BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
****************************

PHẠM THỊ CHÚC

KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM TÌM KHÁNG THỂ KHÁNG NHÂN
BẰNG KĨ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP
TRÊN TẾ BÀO HEP-2 TẠI BỆNH VIỆN DA LIỄU
TRUNG ƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ Y KHOA
KHÓA 2009-2015

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Bác sĩ VŨ NGUYỆT MINH

Hà Nội - 2015


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn tới:
Cô Vũ Nguyệt Minh, người thầy đã trực tiếp dìu dắt, tận tình hướng
dẫn và cho tôi những kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi vượt qua những khó
khăn, trở ngại để tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn đảng ủy, ban giám hiệu, phòng đào tạo
trường Đại học Y Hà Nội, bộ môn Da liễu trường Đại học Y Hà Nội, các cán

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ANA

Antinuclear antibody

Anti IgG-FITC

Kháng thể kháng nhân
Kháng thể kháng IgG của người đã gắn

Anti- phospholipid
Anti- Sm
Anti SSA

huỳnh quang
Kháng thể kháng phospholipid
Kháng thể kháng Smith
Kháng thể kháng Ro

Anti-DNP
Anti ENA
Anti-Jo-1
DNA
ELISA

Anti-Sjögren's-syndrome-related antigen A
Anti Dinitrophenyl
Anti-extractable nuclear antigens
Antihistidyl transfer RNA synthetase
Axit Deoxyribo Nucleic

(kỹ thuật miễn dịch phóng xạ)
Systemic lupus erythematosus

SS
Tif 1γ
VBC
XCBHT

( bệnh lupus ban đỏ hệ thống)
Hội chứng Sjögren
Transcriptional intermediary factor 1
Viêm bì cơ
Xơ cứng bì hệ thống



MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

DANH MỤC HÌNH


8

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tổ chức liên kết tự miễn là các bệnh lý do có sự kết hợp của tự

bào HEp-2 đã được áp dụng trên thế giới từ những năm 1980, tuy nhiên tại
Bệnh viện Da liễu Trung ương kĩ thuật này mới được triển khai từ tháng
5/2013. Mặt khác, hiện nay tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu cụ thể về
kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài "Kết quả xét nghiệm tìm kháng thể
kháng nhân bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào
HEp-2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương" với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát chỉ định xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kĩ thuật
miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp- 2 tại Bệnh viện Da
liễu Trung ương từ 5/2013- 12/2014
2. Đánh giá kết quả xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kĩ thuật
miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp- 2 của các bệnh nhân
mắc bệnh tổ chức liên kết tự miễn đủ tiêu chuẩn


10

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Các kĩ thuật xét nghiệm phát hiện tự kháng thể
1.1.1. Xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật miễn dịch
huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2
1.1.1.1. Lịch sử
Kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (MDHQGT) được Coons đề
xướng năm 1942, đây là một bước ngoặt trong nghiên cứu miễn dịch học,
miễn dịch bệnh học cũng như nghiên cứu bệnh sinh một số bệnh. Năm 1954,
Coons và weller đã áp dụng kỹ thuật MDHQGT để nghiên cứu và chẩn đoán
tự kháng thể. Sau 3 năm, Weir và Johson đã dùng kĩ thuật này để phát hiện
kháng thể kháng nhân (antinuclear antibody- ANA) trong huyết thanh bệnh
nhân lupus ban đỏ hệ thống (Systemic lupus erythematosus - SLE). Trước

Kháng thể (nếu có) trong huyết thanh bệnh nhân sẽ kết hợp với kháng
nguyên nhân (nhân tế bào HEp-2), phức hợp kháng nguyên-kháng thể được
phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang nhờ kết hợp với kháng thể kháng
IgG của người đã gắn huỳnh quang (anti IgG-FITC).
Tế bào HEp-2 được sử dụng như một cơ chất nền trong phương pháp
này để phát hiện các loại ANA, kháng hạt nhân, kháng các thành phần của
bào tương (DNA, histon, nucleosom, ribosom, enzyme…) [7]
1.1.1.4. Cách tiến hành xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật
MDHQGT trên tế bào HEp-2
- Các xét nghiệm được thực hiện tại phòng xét nghiệm Bệnh viện Da Liễu
Trung ương với kit FLUORO HEPANA của hãng MBL – Nhật bản
- Lấy bệnh phẩm: Lấy máu tĩnh mạch 3ml vào ống không chống đông, để
ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, ly tâm với tốc độ 2000 vòng/15 phút. Chắt
phần huyết thanh vào ống 1,5ml, lưu ở tủ lạnh sâu -800C.


12

- Chuẩn bị bệnh phẩm: Huyết thanh
bệnh nhân được pha loãng với dung
dịch phosphate buffer saline (PBS)

Huyết thanh

theo tỷ lệ 1:40.
- Chuẩn bị lam kính có gắn tế bào
HEp-2: Lam kính được để ở nhiệt độ
phòng ít nhất 5 phút trước khi sử dụng.

Ủ ở buồng ẩm, 37 0C - 30 phút

Glycerin

giọt glycerin vào mỗi giếng, đậy lam
nhẹ nhàng tránh tạo bọt.

Đọc bằng kính hiển vi

- Đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh Hình 1.1 Quy trình xét nghiệm
quang

MDHQGT trên tế bào HEp-2


13

1.1.1.5. Nhận định kết quả:
- Gián tiếp thông qua kháng thể IgG có gắn FITC, dưới kính hiển vi huỳnh
quang sẽ phát hiện được các kháng thể người bệnh gắn trên tế bào HEp-2.
Tuỳ vị trí gắn và mức độ huỳnh quang, kết quả sẽ đưa ra kiểu lắng đọng và
đậm độ huỳnh quang.
- Âm tính: nhân không nhuộm màu sáng xanh, toàn bộ tế bào màu đỏ nhân
sẫm hơn.
- Dương tính: trên nền tế bào đỏ, nhân tế bào to tròn nhuộm màu sáng
xanh. Test được nhận định dương tính khi hiệu giá huyết thanh pha loãng là
1/40 trở lên.
Âm tính
Nhân không nhuộm màu sáng xanh, toàn
bộ tế bào màu đỏ, nhân màu đỏ sẫm hơn.

Dạng lắng đọng Homogenerous

mịn và đều.
–

- Hạt nhân không bắt màu.

–

- Tế bào phân chia: không bắt
màu.
- Kháng thể: Anti-extractable

–

nuclear antigens (anti-ENA) (Sm, SSA,
SSB, ribonucleoprotein- RNP).
- Bệnh: SLE (anti-Sm), bệnh

–

tổ chức liên kết hỗn hợp (anti-RNP), SS
(anti-SSB)
Dạng lắng đọng Peripheral (viền
nhân)
–

- Màng nhân bắt màu sáng
hơn so với trung tâm nhân.

–


rác)
- Nhân tế bào bắt màu đồng

–

nhất và có vùng không bắt.
- Số lượng đốm bắt màu: 40 –

–

60 hạt.
- Tế bào phân chia: các đốm

–

xếp theo đường ngang.
–

- Kháng thể: anti-centromere

–

- Bệnh: hội chứng CREST
Hình 1.2: Một số dạng lắng đọng MDHQGT trên tế bào HEp-2
thường gặp
1.1.1.6. Ý nghĩa kết quả:
Xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật MDHQGT trên tế
bào HEp-2 cung cấp hai thông tin: nồng độ và kiểu lắng đọng huỳnh quang.
Trong đó:
Nồng độ quyết định ngưỡng dương tính, gợi ý loại kháng thể (vì có

Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên
hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). Theo tác giả


17

Sinico, độ nhạy của phương pháp ELISA dao động từ 70 đến hơn 90% [13]
và từ 90 – 96% theo nghiên cứu của Copple [14]. ELISA có tính tự động hóa
cao nhưng kém đặc hiệu so với MDHQGT và chất lượng phụ thuộc nhiều vào
hãng sản xuất.
1.1.2.3. Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay-RIA)
Nguyên lý: Dùng đồng vị phóng xạ như Thymidin H3, Cacbon 14, I125...
đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp kháng
nguyên kháng thể. Kỹ thuật định lượng miễn dịch phóng xạ có thể phát hiện
nồng độ tối thiểu là 0,0001 mg/ml [10], [11]. Tuy nhiên, RIA đòi hỏi sinh vật
phẩm đắt tiền, máy đo tia gamma hoặc beta và trang bị xử lý chất thải.
1.2. Tổng quan về bệnh tổ chức liên kết tự miễn
1.2.1. Khái niệm
Bệnh tổ chức liên kết tự miễn (Autoimmune connective tissue diseases ACTDs) là các bệnh lý do có sự kết hợp của tự kháng thể với tự kháng
nguyên dẫn đến tổn thương thực thể và chức năng tại tế bào, tổ chức hay cơ
quan[1],[2]
Các bệnh thuộc nhóm này gồm: [10]
- Lupus ban đỏ hệ thống.
- Xơ cứng bì hệ thống.
- Viêm bì cơ/viêm đa cơ.
- Bệnh tổ chức liên kết hỗn hợp.
- Và các bệnh khác như viêm khớp dạng thấp, viêm mạch, hội chứng
Sjögren, hội chứng kháng phospholipid...
1.2.2. Bệnh lupus ban đỏ hệ thống
Lupus ban đỏ hệ thống (Systemic lupus erythematosus - SLE) là một


9. Rối loạn về máu: giảm số lượng các thành phần bạch cầu, hồng cầu…
trong máu.
10. Rối loạn miễn dịch: phát hiện kháng thể kháng Axit Deoxyribo Nucleic
(DNA), kháng Smith hoặc kháng thể antiphospholipid
11. ANA dương tính
Chẩn đoán SLE khi có ≥ 4/11 tiêu chuẩn. Trong 11 tiêu chuẩn đó ANA coi
là tiêu chuẩn quan trọng nhất, gặp ở 94% các trường hợp [1]
1.2.2.2. Các tự kháng thể có thể gặp trong SLE:
- ANA
ANA gặp ở 94% bệnh nhân SLE và được coi là một trong số 11 tiêu
chuẩn để chẩn đoán bệnh SLE. Theo Tan và cộng sự tỷ lệ ANA dương tính
bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp với độ pha loãng 1/40 là
97,4% [5]. ANA gặp ở 78% bệnh nhân XCBHT, trong VBC là 19%. Tuy
nhiên, độ đặc hiệu của ANA không cao, có thể gặp trong các bệnh tự miễn
khác, bệnh lý nhiễm trùng mãn tính và gặp cả ở người bình thường đặc biệt là
người già [16]
- Kháng thể kháng DNA [1], [16]
Kháng thể kháng DNA bao gồm kháng thể kháng DNA chuỗi kép (antids DNA - antibodies to double-stranded DNA): tỉ lệ dương tính cao 70-90%
ở bệnh nhân SLE [2], [17], độ đặc hiệu cao 95% [3], rất có ý nghĩa trong chẩn
đoán SLE.
Kháng thể kháng DNA chuỗi đơn (anti-ss DNA - antibodies to singlestranded DNA) gặp ở 30% bệnh nhân SLE, tuy nhiên nó có thể gặp trong
bệnh SLE do thuốc, các bệnh nhiễm trùng và các bệnh tự miễn khác.


20

- Kháng thể kháng Histon (Antibodies to individual histones)
70% bệnh nhân SLE có kháng thể kháng Histon dương tính, đó là kháng
thể kháng tiểu phần H1 và H2B. Kháng thể kháng Histon H2A-2B, H3, H4

phospholipid đặc trưng bởi sẩy thai nhiều lần, tiền sản giật, huyết khối tĩnh
mạch, động mạch trung tâm và ngoại vi.
1.2.3. Bệnh xơ cứng bì hệ thống (systemic sclerosis)
Xơ cứng bì hệ thống (XCBHT) là một bệnh tự miễn mạn tính, không rõ
căn nguyên, đặc trưng về lâm sàng bởi tình trạng rối loạn vận mạch, xơ, teo
da, tổ chức dưới da, cơ khớp, tiêu hóa, phổi, tim, thận, hệ thần kinh. Bệnh
thường gặp ở nữ (tỷ lệ nữ/nam = 4/1). Tần số bệnh XCBHT khoảng 2,3- 10
bệnh nhân trên 1.000.000 người dân. Tuổi khởi phát trong khoảng từ 30 – 40
tuổi [1], [2]. Nguyên nhân tử vong thường do tổn thương nội tạng như tăng áp
động mạch phổi, xơ hóa phổi, bệnh tim...
XCBHT được chia làm 2 thể chính:
- XCBHT khu trú (Localized cutaneous systemic sclerosis - lcSSc): còn
gọi là hội chứng CREST (Calcinosis Raynaud Esophalageal Sclero-dactylic
Telangiectasis) gồm các biểu hiện calci hóa đầu chi, hội chứng Raynaud, tổn
thương thực quản, xơ cứng đầu chi và giãn mạch. Thương tổn da giới hạn ở
vùng đầu chi, mặt, ngực mà không có ở gốc chi, thân mình, tiến triển chậm [19]
- XCBHT lan tỏa (Diffuse cutaneous systemic sclerosis – dcSSc): xơ cứng
vùng gốc chi, thân và mặt. XCBHT lan tỏa tiến triển nhanh gây tổn thương
nội tạng, rối loạn chức năng nhiều, tỉ lệ tử vong cao.
1.2.3.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán
Tiêu chuẩn chẩn đoán XCBHT theo Hội thấp khớp học Mỹ (ACR) 1980:
- Tiêu chuẩn chính: XCB hướng tâm, đối xứng, da dầy, căng cứng.
- Tiêu chuẩn phụ:
+ Xơ cứng da đầu chi.
+ Sẹo lõm hoặc loét ở ngón tay.
+ Xơ phổi vùng đáy 2 bên: Trên phim X quang thấy mờ hình dải hoặc nốt


22


23

- Triệu chứng da:
1. Ban tím sẫm quanh hốc mắt (helitrope rash)
2. Sẩn Gottron: ban xuất huyết sừng hóa, mảng đỏ hoặc tím ở mặt duỗi của
ngón tay
3. Ban đỏ ở mặt duỗi các khớp ngoại vi lớn (khuỷu, gối)
- Triệu chứng về cơ và ngoài cơ
1.Yếu cơ gốc chi: chi trên, chi dưới, thân mình.
2.Tăng creatinin kinase hoặc aldolase huyết thanh.
3. Đau cơ khi bóp hoặc đau tự nhiên.
4. Thay đổi trên điện cơ (đơn vị vận động đa pha ngắn có điện thế rung tự nhiên).
5. Xét nghiệm kháng thể kháng Jo-1 dương tính.
6. Viêm khớp không có phá hủy khớp.
7. Dấu hiệu viêm hệ thống: sốt, C reaction protein (CRP) tăng, máu lắng
>20mm/h.
8. Sinh thiết cơ có tình trạng viêm cơ vân, thoái hóa sợi cơ.
Chẩn đoán xác định VBC khi có ít nhất 1/3 tiêu chuẩn về da và 4/8 tiêu
chuẩn về cơ và ngoài cơ.
1.2.4.2. Một số tự kháng thể trong bệnh VBC
- Kháng thể Mi-2 (Anti-Mi-2)
Anti-Mi-2 kháng lại enzyme tháo xoắn chuỗi DNA, có độ đặc hiệu cao,
phát hiện được ở 25% bệnh nhân VBC [2]. Thường xuất hiện ở bệnh nhân
VBC có biểu hiện cấp tính, tiên lượng tốt.
- Kháng thể Jo-1(Anti-Jo-1)
Anti-Jo-1 (antihistidyl transfer RNA synthetase) kháng lại enzyme tổng hợp
Histidyl-tRNA, một enzyme của bào tương. Anti-Jo-1 gặp khoảng 20-30% bệnh
nhân VBC thường kết hợp viêm phổi kẽ, hiện tương Raynaud, viêm khớp [2].
- Kháng thể 155/140 (Tif 1γ)


- Bệnh nhân chưa đủ tiêu chuẩn chẩn đoán xác định SLE, XCBHT, VBC
theo các tiêu chuẩn trên
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Mô tả cắt ngang hồi cứu