứng là 52,01 và 35,36% so với đối chứng.
Chúng tôi lựa chọn ra 2 phân đoạn n-Hexan và P1-NH từ nấm hương để phân tách tiếp
theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính chống ung thư.
Phân đoạn n-Hexan được tách thành 3 phân đoạn nhỏ NH-A1, NH-A2, NH-A3. Kết
quả đánh giá hoạt tính chống ung thư thông qua thử nghiệm gây độc tế bào và ức chế
tạo u trên thạch của các phân đoạn. Kết quả cho thấy phân đoạn NH-A1 biểu hiện hoạt
tính gây độc tế bào và ức chế sự hình thành khối u trên thạch. Phân đoạn NH-A1 được
lựa chọn để nghiên cứu thành phần hóa học.
Từ phân đoạn NH-A1 sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan/axeton theo tỉ lệ 3/1-1/1, thu
được 2 hợp chất ký hiệu là NH-2 (150 mg) và NH-3 (50 mg) (sơ đồ 3.2).
Từ phân đoạn polysaccharide P1-NH tinh sạch được β-1,3/1,6 glucan (GL-NH) (xem
mục 3.1.4)
1.1.2. Xác định cấu trúc các hợp chất NH1, NH2 và NH3
Hợp chất NH1: galactiol
Chất kết tinh màu trắng, điểm chảy 167-169C.
1
H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, ppm) δ 4,40 (d, J = 5,5 Hz, 1H-OH), 4,35 (t, J = 6
Hz, 1H –OH), 4,13 (d, J = 7 Hz), 1H-OH), 3,60 (m, 1H, H1a), 3,53 ( t, J = 7,5 Hz,1H, H3),
3,45 (m, 1H, H1b), 3,38 (m, 1H, H2).
13
C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ppm) δ 71,5 (C2), 69,8 (C3), 63,9 (C1)
Hợp chất NH2: Ergosterol
Tinh thể hình kim màu trắng, Tnc: 168oC, ESI-MS: m/z 397,3 [M + H]+ (C28H44O, M = 396).
1
H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, ppm) δ: 5,75 (dd, J1=2Hz, J2=5,5Hz, 1H,H6), 5,38
(m,1H,H7), 5,23 (dd, J1=7Hz, J2=15Hz, 1H, H23), 5,17 (dd, J1=7Hz, J2=15Hz, H22), 3,64 (m,

(C-11), 39,91 (C-12), 44,58 (C-13), 51,70 (C-14), 23,42 (C-15), 28,65 (C-16), 56,23 (C-17),
12,88 (C-18), 18,18 (C-19), 39,73 (C-20), 20,89 (C-21), 135,44 (C-22), 132,33 (C-23), 42,79
(C-24), 33,08 (C-25), 19,65 (C-26), 19,96 (C-27) và 17,57 (C-28).
Hợp chất NH-GL: β-1,3/1,6 glucan
Kết quả phổ cho thấy, có 9 tín hiệu nguyên tử C chính. Tín hiệu tại C = 103 chỉ ra
nguyên tử C1; tín hiệu C = 86,1 chỉ ra nguyên tử C3; tín hiệu C = 76,7 chỉ ra C5; tín hiệu C
= 76,3 chỉ ra C3’; tín hiệu C = 73,7 chỉ ra C2; tín hiệu C = tín hiệu 70,3 chỉ ra C6s (thay
thế); tín hiệu C = 68,4 chỉ ra C4 và tín hiệu C = 61,2 chỉ ra C6.

Hợp chất NH1: galactiol
HO

CH2

Hợp chất NH-2: Ergosterol
28

OH
21

22

24

26

20

CH



1

HO

23

10

H2C

OH

8

3

HO

Hợp chất NH3: Ergosterol peroxide

5

Chất NH-GL: β- 1,3/1,6 glucan

28
21

22



HO

O

1.1.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hương
Các hợp chất phân lập được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch
mềm. Kết quả thu được ở bảng 4.2, 4.3.
Bảng 4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm hương
Nồng độ
Dòng tế bào
ST Ký hiệu
mẫu
Phần trăm sống sót (%)
T
mẫu
(g/ml)
Hep-G2
Fl
RD
Lu
DMSO

100  0,0

100  0,0

100  0,0

100  0,0

NH3

10

26,50,7

32,91,1

42,20,4

48,90,6

4

NH-GL

20

91,30,7

93,21,1

86,50,9

90,41,4


15

STT

Bảng 4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2
trên thạch mềm của các hợp chất
Kích thước trung bình của
Nồng độ
Độ giảm mật
khối u
mẫu thử
Kí hiệu mẫu
độ khối u
Đường kính % giảm so với
(% )
(g/mL)
(µm)
đối chứng
Chứng âm (DMSO 1%)
0
0
29,631,71
10
5,14
NH1
27,751,35
3,330,58
10
3,91
NH2
28,111,57
48,330,50
10
55,18


Chiết nước
nóng (P1)
6 (2,5)

100 g quả thể
Chiết axit (P2)
1,5 (1,2)

Chiết kiềm
(NaOH 1M) (P3)
16,0 (12,1)

Lượng polysaccharide thô trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể)
Số trong ngoặc: là hàm lượng polysaccharide trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể)


16

Tất cả các phân đoạn đó được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch.
Kết quả cho thấy cho thấy cặn n-hexan và polysaccharide P3-HT biểu hiện khả năng
ức chế sự hình thành khối u với mật độ hình thành khối u giảm tương ứng là 47,93 và
30,35% và kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 44,49 và 33,63% so
với đối chứng.
Cặn chiết n-hexan được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột lặp lại trên silica gel pha
thường và sephadex với các hệ dung môi thích hợp (sơ đồ 3.5) thu được 2 hợp chất
HT1 và HT2.
Từ phân đoạn P3-HT tiến hành tinh chế theo sơ đồ 3.6 thu nhận được β-1,3/1,6 glucan
tinh sạch (GL-HT) (xem mục 3.2.4).
4.2.2. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ

4,16 (1H, H-3), 5,50 (1H, dd, J = 7,0, 15,5 Hz, H-4), 5,76 (1H, dt, J = 15,5, 6,0 Hz, H-5),
2,07 (2H, H-6), 2,10 (2H, H-7), 5,17 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-8), 2,00 (1H, H-10), 1,43 (1H, H11), 1,31 (2H, H-16), 1,33 (2H, H-17), 0,92 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-18) 1,62 (3H, s, H-19), 4,01
(1H, H-2’), 1,57 (1H, Ha-3’), 1,74 (1H, Hb-3’), 1,44 (2H, H-4’), 1,31 (2H, H-14’), 1,33 (2H,


17

H-15’), 0,92 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-16’), 4,29 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1”), 3,22 (1H, H-2”), 3,37
(1H, H-3”), 3,31 (1H, H-4”), 3,30 (1H, H-5”), 3,69 (1H, Ha-6”) và 3,89 (1H, dd, J = 2,0,
11,5 Hz, Hb-6”).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD, ppm) 70,13 (C-1), 55,01 (C-2), 73,29 (C-3), 131,51 (C4), 135,04 (C-5), 34,02 (C-6), 29,09 (C-7), 125,22 (C-8), 137,18 (C-9), 41,18 (C-10), 29,52
(C-11), 30,79-31,24 (C-12 đến 15), 33,49 (C-16), 24,15 (C-17), 14,86 (C-18), 16,53 (C-19),
177,60 (C-1’), 73,49 (C-2’), 36,28 (C-3’), 26,57 (C-4’), 30,79 (C-5’), 31,24 (C-13’), 33,49
(C-14’), 24, 15 (C-15’), 14,86 (C-16’), 105,13 (C-1”), 75,39 (C-2”), 78,31 (C-3”), 71,97 (C4”), 78,38 (C-5”) và 63,08 (C-6”).
Hợp chất HT4 - Hericenone D
Chất kết tinh màu trắng, điểm chảy 41-43oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 599,2 [M +
H]+, m/z 597,4 [M - H]- (C37H58O6, M = 598).
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm) H: 6,53 (1H, s, H-6), 5,32 (2H, s, H-7), 10,11 (1H,
s, H-8), 3,91 (3H, s, H-9), 3,40 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-1’), 5,32 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2’), 3,00
(2H, s, H-4’), 6,09 (1H, t, J = 1,0, 1,5 Hz, H-6’), 1,84 (3H, d, J = 1,5 Hz, H-8’), 2,12 (3H, d,
J = 1,0 Hz, H-9’), 1,78 (3H, d, J = 0,5 Hz, H-10’), 2,33 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-2”), 1,62 (2H,
m, H-3”), 1,25 (26H, m, H-4”-17”), 0,88 (3H, m, H-18”) và12,37 (1H, s, OH).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm) C: 138,70 (C-1), 112,91 (C-2), 162,94 (C-3),
117,33 (C-4), 163,49 (C-5), 105,55 (C-6), 62,90 (C-7), 193,10 (C-8), 55,93 (C-9), 21,62 (C1’), 126,27 (C-2’), 130,35 (C-3’), 55,55 (C-4’), 199,54 (C-5’), 122,85 (C-6’), 155,42 (C-7’),
27,66 (C-8’), 20,67 (C-9’), 16,41 (C-10’), 173,20 (C-1”), 34,25 (C-2”), 24,89 (C-3”), 29,13
(C-4’’), 31,94 (C-17”) và 14,12(C-18”).
Hợp chất HT5 - Ergosterol

Hợp chất GL-HT: β- 1,3/1,6 glucan
Qua hình phổ 13C-NMR cho thấy có 10 tín hiệu nguyên tử C chính: tín hiệu C = 103,4
và 103,1 biểu thị C1 chuỗi thẳng và C1’ của glucose nhánh, tín hiệu C = 86,3 biểu thị C3
(chuỗi thẳng) của chuỗi thẳng. Hai giá trị trên chứng tỏ có liên kết β-glucosidic trong
polymer, tín hiệu C = 61,1 biểu thị C6, tín hiệu C =68,57 biểu thị C4, tín hiệu C = 73,0 biểu
thị C2, C =76,9 biểu thị cho C5 của glucose trong chuỗi thẳng và C =70,2 biểu thị C6s
(substituted, thay thế).
13

Hợp chất HT1: axit stearic

Hợp chất HT2: Ergosterol peroxide
28
21
26
22

Hợp chất HT3 - Cerebroside B
OH

6" OH
4"

5

3

O

5"

3

16'

22

9'

24

11

OH

5'

8

1'

3'

2

4
23

25

17

Hợp chất HT4 - Hericenone D

28
21

O

4

HO

Hợp chất HT5 - Ergosterol

5

15

8

10

15'
14'

OH

1

9



7

12

24

20

19

2"

O

5

O

1"

7

(CH2)14
3"

18"

9



N
1

8

2
3

N

HO
5'

O
H

4'

H

3'

OH

H
2'

1'



100  0,0

2,1 0,07

1,7 0,4

0,3  0,02

5,20,4


19

1
2

HT1
HT2

10
10

98,60,9
19,90,3

99,21,6
17,40,5

96,81,1


92,31,5

5

HT5

10

85,81,4

92,61,2

79,91,8

85,30,9

6

HT6

10

90,30,6

82,91,3

90,50,8

98,21,4


Fl
0,27
5,13

RD
0,16
8,79

Lu
0,31
9,11

Kết quả cho thấy, hợp chất HT2 biểu hiện hoạt tính độc tế bào cả 4 dòng tế bào thử
(ung thư gan-Hep G2, ung thư tử cung, ung thư mô liên kết-RD, ung thư phổi-Lu) với
giá trị IC50 lần lượt là 4,82; 5,13; 8,79 và 9,11g/ml.
Bảng 4.6. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2
trên thạch mềm của các hợp chất
Kích thước trung bình của
Nồng độ
Độ giảm mật
khối u
mẫu thử
Kí hiệu mẫu
độ khối u
Đường kính % giảm so với
(% )
(g/mL)
(µm)
đối chứng

10
24,660,58
19,15
16,90,98
GL-HT
20
17,221,15
45,280,64
43,45
Kết quả bảng 4.6 cho thấy mẫu HT2 ức chế rõ rệt sự hình thành khối u với mật độ hình
thành khối u giảm là 55,78 so với đối chứng và kích thước trung bình của khối u giảm
tương ứng là 52,31% so với đối chứng.


20

4.3. Nghiên cứu biến đổi β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ thành hoạt chất dễ tan hơn
và đánh giá hoạt tính của chúng
4.3.1. Thủy phân bằng enzyme -1,3-glucanase
Enzyme β-1,3 glucanase chuẩn dùng cắt ngắn mạch của - glucan từ nấm hầu thủ thu
được 3 phân đoạn (HT-GL1, HT-GL2, HT-GL3 ). (xem mục 3.2.5 phần thực nghiệm)
3 phân đoạn trên được kiểm tra qua cột Sephadex G-100, thấy có 3 đỉnh
polysaccharide riêng rẽ. Điều đó chứng tỏ chúng khác biệt về độ dài mạch polymer.
Các β-1,3/1,6-glucan với trọng lượng phân tử khác nhau gồm HT-GL1, HT-GL2 và
HT-GL3 được dùng đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và khả năng ức chế sự hình
thành khối u trên thạch mềm. Kết quả được trình bày tại bảng 4.7 và 4.8.
Bảng 4.7. Hoạt tính gây độc tế bào của các β-1,3/1,6-glucan với trọng lượng phân tử
khác nhau.
STT


HT-GL3

Hep-G2
0,31
13,56
15,73
>20

Dòng tế bào
Phần trăm sống sót (%)
Hep-G2
Lu
RD
100  0,0
100  0,0
100  0,0
0,5  0,04
0,9  0,0
0,2  0,1
75,71,1
39,30,4
35,20,7
62,30,07
44,71,1
38,90,3
52,80,2
69,30,1
50,70,9
Dòng tế bào
Giá trị IC50 (g/ml)

12,270,92
59,70
59,721,58
HT-GL2
20
13,451,21
55,83
56,121,67
HT-GL3
20
15,170,56
50,18
49,420,62


21

Kết quả bảng 4.8 cho thấy cả 3 mẫu đều biểu hiện hoạt tính ức chế sự hình thành khối
u trên thạch mềm. Tuy nhiên, 2 mẫu GL1 và GL2 ức chế rõ rệt sự hình thành khối u
với mật độ hình thành khối u giảm tương ứng là 59,72 và 56,12% so với đối chứng và
kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 59,70 và 55,83 % so với đối
chứng. Đáng chú ý hơn cả là 2 sản phẩm này có độ tan và hoạt tính tốt hơn so với sản
phẩm ban đầu.
4.3.2. Dùng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin
Nghiên cứu chế tạo hệ Cur-Glu nhằm làm tăng độ tan của glucan và curcumin trong
nước. Sản phẩm curcumin β-1,3/1,6-glucan khi hòa tan trong nước thể hiện tính tan tốt
và tạo thành dung dịch có màu vàng trong suốt, kích thước hạt 50 nm.
Hiệu suất của phản ứng mang Cur bởi Glu là 100-20/100 = 80%
Phần dung dịch Cur-Glu thu được được đem đi đông khô sẽ thu được Cur Glu dạng
bột có kích thước 50 nm.

với đối chứng (%)
Cur
8mg/ml
99,3 ± 0,5
80,0 ± 1,3
20-30
Glu
8mg/ml
93,3 ± 0,9
75,5 ± 1,1
23-30
Cur-Glu 8mg/ml
90,7 ± 0,7
30,2 ± 1,5
40-50


22

Hình ảnh sự hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm cho thấy hiệu quả ức chế rõ rệt
của hỗn hợp Cur-glu với tỷ lệ 4:1 lên sự hình thành khối u của dòng tế bào này trên
thạch mềm và đáng chú ý hơn là nó đã gắn đựợc vào tế bào làm cho tế bào phát quang
Mặc dù các sản phẩm curcumin, β-glucan và Cur-Glu đều không biểu hiện hoạt tính
gây độc tế bào trên dòng Hep-G2, nhưng hiệu quả ức chế rõ rệt của Cur-Glu với tỷ lệ
4:1 lên sự hình thành khối u của dòng tế bào này trên thạch mềm.
4.4. Thử nghiệm tác dụng dược lý chế phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm
Từ β-glucan của nấm hầu thủ chúng tôi đã tạo ra được sản phẩm HG1 (xem mục 3.3 ở
phần thực nghiệm). Các sản phẩm được thử nghiệm trên động vật. Kết quả cho thấy:

Độc tính cấp diễn: Với mức thể tích lớn nhất có thể đưa vào dạ dày chuột nhắt

quét, quan sát và đo lại bằng kỹ thuật MRI và chọn ROI của chương trình PharmaScan
Thêm vào đó, kích cỡ của các cơ quan liên quan đến hệ miễn dịch (tuyến ức, lá lách,
gan) được chụp quét và tính toán. Kích cỡ của tất cả cơ quan của chuột đều giữ
nguyên.


23

KẾT LUẬN
1. Hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương
- Từ nấm hương (L.edodes), 3 hợp chất phân tử lượng nhỏ được phân lập, gồm:
galactiol (NH1), ergosterol (NH2), ergosterol peroxide (NH3); và 01
polysaccharide là β-1,3/1,6-glucan (GL-NH).
- Hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch của các hợp chất phân lập đã
được đánh giá. Kết quả cho thấy: chất NH3 có hoạt tính gây độc tế bào trên cả 4
dòng tế bào thử (Hep-G2, Fl, RD, Lu) với giá trị IC50 lần lượt là 3,84; 4,17;
7,61; và 9,21 µg mL1; Hợp chất NH3 và GL-NH ức chế sự hình thành khối u
trên thạch của tế bào ung thư gan Hep-G2 với mật độ hình thành khối u giảm lần
lượt là 58,33; 39,25% và kích thước trung bình của khối u giảm lần lượt là
55,18; 20,09% so với đối chứng. (Đây cũng là kết quả đầu tiên đánh giá những
hoạt tính những dòng tế bào này của polysaccharide từ nấm hương).
2. Hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ
- Từ nấm hầu thủ (H. erinaceus), 6 hợp chất đã được phân lập, gồm: stearic acid
(HT1), ergosterol peroxide (HT2), cerebroside B (HT3), hericenone D
(HT4), ergosterol (HT5), β-adenosine (HT6) và 01 polysaccharide là β1,3/1,6-glucan (GL-HT).
- Hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch của các hợp được đánh giá. Kết
quả cho thấy: hợp chất HT2 có hoạt tính gây độc tế bào trên cả 4 dòng tế bào
thử (tế bào ung thư gan –Hep- G2, ung thư tử cung -Fl, ung thư mô liên kết -RD
và ung thư phổi -Lu) với giá trị IC50 lần lượt là 4,82; 5,13; 8,79; 9,11µg mL1;
Hợp chất HT2 và GH-HT ức chế sự hình thành khối u trên thạch của dòng tế