NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP
VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY
HÓA IN VITRO CỦA ISOFLAVONOID TỪ
HẠT ĐẬU TƯƠNG (Glycine max L.)

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chương 1: TỔNG QUAN

2

1.1 Tổng quan về isoflavonoid

2

1.1.1 Cấu tạo hóa học của isoflavonoid

2


19

2.1.2. Thuốc thử, dung môi, hóa chất

20

2.1.3. Dụng cụ

20

2.2 Phương pháp nghiên cứu

21


2.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong hạt đậu tương

21

2.2.2 Chiết xuất

22

2.2.3. Phân lập và nhận dạng isoflavonoid

24

2.2.4. Xác định hoạt độ chống oxy hóa trên in vitro


3.1.6 Định tính polysaccharid

31

3.1.7 Định tính đường khử

31

3.1.8 Định tính acid amin

32

3.1.9 Định tính chất béo

32

3.1.10 Định tính acid vô cơ

32

3.2 Chiết xuất isoflavonoid

34

3.2.1 Chiết xuất isoflavonoid bằng phương pháp hồi lưu

34

3.2.2 Chiết xuất isoflavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt


53

3.7.1 Về định tính các thành phần chính trong hạt đậu tương

53

3.7.2 Về chiết xuất isoflavonoid toàn phần

53

3.7.3 Về phân lập và nhận dạng isoflavonoid

55

3.7.4 Về hoạt tính chống oxy hóa in vitro

56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

57

Tài liệu tham khảo
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
DĐVN
DNA


Ethanol
Hoạt độ chống oxy hóa
High Density Lipoprotein
Cholesterol
Hoạt tính chống oxy hóa
Low Density Lipoprotein
Cholesterol
Malonyldialdehyd
Methanol
Mass Spectrometry
Nhà xuất bản
Phân đoạn
Peroxy hóa Lipid
Ribonucleic acid
Sắc ký lớp mỏng
Transforming Growth Factor
beta
Thuốc thử
Ultra Violet

Cholesterol tỉ trọng cao
Cholesterol tỉ trọng
thấp
Phổ khối lượng

Acid ribonucleic

Tử ngoại


3.4

3.5

3.6

3.7

33

35

Kết quả định tính isoflavonoid, chất béo, acid amin và đường
của 3 dịch chiết EtOH 90%, MeOH và EtOAc từ hạt đậu tương
Hàm lượng cắn và hiệu suất chiết bằng phương pháp ngấm kiệt
với dung môi EtOH
Kết quả định tính 4 nhóm chất chính của 3 dịch chiết EtOH
40%, 70% và 90% từ hạt đậu tương

36

37

38

Hàm lượng cắn của 3 dịch chiết EtOH 40%, 70% và 90% sau
khi loại chất béo, acid amin và đường

40



1.2

Các dạng cấu trúc vòng C của flavonoid

2

1.3

Cấu trúc 2-phenyl chroman và 3-phenyl chroman

3

1.4

Cấu trúc hóa học của các isoflavonoid trong hạt đậu tương

13


1.5

Cấu trúc hóa học của Oestradiol, diethylstilbenstrol và 2
hormone thực vật genistein và daidzein

2.1

Quả đậu tương và hạt đậu tương nghiên cứu

2.2

Phổ khối chất ĐT1

47

3.4

Công thức cấu tạo của Daidzein

47

3.5

Phổ khối chất ĐT2

48

3.6

Công thức cấu tạo của Glycitein

48

3.7

Phổ khối chất ĐT3

49

3.8


– nhóm chất lấy từ thực vật có tác dụng tương tự như hormone sinh dục 17β
estradiol. Sự kết hợp 2 tính chất này của các isoflavonoid trong hạt đậu tương
giúp cho chúng có được tác dụng tốt trong phòng ngừa một số bệnh như ung
thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư ruột kết..; các bệnh về tim mạch như
tăng lipid máu, vữa xơ động mạch; ngăn ngừa loãng xương… Các
isoflavonoid này còn có tác dụng tốt giúp cải thiện một số hội chứng ở phụ nữ
tiền mãn kinh như cơn bốc hỏa, chứng hay quên, mất tập trung…
Lượng isoflavonoid có trong thực phẩm sử dụng hàng ngày thường là
rất thấp. Để phát huy được những tác dụng quý báu trên, isoflavonoid cần
được bổ sung dưới dạng thuốc hay thực phẩm chức năng.
Vì lí do trên, chúng tôi đề xuất nghiên cứu “Nghiên cứu chiết xuất,
phân lập và đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của isoflavonoid từ
hạt Đậu tương (Glycine max L.)” với 2 mục tiêu nghiên cứu như sau:
1- Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và nhận dạng các isoflavonoid từ
hạt đậu tương.
2- Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của isoflavonoid in vitro.


Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về isoflavonoid
1.1.1 Cấu tạo hóa học của Isoflavonoid


Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Xét về
cấu trúc hóa học thì flavonoid có cấu trúc theo kiểu C6-C3-C6 tức là khung
cơ bản gồm 2 vòng benzen nối với nhau qua một mạch 3 carbon [1].


flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3,
neoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4. Người ta còn phân biệt biflavonoid là
những flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid,
flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan.
Sự khác nhau giữa isoflavonoid và các flavonoid khác chính là bộ
khung cơ bản: flavonoid có cấu trúc khung là 2-phenylchroman, trong khi đó
khung cơ bản của isoflavonoid là 3-phenylchroman [1], [16]


o

o

o

o

2-Phenyl chroman

3-Phenyl chroman

Hình 1.3: Cấu trúc 2-phenyl chroman và 3-phenyl chroman
Isoflavonoid là một phân nhóm đặc biệt và khá lớn của flavonoid,
nhóm chất này có khung cấu trúc là 3-phenylchroman được sinh tổng hợp từ
dẫn chất 2-phenylchroman bằng phản ứng dịch chuyển 1,2-aryl. Sự phân bố
isoflavonoid trong hệ thực vật bậc cao là hạn chế nhưng sự đa dạng về cấu
trúc của isoflavonoid lại rất lớn. Sự đa dạng này không chỉ liên quan đến
khung cấu trúc 3-phenylchroman mà còn liên quan đến mức độ oxy hóa của
khung cấu trúc này cũng như sự có mặt của dị vòng. Phân loại nhóm
isoflavonoid cũng dựa trên hai tiêu chuẩn trên để phân loại. Isoflavonoid được

Isoflavanon được xem là phân nhóm hiếm
hơn so với isoflavon. Isoflavanon được sinh

O

tổng hợp từ isoflavon và pterocarpan.

2

Thường gặp ở họ Đậu.
O

ROTENOID

Rotenoid là 1 isoflavonoid có thêm 1 dị vòng
chứa oxy. Rotenoid được sinh tổng hợp từ 2-

O

O

3

methoxyisoflavon.

O

PTEROCARPAN
O



isoflav-3-en khi có phản ứng loại nước và
cũng là tiền chất của pterocarpan khi đóng

O

vòng với sự tham gia của nhóm OH ở vị trí

6

số 4. Isoflavanol được tìm thấy ở một vài loài
như G. glabla, G. inflata

OH

Được tìm thấy ở các loài Glycyrrhiza như G.
ISOFLAV-3-EN

glabla hay G. inflata.

O

7

3-ARYLCOUMARIN
O

8

O

max,

Phaseolus

lunatus,

Pueraria lobata, Wedelia calendulacea,
Eclipta alba.

10

COUMARONCHRO

Coumaronchromon là một phân nhóm tự

MON

nhiên rất nhỏ trong nhóm isoflavonoid. Ban
đầu chỉ có một chất duy nhất được phân lập

O

O

là listein được phân lập từ loài Piscidia
erythrina. Cho đến nay số chất trong phân

O

nhóm này đã tăng lên 13 chất.

lập

từ

một

vài

loài

Pterocarpus spp.

12
O

Các chất trong nhóm này chủ yếu
được

phân

lập

từ

các

loài

Glycyrrhiza uralensis, Dalbergia
2-ARYLBENZOFURAN

sự hình thành và loại bỏ các gốc tự do khi chúng được sinh ra. Bên cạnh đó
thì trong các nguồn thức ăn cũng như thuốc đưa vào cũng có những chất
chống oxy hóa như vitamin E, β-caroten, flavonoid… cũng có tác dụng chống
lại sự hình thành của các gốc tự do... Khi có sự mất cân bằng giữa quá trình
sinh ra gốc tự do và quá trình loại bỏ gốc tự do thì các gốc tự do sinh ra sẽ gây
tác hại đối với cơ thể. Các gốc tự do phản ứng và làm biến đổi cấu trúc và
chức năng của một số thành phần của tế bào, chẳng hạn như lipid ở màng tế
bào, lipoprotein, RNA, DNA, và là nguyên nhân tạo nên nhiều bệnh mãn tính
như ung thư, tim mạch, quá trình lão hóa, các bệnh về khớp, rối loạn thần
kinh…[28], [32].
Tác dụng chống oxy hóa của các isoflavonoid chủ yếu là các nhóm
hydroxyl phenol ở vòng B và vòng A, các nhóm này có khả năng nhường
H/electron. Các isoflavonoid tác dụng chống oxy hóa theo hai cách: phản ứng


trao đổi H/electron với các gốc tự do nhờ các nhóm OH phenol trong phân tử
và thúc đẩy hoạt động của các enzyme chống oxy hóa nội sinh như
glutathione peroxidase, superoxide dimutase, catalase.... Ngoài ra thì có một
số tài liệu còn đề cập đến khả năng chống oxy hóa của các isoflavone bằng
cách tạo chelat với đồng và sắt, là những chất tham gia làm thúc đẩy phản ứng
oxy hóa tạo ra các gốc tự do trong cơ thể [28].
1.1.2.2 Tác dụng trên hệ thống tim mạch
Các isoflavonoid ngăn cản quá trình oxy hóa LDL-Cholesterol, làm
giảm Cholesterol toàn phần trong đó làm giảm LDL-Cholesterol và làm tăng
HDL-Cholesterol do vậy làm giảm nguy cơ xơ cứng động mạch. Isoflavonoid
như puerarin, daidzein lại có tác dụng hạ huyết áp, chống loạn nhịp tim. Trên
tuần hoàn não, chúng làm giảm trợ lực mạch máu vỏ não, tăng lưu lượng máu
qua não [7], [16], [24], [28], [32].
1.1.2.3 Chống ung thư
Một số isoflavonoid (genistein) có khả năng ức chế sự phát triển của

những con đang mang thai lại thường bị sảy thai. Về sau người ta tìm ra
nguyên nhân là do cây cỏ ba lá (Trifolium uniflorum) mọc với số lượng lớn
trên những cánh đồng cỏ này chứa một hàm lượng lớn các isoflavonoid là
formononetin và biochanin A. Đây cũng là những phytoestrogen đầu tiên
được phát hiện [29].


Trong những năm gần đây mối quan tâm của các nhà khoa học đối với
các hormone thực vật đã tăng lên nhanh chóng khi các nhà khoa học thấy liệu
pháp điều trị thay thế hormone cho phụ nữ tuổi tiền mãn kinh không an toàn
và hiệu quả như mong muốn. Sự phổ biến của các hormone thực vật trong chế
độ ăn uống và tác dụng sinh học của chúng đang rất được các nhà khoa học
quan tâm [30].
Nghiên cứu dịch tễ một số bệnh ung thư phụ thuộc oestrogen như ung
thư vú, ung thư tử cung, cho thấy lượng phytoestrogen trong khẩu phần ăn
của người châu Á cao hơn trong khẩu phần ăn của người châu Âu và Mỹ cùng
với tỷ lệ mắc bệnh thấp hơn người châu Âu và Mỹ. Nhóm người châu Á di cư
sang Mỹ có tỷ lệ bệnh cao hơn nhóm người sống tại chính nước họ [24], [28],
[30], [32].
Theo nhiều kết quả nghiên cứu, một số isoflavonoid có cấu trúc hóa
học tương tự như các oestrogen nội sinh và gây ra tác dụng đối kháng hay chủ
vận với oestrogen. Tác dụng đối kháng hay chủ vận này phụ thuộc vào nồng
độ của chúng hoặc các mô đích mà chúng tác dụng. Trong các isoflavonoid
thì genistein là chất có hoạt tính oestrogen mạnh nhất [16],[19],[28],[32].
Có nhiều nghiên cứu đã chứng minh việc sử dụng các phytoestrogen,
trong đó có các isoflavonoid với liều cao có tác dụng cải thiện rõ rệt các triệu
chứng do thiếu hụt oestrogen ở các phụ nữ mãn kinh mà không gây ra các tác
dụng phụ nghiêm trọng như liệu pháp thay thế hormone.
1.1.2.5 Các tác dụng khác
Các isoflavonoid có tác dụng chống viêm giống như nhóm flavanon, 4arylcoumarin, dihydroflavonon, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcon, biflavon,

Toàn cây chứa nước 12%, glucid 16%, Protein 14-15%, muối khoáng
6% và một số chất khác không có Nitơ [8].
Hạt Đậu tương (100g hạt) chứa [6], [8]:
-

Nước: 8g

-

Chất vô cơ: 4-5g bao gồm K (2 g); Na (0,38 g); Ca (0,23 g); P (0,65 g);

Mg (0,24 g) và S (0,46 g).
- Glucid: 15-25g
- Chất béo: 15-20g
- Các acid amin: 35-40g bao gồm: Glycin (0,97 g); Valin (0,63 g); Leucin
(8,45 g); Isoleucin (1,7g), Prolin (3,78 g); Threonin (1,6 g); Phenylalanin
(3,86 g); acid aspartic (3,89 g); acid glutamic (19,46 g); Tyrosin (1,86 g);
Arginin (7,8 g); Histidin (1,39 g); Lysin (2,96 g); Tryptophan (1,25 g); Serin
(1,8 g); Alanin (1,7 g); Cystin (1,18 g) và Methionin (0,68 g).
-

Ngoài ra, còn một số các chất khác như:
- Dẫn chất isoflavonoid: genistein, daidzein và glycitein.
- Sắc tố anthoxyan trong các loại đậu tím, đen.
- Vitamin: tan trong nước (B1, B2, PP), tan trong dầu (A, D, E, K, I).
- Các enzym: Amylase, Lipaseidin, Protease, Urease...
Đậu tương và Sắn dây có hàm lượng isoflavonoid cao nhất trong các

cây họ Đậu. Các loại đậu khác cũng như các chế phẩm có nguồn gốc từ Đậu
tương chỉ chứa rất ít các chất này. Hình 1.4 trình bày cấu trúc hóa học của các

H

Genistin

OH

H

Glu

H

Daidzein

H

H

H

H

Daidzin

H

H

Glu


thực phẩm làm từ Đậu tương
Thức ăn

Genistein (mg/100g) Daidzein (mg/100g)

Isoflavonoid
toàn phần


(mg/100g)
Đậu cho trẻ em

1,6 - 15

0,8 - 9,7

2,6 - 31

Sữa đậu

1,1 - 11,3

1,1 - 9,8

1,3 - 21

Hạt đậu tương

1,1 - 150


Các isoflavonoid trong hạt đậu tương có tính oxy hóa mạnh, trong đó
mạnh nhất là genistein và cũng là chất được quan tâm và nghiên cứu nhiều
nhất. Hoạt tính chống oxy hóa của các isoflavonoid trong đậu tương là do các
nhóm OH phenol của vòng A và B có khả năng nhường H/electron cho các
gốc tự do. Khả năng dập tắt các gốc tự do được thể hiện qua nghiên cứu khả
năng dập tắt chuỗi phản ứng tạo gốc tự do trên chuột khi chiếu tia cực tím B
trên thực nghiệm [28], [32].
Sự peroxy hóa lipid được tiến hành trên microsom tim và gan của chuột
cống trắng và dùng adriamycin là chất sinh ra các gốc tự do, kết quả cho thấy
dịch chiết đậu tương có tác dụng giảm sự peroxy hóa lipid [6].
Tác dụng chống oxy hóa của isoflavonoid chiết xuất từ đậu tương được
nghiên cứu so sánh với α-tocopherol. Kết quả cho thấy isoflavonoid có tác
dụng mạnh hơn α-tocopherol từ 80 – 100 lần [6]. Ngoài tác dụng dập tắt các
gốc tự do, Các isoflavonoid trong đậu tương còn có khả năng thúc đẩy hoạt


động của các enzyme chống oxy hóa nội sinh như glutathione peroxidase,
superoxide dismutase và glutathione reductase ... [17],[24],[28],[32].
Do có tác dụng chống oxy hóa mạnh nên các isoflavonoid đậu tương
còn có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh (các tế bào thần kinh bị tổn thương và
chết do bị các tác nhân oxy hóa tấn công), do đó các isoflavone còn rất có lợi
cho những người bị các bệnh tổn thương tế bào thần kinh như bệnh
Parkinson, Alzheimer [28].
1.2.3.2 Tác dụng kiểu Estrogen
Các isoflavonoid có trong hạt đậu tương đều được xếp vào nhóm các
chất phytoestrogen. Các nhà khoa học đã so sánh về mặt cấu trúc của 17βestradiol, diethylstilbenstrol với genistein và daidzein thấy có sự tương đồng
về mặt cấu trúc. Điều này có thể giải thích một phần tại sao genistein có thể
gắn vào các thụ thể oestrogen. Hình 1.5 trình bày sự tương đồng về cấu trúc
hóa học của hormon oestradiol và các dẫn chất stilben, isoflavonoid như
diethylstilbenstrol, genistein và daidzein.