VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHẠM VĂN PHÖC

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC APTAMER ĐẶC
HIỆU KHÁNG SINH TETRACYCLINE VÀ
ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG
Ngành: Sinh học
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 01. 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. LÊ QUANG HUẤN

Hà Nội – 2014
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


LỜI MỞ ĐẦU
Kháng sinh là loại thuốc quan trọng được coi là chiến lược cuối cùng để điều trị
nhiễm trùng của con người. Tuy nhiên, hiệu quả điều trị của chúng bị đe dọa do
việc sử dụng các kháng sinh rộng rãi và không phù hợp không chỉ trong y học mà
còn trong nông nghiệp. Sự hiện diện của dư lượng kháng sinh trong thực phẩm ở
trên mức cho phép là bất hợp pháp. Vì vậy, kiểm soát dư lượng trong sữa, trong


nhưng khả năng ứng dụng của các cảm biến sinh học hiện nay trên thực tế còn
nhiều hạn chế do thời gian chuẩn bị mẫu, các thao tác lâu, phức tạp. Hơn nữa, vấn
đề thu nhận và tinh sạch các kháng thể, một trong các nguyên liệu then chốt để tạo
cảm biến sinh học, là rất phức tạp, tốn kém và độ bền của kháng thể rất hạn chế.
Vì vậy, việc sử dụng các phân tử thay thế kháng thể đơn dòng trong chế tạo cảm
biến sinh học nhưng vẫn bảo đảm độ nhạy và độ đặc hiệu cao là rất cần thiết, và các
aptamer được xem là phân tử thay thế kháng thể đơn dòng phù hợp nhất trong chế
tạo các biosensor.
Aptamer là các sợi đơn DNA, các phân tử RNA hoặc các đoạn peptide có cấu
trúc đặc biệt và có khả năng gắn kết với các phân tử đích khác nhau, chẳng hạn như
các phân tử hữu cơ nhỏ, các protein và các tế bào ung thư. Với các đặc tính độc đáo,
aptamer trở thành một trong những nhóm chất có nhiều tiềm năng ứng dụng trong
điều trị ung thư. So với kháng thể đơn dòng thì aptamer có nhiều ưu điểm hơn: (1)
aptamer có kích thước phân tử nhỏ hơn kháng thể và không sinh đáp ứng miễn dịch
khi sử dụng in vivo, (2) aptamer có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với các
phân tử đích tương đương hoặc hơn các phân tử kháng thể, (3) việc chế tạo các
aptamer đơn giản, nhanh, hiệu quả vượt trội so việc tạo các kháng thể đơn dòng
hoặc các kháng thể tái tổ hợp, (4) aptamer có độ bền với các tác nhân hóa, lý, môi
trường cao hơn kháng thể. Vì vậy, aptamer là một trong những hướng nghiên cứu
mới của công nghệ gen nhằm sử dụng các chẩn đoán và điều trị miễn dịch.
Từ những lí do trên, tôi xin đề xuất đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu sàng lọc
aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hƣớng ứng dụng”
Mục tiêu của đề tài:


Xây dựng được quy trình sàng lọc được aptamer đặc hiệu kháng sinh

Tetracycline


Mycoplasma, Rickettsiae như sốt kiểu thương hàn, sốt hồi quy và đặc biệt là nhiễm
phẩy khuẩn tả Vibrio cholerae gây ra bệnh dịch tả điển hình trong mùa hè.
1.1.2. Phân loại

Hình 1.1. Công thức hóa học chung của nhóm Tetracycline
( Nguồn: Từ Ming Koóng, 2004)

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


Kháng sinh nhóm Tetracycline bao gồm 3 loại chính là: Oxytetracycline,
Tetracycline và Chlortetracycline. Các loại Tetracycline có cấu trúc cơ bản giống
nhau, chúng chỉ khác nhau ở gốc R.
1.1.3. Cơ chế tác động
Tetracycline được vận chuyển theo phương thức tích cực qua màng bào tương
của các vi khuẩn mẫn cảm với thuốc. Các yếu tố vận chuyển tích cực này chỉ có ở
vi khuẩn mà không có ở tế bào vật chủ. Sau khi thuốc vượt qua màng bào tương sẽ
gắn vào tiểu phần 30s của Ribosom và đồng thời cũng gắn vào cả ARN thông tin, từ
đó ngăn cản sự gắn kết các axit amin vào chuỗi peptid. Qua đó, chúng ức chế quá
trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Nếu không có các protein này thì vi khuẩn
không thể phát triển, nhân rộng và tăng số lượng. Do đó, Tetracycline làm dừng lại
quá trình lây lan và những vi khuẩn còn lại sẽ bị giết bởi hệ thống miễn dịch hoặc tự
chết dần dần.

Hình 1.2. Cơ chế tác động của Tetracycline (Nguồn: Gary E. Kaiser)
Đề kháng Tetracycline là do sự thay đổi khả năng thẩm thấu của vách tế bào vi
khuẩn. Ở những vi khuẩn nhạy cảm, thuốc được tập trung vào bên trong và khó

lại uống 250 mg, nồng độ thuốc trong máu đạt 1 – 3 μg/ml. Còn uống liều 500 mg,
nồng độ thuốc trong máu đạt 3 – 5 μg/ml. Liều 1 g nồng độ cao hơn 5 μg/ml. Nồng
độ này duy trì trong suốt thời gian điều trị.
Khi tiềm liều 250 – 500 mg, nồng độ thuốc trong máu đạt từ 5 – 10 μg/ml [6].
Phân bố
Hàm lượng thuốc trong các tổ chức có liên quan rất lớn đến liều lượng sử dụng
với hàm lượng nước của các mô tổ chức trong cơ thể. Chúng phụ thuộc vào sự liên
kết và biến đổi của protein huyết tương. Ví dụ như Chlortetracycline 50 – 70%,
Oxytetracycline 20 – 25%.
Tất cả các dạng thuốc nhóm Tetracycline sau khi hấp thu được chuyển tới gan
theo mật đổ xuống ruột non. Hàm lượng thuốc trong gan, mật bao giờ cũng cao hơn
trong máu ít nhất từ 5 – 10 lần. Thuốc có chu kỳ: máu – gan – mật – ruột – máu nên
được tồn tại lâu trong máu, vì vậy thời gian tác dụng của thuốc dài.
Thải trừ
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


Tetracycline phần lớn thải trừ qua nước tiểu. Sự lọc thải của thuốc phụ thuộc vào
công năng của thận. Nếu tiêm khoảng 20 – 60%, lượng thuốc được thải qua thận
sau 24h đầu. Có khoảng 20 – 55% liều uống cũng được thải qua nước tiểu. Trong
đó có khoảng 10 – 35% lượng Oxytetracycline thuốc thải qua nước tiểu dưới dạng
còn hoạt tính sau khi dùng thuốc 1/2h đến 5h. Còn Chlortetracycline nếu uống, chỉ
có khoảng 10 – 15% lượng thuốc được tìm thấy trong nước tiểu. Sự thải của
Chlortetracycline qua thận chỉ khoảng 35%, thấp hơn Oxytetracycline. Nếu tiêm
tĩnh mạch, 60% lượng thuốc được thải qua nước tiểu trong 12h đầu.
Nếu đưa thuốc qua đường uống, phần Tetracycline không được hấp thu sẽ thải
trừ qua đường tiêu hóa (theo phân) dưới dạng còn hoạt lực. Có khoảng 500 – 600

Ngoài ra, nhóm kháng sinh Tetracycline có xu hướng tác dụng trên răng và
xương trẻ em. Do đặc tính đặc thù là kết hợp và tạo phức hợp bền (chelat) với canxi,
thành phần nhiều trong xương và răng nên Tetracycline dễ dàng tạo phức hợp bền
với yếu tố này tại hai cơ quan đang cốt hóa. Sự lắng đọng lâu và kéo dài
Tetracycline sẽ gây ra hiện tượng hỏng men răng, xỉn răng, hủy hoại sự phát triển
xương. Nếu phụ nữ mang thai vào giai đoạn cuối của thai kỳ sử dụng sữa có chứa
dư lương Tetracycline thì sẽ ngăn chặn sự phát triển xương của trẻ em. Do vậy,
kháng sinh Tetracycline tuyệt đối không được sử dụng ở bà mẹ mang thai thời kỳ
cuối (ba tháng cuối) và không dùng cho trẻ em đến khi nào đứa trẻ được 12 tuổi.
Do thuốc gây ức chế tổng hợp protein nên nó sẽ gây ra ứ đọng các axit amin, các
đơn vị tiền thân của protein. Sự dư thừa các axit amin gây tăng phân giải tạo ra các
sản phẩm ure và nitơ. Do đó mà thuốc làm tăng nồng độ ure huyết. Bởi vậy, nếu
người già và người bị các bệnh lý về thận mà vô tình bị tích lũy dư lượng
Tetracycline thì hậu quả rất nguy hiểm. Chúng sẽ làm cho sự gia tăng ure huyết là
đỉnh điểm và gây ra tai biến, có thể dẫn đến hôn mê.
Nếu xét về độc tính trên gan thì Tetracycline là một thuốc kháng sinh gây viêm
gan điển hình trong họ hàng nhà kháng sinh. Thuốc gây ra viêm gan và viêm tụy
mức độ nặng nếu chúng ta dùng liều cao và kéo dài. Do đó, trên những đối tượng
sẵn có các bệnh lý về gan và tụy như viêm gan virut, viêm tụy, viêm gan tắc mật,
viêm gan vàng da thì việc sử dụng các sản phẩm sữa chứa dư lượng kháng sinh là
một yếu tố làm tăng tình trạng bệnh..
Bên cạnh đó, việc tích lũy hàm lượng Tetracycline trong một thời gian dài còn
dẫn đến nguy cơ phá vỡ hệ cân bằng các vi sinh vật đường ruột, tạo ra các chủng
kháng thuốc kháng sinh.
1.1.8. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi
Tình hình sử dụng kháng sinh trên thế giới
Nhu cầu về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi động vật nói chung và nuôi bò
sữa nói riêng là rất lớn. Kháng sinh được sử dụng làm chất kích thích sinh trưởng
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

12%;

Aminoglycoside:

4%;

Fluoroquinolone:

1%;

Trimethomprim/sulpha: 2% và các kháng sinh khác: 6% [6]
Tình hình sử dụng kháng sinh tại Việt Nam
Từ khi được đưa vào Việt Nam đến nay, kháng sinh ngày càng được sử dụng
rộng rãi và liên tục, trong đó có một phần không nhỏ cho lĩnh vực chăn nuôi. Nhằm
tăng khả năng chống chịu những thay đổi của môi trường và mầm bệnh nên trong
quá trình chăn nuôi, người ta thường sử dụng kháng sinh trộn vào thức ăn, nước
9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


uống hoặc tiêm với mục đích kích thích tăng trường, phòng bệnh và trị bệnh. Việc
trộn kháng sinh vào thức ăn của vật nuôi với hàm lượng rất cao, không tuân thủ
đúng thời gian quy định về ngưng thuốc trước khi xuất chuồng là nguyên nhân
chính gây tồn dư kháng sinh trong thực phẩm vượt mức cho phép (Quyết định số
46/2007/QĐ-BYT). Hậu quả có thể ảnh hưởng tới sức khỏe con người như nguy cơ
dị ứng kháng sinh, độc tính mãn tính và gia tăng hiện tượng đề kháng kháng sinh.
Thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi cao: 100% có
Oxytetracycline, 67% có Chloramphenicol, 30% có Olaquindox, 77% có

12%. Có 5,5% số mẫu trong 290 mẫu thịt lợn trên thị trường Hà Nội có tồn dư kháng
sinh Tetracycline. Tại các khu vực chăn nuôi ở miền nam cũng nhận thấy có 4 cơ sở
chiếm 22,2% các mẫu thịt gà có tồn dư các loại kháng sinh Tetracycline, amoxyline,
erofloxacine với hàm lượng cao gấp từ 1,4 – 30,9 lần so với ngưỡng cho phép [3].
1.1.9. Sự tồn dƣ kháng sinh
Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh
Một là, có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng
sinh và có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn
nuôi:
-

Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc

-

Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh

-

Kháng sinh cho vào nước uống để chữa bệnh gia súc

-

Kháng sinh cho thêm vào thức ăn gia súc để bảo quản súc sản lâu hư

-

Kháng sinh tiêm vào súc vật hoặc cho súc vật uống trước khi giết thịt với

mục đích kéo dài thời gian, tránh hư hỏng thịt tươi.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


-

Gây khó khăn cho công tác điều trị nhiễm khuẩn

-

Gây tốn kém kinh tế

-

Làm giảm sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể

-

Ảnh hưởng tới quá trình chế biến thực phẩm

-

Một số kháng sinh, hóa dược có thể gây ung thư cho người tiêu thụ

Berends B và cộng sự (2001) khi đánh giá mối nguy hiểm của việc quản lý kháng
sinh trên động vật giết mổ đối với sức khỏe của người tiêu dùng tại Hà Lan cho
thấy: nguy cơ gây hại của dư lượng Tetracycline trong thịt lợn giết mổ gây nên phản
ứng dị ứng trên người tiêu dùng là 1/33.000.000 và các rối loạn của vi khuẩn đường

của một số tác giả cho thấy: ở bệnh viện Bạch Mai, tỷ lệ E.coli kháng kháng sinh
tăng từ 18% năm 2005 lên 42% năm 2008: cho thấy mức độ kháng kháng sinh
Tetracycline 88,6%, ciprofloxacine 82,3% [5]
Ngoài ra, sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi còn là mối đe dọa cho môi
trường. Kháng sinh vào cơ thể vật nuôi thông qua thức ăn hoặc bằng các con đường
khác đều được thải ra môi trường. Ảnh hưởng của việc thải kháng sinh đến môi
trường thể hiện ở các khía cạnh sau:
Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật đất
Quần thể vi sinh vật đất có ý nghĩa rất quan trọng trong các chu trình chuyển hoá
vật chất trong đất và cải thiện độ phì nhiêu của đất. Kháng sinh dù bằng con đường
nào được thải ra môi trường đều phá vỡ sự cân bằng sinh thái hệ vi sinh vật và ảnh
hưởng đến độ phì của đất, tăng ô nhiễm môi trường.
Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường
Phân của vật nuôi được nuôi dưỡng bằng các loại thức ăn có kháng sinh không
chỉ gồm các cặn bã của quá trình tiêu hoá hấp thu mà còn chứa rất nhiều loài vi sinh
vật, trong đó có nhiều loài vi khuẩn đã có khả năng kháng một hoặc một vài loại
kháng sinh, chính chúng là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh
trong môi trường.
Với kháng sinh Tetracycline, sự dư thừa trong sữa còn gây thiệt hại về kinh tế vì
làm chậm quá trình lên men sữa chua và lên men pho mát.
1.1.10. Quy định tồn dƣ kháng sinh Tetracycline trong thực phẩm
Những tác hại nghiêm trọng khi sử dụng kháng sinh bừa bãi trong chăn nuôi hiện
nay thực sự đáng báo động. Nhưng nếu loại bỏ hoàn toàn kháng sinh trong điều trị,
trong thức ăn thì chắc chắn sẽ làm tăng chi phí cho nhà sản xuất, sản lượng gia súc,
gia cầm hàng năm không đáp ứng được nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Vấn đề
đặt ra là các cơ quan quản lý liên Bộ-ngành về chất lượng vệ sinh anh toàn thực
phẩm, chất lượng thuốc thú y trong đó có kháng sinh sử dụng trong thức ăn chăn
nuôi thế nào cho đúng và an toàn cho con người. Chẳng hạn như trên thế giới, để
tăng cường kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, Ủy ban Châu Âu, Mỹ
13


MRL (μg/kg)

200

600

1200

100

1.1.11. Các phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng kháng sinh
Các phương pháp phân tích xác định dư lượng kháng sinh trong sữa cũng như
trong các mẫu thịt và các mẫu thực phẩm khác có thể phân thành các nhóm phương
pháp sau:
Phương pháp sắc ký lớp mỏng là phương pháp đơn giản, rẻ tiền và cũng có độ
nhạy cần thiết. Phương pháp này chủ yếu cho phép định tính sự hiện diện của các
kháng sinh trong mẫu phân tích nhưng đôi khi cũng có thể xác định được lượng
kháng sinh trong khoảng 0,4-0,6 μg/kg đối với streptomycin, kanamycin,
gentamycin [57], khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp, ví dụ Acetone–methanol–
ammonia, 5:4,5:0,5 trong phân tích Streptomycin, Chloroform–methanol–ammonia,
1:1:1 trong phân tích Tetracycline.

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


Phương pháp điện di mao quản là kỹ thuật phân tách có nhiều ưu điểm, hiệu

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch được xem xét để đánh giá mức độ tồn dư của kháng
sinh trong mẫu phân tích. Chủng vi sinh vật sử dụng trong phép thử, tất nhiên là
không thể đặc hiệu với tất cả các kháng sinh. Ví dụ, khả năng phát hiện tốt nhất đối
với các kháng sinh nhóm β-lactam là các chủng Geobacillus stearothermophilus,
Kocuria rhizophila, và Bacillus subtilis, trong khi đó đối với các kháng sinh
macrolide là chủng K. rhizophila. Giới hạn phát hiện tetracycline thấp khi sử dụng
chủng Bacillus cereus, còn đối với quinolone là Escherichia coli và Yersinia
ruckeri. Sulfonamid được phát hiện khi sử dụng các chủng G. stearothermophilus
và Bacillus pumilus. Chủng B. subtilis được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của
các aminoglycoside [24]
Phương pháp Bioautography kết hợp với sắc ký lớp mỏng để xác định dư lượng
kháng sinh trong thịt động vật và trong sữa đã tiến hành cho phép xác định được dư
lượng một số kháng sinh trong thịt và trong sữa là: 4 μg/L đối với penicillin G, 100
μg/L đối với oxytetracycline, 200 μg/L đối với streptomycin, 100 μg/L đối với
gentamicin, và 1000 μg/L đối với neomycin. Và dư lượng kháng sinh trong các mẫu
sữa đã tiệt trùng là 150,4 μg/L đối với oxytetracycline, 33,5 μg/L đối với penicillin
G, 7688,4 μg/L đối với neomycin và tỉ lệ các mẫu sữa đã phân tích bị nhiễm chiếm
1,25% [45]
1.2. CÔNG NGHỆ NANO VÀ CẢM BIẾN SINH HỌC
1.2.1. Công nghệ nano
Công nghệ nano là một trong những hướng nghiên cứu mới, có nhiều ứng dụng
trong khoa học và đời sống. Việc kết hợp giữa công nghệ nano và công nghệ sinh
học đã và đang mang lại những thành tựu to lớn, cho phép tạo ra những sản phẩm
khoa học có tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Sử dụng công nghệ

chuyển thuốc tới các tế bào đích mang bệnh đang là những hướng nghiên cứu được
nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và trong nước quan tâm phát triển. Ưu điểm
nổi bật đối với việc sử dụng các cấu trúc nano trong việc tạo các cảm biến sinh học
(biosensor) là tính đặc hiệu và độ nhạy cao. Các hạt nano thường được sử dụng
trong việc tạo các cảm biến sinh học để phát hiện các kháng sinh trong các mẫu
thực phẩm cũng như phát hiện các tác nhân gây bệnh trong cơ thể, trong môi trường
như các hạt nano vàng, các hạt nano bạc, hạt nano từ hoặc quantum dot [28]
Cảm biến sinh học được hai tác giả Clark và Lyons công bố đầu tiên năm 1962,
các năm sau đó, cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc
biệt là các ngành công nghệ vật liệu nano và công nghệ thông tin, cảm biến sinh
học cũng đạt được những tiến bộ vượt bậc. Theo hiệp hội quốc tế về hóa học ứng
17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1999 đã
định nghĩa: Cảm biến sinh học là một thiết bị tích hợp có khả ăng cung cấp thông
tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phân tử nhận biết
sinh học ( bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đồi ( transducer)

Hình 1.3. Mô hình cảm biến sinh học
Như vậy, có thể hiểu cảm biến sinh học là thiết bị phân tích gồm hai thành phần
chính: phần tử nhận biết sinh học và bộ phận chuyển đổi tín hiệu. Phần tử nhận biết
sinh học được cố định trực tiếp hoặc gián tiếp trên bộ phận chuyển đổi tín hiệu. Nó
là một loại vật liệu sinh học có thể liên kết hoặc phản ứng với cơ chất (chất cần
phân tích) sinh ra sản phẩm làm thay đổi tín hiệu sinh hóa trong quá trình phân tích
Đầu thu sinh học là nhưng chất có khả năng phản ứng trực tiếp với các tác nhân
cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học. Có thể phân loại cảm

(5,92 nmol/L) [42, 88]. Sử dung biosensor, Sternesjo và cs (2006) đã xác định được
dư lượng ampicilin trong các mẫu sữa là 2,5 ng/mL với thời gian cần cho phép thử
là 10 phút [72].
1.3. TỔNG QUAN VỀ APTAMER
1.3.1. Giới thiệu về aptamer
Aptamer (thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Latin aptus – phù hợp, tiếng Hy Lạp
meros – phần) có bản chất là axit oligonucleic hoặc các phân tử peptide có khả năng
liên kết chặt chẽ và đặc hiệu với một phân tử đích cụ thể. Aptamer được phát hiện
từ năm 1990 bởi 2 phòng thí nghiệm độc lập Ellington & Szostak, 1990 và Tuerk &
Gold, 1990 [27,79].

19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


Hình 1.4. Hình ảnh cấu trúc của aptamer khi liên kết với protein và kháng sinh
Aptamer được tạo ra theo con đường nhân tạo. Aptamer được sàng lọc bằng
phương pháp SELEX – Systematic Evolution of Ligans by Exponential enrichment
[79]. Quá trình sàng lọc bắt đầu với thư viện oligonucleotide lớn ngẫu nhiên. Các
chuỗi oligonucleotit được ủ với phân tử đích và qua nhiều vòng sàng lọc để lựa
chọn những phân tử có ái lực cao với phân tử đích. Sau đó, sử dụng PCR để khuếch
đại aptamer mong muốn. Được tổng hợp từ những năm 1990 đến nay, aptamer đã
được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các mối
nguy, cảm biến sinh học, điều trị ung thư, y dược, thuốc phân tử, điều trị lâm sàng,
thực phẩm… Phổ đích của aptamer rất đa dạng từ các ion, các phân tử, các chất,
thậm chí cả tế bào [11,43,55,58,59,63,81]. Aptamer còn có khả năng phát hiện các
chất độc hoặc các chất không có hoạt tính miễn dịch. Một số aptamer đã được
nghiên cứu có hằng số phân ly (Kd) trong phạm vi nanomol hoặc picomol [8].

có tính miễn dịch hoặc các cơ chất có tính độc hại, độc tố. Thứ bảy, aptamer có thể
dễ dàng thay đổi với thuốc nhuộm, nhãn đánh dấu và các nhóm bề mặt mà không
ảnh hưởng ái lực của chúng. Cuối cùng, aptamer có khả năng cải biến hóa học linh
hoạt để ứng dụng vào nhiều chức năng, mục đích sử dụng khác nhau.

21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


Bảng 1.2. So sánh ƣu điểm của aptamer và kháng thể
Đặc điểm so sánh

Aptamer

Kháng thể

Có

Không

Chất lượng

Cao hơn

Thấp hơn

Giá thành sản xuất



Dễ dàng mà không
ảnh hưởng hoạt tính
của aptamer

Khó,

dễ

ảnh

hưởng hoạt tính
sinh

học

của

kháng thể

1.3.3. Phƣơng pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment) sàng lọc Aptamer
Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment) là phương sử dụng một nhóm các kỹ thuật sinh học phân tử để tổng
hợp in vitro oligonucleotit (có thể là ssDNA, dsDNA, RNA, các đoạn peptit) có khả
năng liên kết với phối tử, mục tiêu phối tử (phân tử đích) [27]. Trong quá trình sàng
lọc aptamer theo một quy trình SELEX gồm nhiều vòng sàng lọc với 3 quá trình:
chọn lọc những trình tự oligonucleotit (aptamer) gắn với phân tử đích từ thư viện
oligonucletit ngẫu nhiên, thu nhận và khuếch đại những aptamer có khả năng liên
kết đặc hiệu với phân tử đích [27,80].

23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


SELEX chọn lọc trong thư viện ban đầu có 109 đến 1014, 1015 phân tử đồng nghĩa
với việc lựa chọn vùng ngẫu nhiên có số nucleotit từ 20 – 80 [23].
Để tăng tính phức tạp của thư viện oligonucleotit, ta có thể sử dụng thư viện
oligonucleotit được cải biến hóa học, cung cấp những khả năng mới cho sự tương
tác với những phân tử đích như tăng cường sự bền vững của cấu hình
oligonucleotit. Cải biến được sử dụng khá phổ biến ở đây là thay thế nhóm 2’ – OH
của nucleotit prymidine thành nhóm 2’ – NH2. Sự cải biến này giúp bảo vệ các
RNA không bị thoái hóa do các enzyme nuclease phân hủy. Hàng loạt các dUTP
mang axit amin được cải biến ở vị trí cacbon số 5 sẽ giúp tăng cường quá trình cải
biến của DNA. Những cải biến này đã được ứng dụng cho quá trình chọn lọc
aptamer như sử dụng cho các thí nghiệm chọn lọc in vitro sàng lọc aptamer gắn với
phân tử đích dạng anion [11].
Quá trình sàng lọc, thư viện được ủ với những phân tử đích trong đệm, nhiệt độ
phù hợp. Sau đó, sử dụng các kỹ thuật khác nhau để tách các phức hợp aptamer –
đích ra khỏi những phân tử không gắn đặc hiệu. Sử dụng màng nitrocellulose là
phương pháp phổ biến để tách những phân tử protein. Ngoài ra, một số phương
pháp như cố định các phân tử đích vào một phức hệ đặc biệt như sepharose, agarose
hay hạt từ tính cũng là những phương pháp được sử dụng cho giai đoạn tách. Những
trình tự gắn đặc hiệu đã thu được sau giai đoạn phân tách được giải hấp và khuếch
đại để cung cấp thư viện cho vòng sàng lọc sau [25]. Quá trình chọn lọc và khuếch
đại này được lặp lại cho đến khi sàng lọc được aptamer có ái lực cao nhất với phân
tử đích. Phân tử aptamer được lựa chọn sẽ được chuyển sang quá trình tách dòng và
giải trình tự [23,27,79].
1.3.4. Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nƣớc

được sử dụng trong điều trị bệnh như: AS1411, aptamer DNA liên kết đặc hiệu với
necleolin, dùng cho bệnh bạch cầu. ASRC1779, aptamer DNA liên kết đặc hiệu với
willebrand, dùng cho hội chứng nghẽn động mạch vành cấp tính. NU172, DNA
aptamer liên kết đặc hiệu Thrombin, dùng hạn chế hình thành máu động trong quá
trình phẫu thuật tim mạch [54]. Aptamer được nghiên cứu để sử dụng trong điều trị
HIV [84]. Các tác nhân gây bệnh AIDS là một retrovirus mà sử dụng vỏ
glycoprotein (MT) gp160 để ràng buộc và lây nhiễm sang các tế bào T. Gp120 liên
kết với các thụ thể tế bào T CD4 và một trong những chemokine đồng thụ là CCR5
hoặc CXCR4 và làm trung gian kết hợp giữa các hạt virus và máy chủ T-tế bào.
Aptamer liên kết siRNAs hạn chế sự liên kết của gp120 với thụ thể của tế bào người
để ngăn cản sự xâm nhập của virus.
Ngoài ra, aptamer có rất nhiều ứng dụng trong điều trị ung thư: Aptamer kháng
Tenascin – C (TN – C) có thể hạn chế phát triển khối u thần kinh đệm, u vú. TN –
25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

http://www.lrc-tnu.edu.vn/