BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
----------

PHẠM BÁ HẠNH
Mã sinh viên: 1101160

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA
MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ
CỎ SỮA LÁ LỚN
(EUPHORBIA HIRTA L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM BÁ HẠNH
Mã sinh viên: 1101160

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA
MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ
CỎ SỮA LÁ LỚN
(EUPHORBIA HIRTA L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thu Hằng

Tôi xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Phạm Bá Hạnh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1. Đặc điểm thực vật...............................................................................................2
1.2. Phân bố ................................................................................................................3
1.3. Thành phần hóa học ..........................................................................................3
1.4. Tác dụng sinh học.............................................................................................10
1.5. Công dụng .........................................................................................................14
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ...................................................................................15
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................19
2.3.1. Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn
...............................................................................................................................19
2.3.2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân
đoạn dịch chiết .......................................................................................................19
2.3.3. Phân lập các hợp chất từ cỏ sữa lá lớn .......................................................20
2.3.4. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập được .................20
2.3.5. Xử lý kết quả thực nghiệm ...........................................................................20
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................21


dd

double doublet

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DPPH

1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl

IC50

Inhibitory concentration of 50% (Nồng độ ức chế 50% đối
tượng thử)

IL

Interleukin

iNOS

inducible nitric oxide synthase

J

Hằng số tương tác


Độ dịch chuyển hóa học


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn

4

1.2

Các hợp chất triterpen trong cây cỏ sữa lá lớn

7

1.3

Các hợp chất diterpen trong cây cỏ sữa lá lớn

8

3.1

2.1

Ảnh chụp cây cỏ sữa lá lớn nghiên cứu tại thực địa

15

2.2

Ảnh chụp BPTMĐ cỏ sữa lá lớn

16

2.3

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

18

Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất dịch chiết methanol và

22

3.1
3.2

các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lá lớn
Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập các hợp chất từ phân

24


kiếm những hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa để nghiên cứu ứng dụng trong
phòng và điều trị những bệnh có liên quan tới gốc tự do là cần thiết, trong đó các
hợp chất tự nhiên là một đối tượng tiềm năng và được quan tâm.
Cây cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L., thuộc họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae), là loài cây mọc hoang và tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh ở
nước ta [8]. Theo kinh nghiệm dân gian, bộ phận trên mặt đất của cây được sử dụng
để chữa một số bệnh như nhiễm khuẩn đường ruột, nhiễm khuẩn ngoài da, viêm phế
quản, viêm thận [5], [8]. Nghiên cứu bằng thực nghiệm cho thấy cỏ sữa lá lớn có tác
dụng chống viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, hạ đường huyết [17],
[42], [43], [60]. Trong số các tác dụng được nghiên cứu của cỏ sữa lá lớn, nhiều tác
dụng có liên quan đến khả năng dọn gốc tự do. Trên thế giới, một số tài liệu cũng đã
công bố về tác dụng chống oxy hóa của cỏ sữa lá lớn [44], [73]. Tuy nhiên, ở Việt
Nam, chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác dụng chống oxy hóa, dọn gốc tự do của
dược liệu này. Chính vì vậy, đề tài “Phân lập và đánh giá tác dụng chống oxy
hóa của một số hợp chất từ cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.)” đã được thực
hiện với hai mục tiêu:
1. Phân lập 2 hợp chất từ cây cỏ sữa lá lớn.
2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được.


2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
Cây cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L., thuộc họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae) [1]. Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [74], chi Euphorbia
có vị trí phân loại như sau:
Giới: Plantae (Thực vật)
Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan)
Lớp: Magnoliopsida (Ngọc lan)
Phân lớp: Dilleniidae (Sổ)

Loài Euphorbia hirta L. có nguồn gốc từ vùng Trung Mỹ [17], [36] nhưng
phân bố chủ yếu ở một số nước thuộc khu vực nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á gồm
Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Lào, Việt Nam và một số nơi ở phía nam
Trung Quốc. Ở Việt Nam, cây mọc tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh trong cả
nước [8].
1.3. Thành phần hóa học
Theo các tài liệu thu thập, thành phần hóa học của cỏ sữa lá lớn gồm các hợp
chất có cấu trúc đa dạng và có thể chia thành 8 nhóm chính như sau: flavonoid,
tanin, triterpen, diterpen, sterol, acid hữu cơ, tinh dầu và các thành phần khác.
1.3.1. Flavonoid
Nhiều nghiên đã chỉ ra flavonoid là thành phần chính của cây cỏ sữa lá lớn
[77]. Đây cũng là nhóm hợp chất được quan tâm nghiên cứu nhiều trong cỏ sữa lá
lớn.
Kết quả nghiên cứu của tác giả Basma và cộng sự [19] cho thấy hàm lượng
flavonoid trong lá cao nhất, tiếp theo là hoa, rễ và thân. Ở Việt Nam, Nghiên cứu
của tác giả Nguyễn Thị Thúy Quỳnh [6] đã xác định hàm lượng flavonoid toàn phần
trong BPTMĐ cỏ sữa lá lớn tính theo quercitrin là 0,578 % trong dược liệu khô
tuyệt đối.
Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn được trình bày tóm tắt ở bảng
1.1.


4

Bảng 1.1. Các hợp chất flavonoid trong cây cỏ sữa lá lớn
Ký
hiệu

Tên chất


4

Epigallocatechin gallat

5

Cyanidin-3-glucosid

6

Cyanidin-3,5-diglucosid

Toàn
cây

Toàn

[62]

[62]

cây

Toàn

[8]

cây

Toàn


11

Luteolin-7-O-glucosid

12

Myricitrin

13

Cấu trúc hóa học

Bộ
phận

TLTK

BP
TMĐ

[77]

BP
TMĐ
Toàn
cây

BP
TMĐ

14

Pinocembrin

15

Quercetin

BP
TMĐ

[77]

BP
TMĐ

[77]


6

Ký
hiệu

16

17

Tên chất



Xanthorhamnin

Toàn

[17],

cây

[36]

Toàn
cây

[8],
[17],
[36]

5,7-dihydroxy-2-(3’,4’,5’20

trihydroxy-phenyl)-3-O-

Toàn

rhamnosyl-4H-

cây

[50]



26

Cấu trúc hóa học

Bộ
phận
BPT
MĐ

MĐ

[63]

Toàn
cây
BPT
MĐ

23-en-3β-ol

cây

24-hydroperoxy cycloart-

Toàn

25-en-3β-ol

cây

Toàn

[17],

cây

[36]

BPT
MĐ

[2]


8

Ký
hiệu

29

Tên chất

Cấu trúc hóa học

11α-12α-oxidotaraxerol

31

Lupeol

Toàn
cây

[63]

[63]

1.3.3. Diterpen
Các diterpen trong cây cỏ sữa lá lớn được trình bày tóm tắt ở bảng 1.3.
Bảng 1.3. Các diterpen trong cây cỏ sữa lá lớn
Ký
hiệu
33

34

35

36

37

Tên chất

Câu trúc hóa học

Bộ
phận

12-deoxyphorbol-13-

2β-16α-19-trihydroxy-

Toàn

[78]

ent-kauran

cây

2β-16α-dihydroxy-ent-

Toàn

kauran

cây

Ingenol triacetat

[78]


9

Ký
hiệu
38

16α-19-dihydroxy-ent-

tanin thủy phân, được trình bày tóm tắt ở phụ lục 2.
1.3.8. Các thành phần khác
 Alcol: quercitol [36], alcol myricyl [5], [36], inositol, L-hexacosanol [8].
 Alkan: hentriacontan [8], heptacosan, n-nonacosan [17].
 Đường: glucose, fructose, sucrose [8] .
 Alcaloid, acid amin [8], saponin [37] và muối khoáng [17], [36].
 Ngoài ra có hai hợp chất mới được phân lập: n-butyl-1-O-β-L-rhamnopyranosid
và n-butyl-1-O-L-rhamnopyranosid [50].


10

1.4. Tác dụng sinh học
1.4.1. Tác dụng chống oxy hóa
Tác dụng chống oxy hóa của cỏ sữa lá lớn là tác dụng được quan tâm và có
nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng bằng các phương pháp dọn gốc tự do DPPH,
dọn gốc tự do superoxid, dọn gốc tự do hydroxyl, dọn gốc tự do nitric oxid in vitro.
Dịch chiết nước của lá cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng chống oxy hóa và dọn
gốc tự do mạnh nhất ở nồng độ 0,25 mg/ml [44]. Ở nồng độ này, tác dụng dọn gốc
tự do DPPH, hydroxyl và ức chế peroxyd hóa lipid với giá trị % ức chế (I%) tương
ứng là 68,80 %, 73,36 % và 77,45 % [44]. Dịch chiết ethanol thân cỏ sữa lá lớn ở
nồng độ 250 µg/ml thể hiện tác dụng dọn gốc tự do DPPH, superoxyd, nitric oxyd
với I% tương ứng là 59,95 %, 59,67 % và 28,54 % [73]. Dịch chiết ethanol của toàn
cây cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng dọn gốc tự do DPPH với giá trị IC50 = 0,205
mg/ml [67].
Dịch chiết nước và dịch chiết methanol của toàn cây cỏ sữa lá lớn có tác
dụng chống oxy hóa tương đương với các loại trà xanh và trà đen [25]. Dịch chiết
methanol của các bộ phận (lá, hoa, thân, rễ) của cây cỏ sữa lá lớn ở cùng nồng độ 1
μg/ml được đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH; dịch chiết lá cho tác dụng mạnh
nhất với I% đạt (72,96 %), tiếp theo lần lượt là dịch chiết hoa (52,45 %), rễ (48,59

thấy dịch chiết ethanol và chloroform có tác dụng kéo dài thời gian sống trung bình
và giảm rõ rệt kích thước khối u [60].
Dịch chiết methanol của toàn cây cỏ sữa lá lớn được đánh giá ảnh hưởng trên
dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ở các nồng độ 1,96-250,00 μg/ml cho thấy thể hiện
tác dụng ức chế với giá trị IC50 = 25,26 μg/ml sau 24h [46].
1.4.4. Tác dụng chống viêm
Dịch chiết n-hexan BPTMĐ cỏ sữa lá lớn, thành phần chính được xác định là
các triterpen như β-amyrin, 24-methylenecycloartenol và β-sitosterol thể hiện tác
dụng chống viêm trên mô hình gây viêm bằng 12-O-tetradecanoyl phorbol acetat
trên tai chuột [48], [52]. Dịch chiết nước và ethanol toàn cây của cỏ sữa lá lớn thể
hiện tác dụng chống viêm rõ rệt ở chuột trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng
carrageenan ở các mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg dùng đường uống so với mẫu


12

chứng và natri diclofenac 50 mg/kg, cơ chế có thể do thành phần trong dịch chiết ức
chế một trong những trung gian gây viêm như histamin, 5-HT, kinin hoặc
Prostaglandin [28].
Dịch chiết ethanol của cỏ sữa lá lớn và β-amyrin (một thành phần của cây)
có tác dụng chống viêm vượt trội, có thể phong bế hầu hết các chức năng của
protein iNOS và sự cảm ứng NO; thể hiện tiềm năng ức chế chọn lọc NO để điều trị
viêm khớp [69].
Phân đoạn A (được phân lập từ dịch chiết nước toàn cây cỏ sữa lá lớn bằng
phương pháp sắc ký pha đảo, hệ dung môi rửa giải nước – methanol (1:0  0:1) tác
dụng ức chế PGE2 mạnh nhất tại các nồng độ 0,1, 1 và 10 μg/ml so với dịch chiết
nước và các phân đoạn khác trên nguyên bào sợi hoạt dịch của thỏ (HIG-82) [24].
1.4.5. Tác dụng trên hệ thống thận
Dịch chiết nước và ethanol lá cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng lợi tiểu trên
chuột Wistar ở mức liều 50 mg/kg tại 24h và 100 mg/kg tại 6h dùng đường tiêm; so

bình thường và làm giảm tác dụng gây tiêu chảy của dầu thầu dầu trên chuột ở mức
liều 100 mg/kg, 300 mg/kg và 1000 mg/kg dùng đường uống so với mẫu chứng
[35].
Dịch chiết nước được sắc toàn cây cỏ sữa lá lớn ở mức liều 350 mg/kg và
700mg/kg có tác dụng chống tiêu trên mô hình gây tiêu chảy bởi dầu thầu dầu, acid
arachidonic và prostaglandin E2 [31]. Quercitrin được phân lập từ cỏ sữa lá lớn
cũng được chứng minh hoạt động như một hợp chất có tác dụng chống tiêu chảy từ
mức liều 25 mg/kg [31].
1.4.9. Tác dụng làm lành vết bỏng
Dạng kem 2% (kl/kl) được bào chế từ dịch chiết ethanol toàn cây cỏ sữa lá
lớn có tác dụng làm lành vết thương do bỏng trên chuột đối chiếu với mẫu chứng và
thuốc đối chứng là thuốc mỡ nitrofurazon 0,2% (kl/kl) [39]. Khả năng dọn gốc tự do
của các hợp chất phenolic trong cỏ sữa lá lớn như myricitrin, quercitrin, kaempferol,
luteolin và acid gallic có vai trò quan trọng trong quá trình làm lành vết bỏng [58].
1.4.10. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Dịch chiết ethanol của lá cỏ sữa lá lớn thể hiện tác dụng ức chế sự tăng
trưởng của các chủng vi khuẩn như Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, và Bacillus subtili [40]. Các hợp chất tanin, alcaloid và


14

flavonoid trong cây được cho là có vai trò chính trong tác dụng kháng khuẩn [40].
Dịch chiết ethyl acetat của lá cỏ sữa lá lớn ức chế sự tăng trưởng của Pseudomonas
aeruginosa,

Staphyloccus

aureus,


vật - Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu tiêu bản là HNIP/18112/15. Căn cứ
vào đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, đối chiếu với khóa phân loại của Thực
vật chí Trung Quốc [21], mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu đã được giám định tên khoa
học là Euphorbia hirta L., họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).
BPTMĐ của cây cỏ sữa lá lớn được sấy khô, cắt thành các đoạn 4-6 cm và
được bảo quản trong túi nilon, để nơi khô ráo, thoáng mát.
Ảnh chụp mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu được trình bày ở hình 2.1 và hình
2.2.

Hình 2.1. Ảnh chụp cây cỏ sữa lá lớn nghiên cứu tại thực địa


16

Hình 2.2. Ảnh chụp BPTMĐ cỏ sữa lá lớn
2.1.2. Hóa chất, dung môi
Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích gồm có:
-

Các dung môi: ethanol tuyệt đối, methanol (MeOH), n-hexan, chloroform
(CHCl3), ethyl acetat (EtOAc), dichloromethan (CH2Cl2), aceton, toluen, acid
formic.

-

Hóa chất: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, Mỹ).

-

Thuốc thử: Dung dịch ammoniac đặc, acid sulphuric 10% trong ethanol.

-

Máy cất quay Buchi Rotavapor R-200 (Đức).

-

Đèn soi tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm.

-

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AVANCE AM500 FT-NMR
tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

-

Máy đo quang Hitachi U-1900.

-

Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg.

-

Tủ sấy Memmert (Đức).

-

Máy ảnh Canon.

-