BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
*****************************
PHẠM THỊ CHÚC
KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP
TRÊN TẾ BÀO HEP 2 TẠI BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ Y KHOA
KHÓA 2009-2015
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Thạc sĩ. Bác sĩ VŨ NGUYỆT MINH
Hà nội 2015
. LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn tới:
Th.s Vũ Nguyệt Minh, người thầy đã trực tiếp dìu dắt, tận tình hướng
dẫn và cho tôi những kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi vượt qua những khó
khăn, trở ngại để tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn đảng ủy, ban giám hiệu, phòng đào tạo
trường Đại học Y Hà Nội, bộ môn Da liễu trường Đại học Y Hà Nội, các cán
bộ nhân viên bệnh viện Da liễu trung ương, đặc biệt khoa chuyên đề đã tạo
mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến Bố Mẹ, gia đình, bạn bè và những
người thân đã động viên giúp đỡ tôi tiếp thêm cho tôi sức mạnh để vượt qua
mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập cũng như viết bản khóa luận này!
****************************************
Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2015
PHẠM THỊ CHÚC
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi:

Bảng 3.7: Tỷ lệ các dạng lắng đọng và mức độ lắng đọng huỳnh quang trên
TB hep 2 theo số lượng tiêu chuẩn chẩn đoán XCB(N=77)
Bảng 3.8: Tỷ lệ các dạng lắng đọng và mức độ lắng đọng huỳnh quang trên
TB hep 2 theo số lượng tiêu chuẩn chẩn đoán VBC-VĐC (N=13)
Biểu đồ 3.: Phân bố theo giới tính
Biểu đồ 3.2: Phân bố dạng lắng đọng huỳnh quang của bệnh XCB
Biểu đồ 3.3: Phân bố mức độ lắng đọng huỳnh quang của bệnh XCB
Biểu đồ 3.4 : Phân bố dạng lắng đọng huỳnh quang của bệnh VBC-VĐC
Biểu đồ 3.5: Phân bố mức độ lắng đọng huỳnh quang của bệnh VBC-VĐC

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh mô liên kết tự miễn (autoimmune connective tissue diseases -
ACTDs) hay còn gọi là các bệnh tự miễn hệ thống là một trạng thái bệnh lý do
có sự kết hợp của tự kháng thể với tự kháng nguyên gây ra viêm và dẫn đến
tổn thương thực thể và chức năng tại tế bào, mô hay cơ quan [1]. Đó là bệnh
nguy hiểm, gây tổn thương đa cơ quan và đe dọa tính mạng người bệnh.
Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh còn chưa rõ ràng. Ngày nay, với sự tiến bộ
của khoa học kỹ thuật, người ta đã phát hiện được hơn 100 loại tự kháng thể
kháng lại nhiều thành phần của tế bào: kháng thể kháng nhân, kháng thể
kháng tương bào, kháng ty, lạp thể, kháng màng tế bào [2] Trong đó kháng
thể kháng nhân (ANA: Antinuclear antibodies) là những globulin miễn dịch
đặc hiệu đối với các cấu trúc khác nhau của nhân tế bào: axit nhân, histon,
ribonucleoprotein chiếm tỷ lệ cao. ANA có tỉ lệ dương tính cao ở một số bệnh
mô liên kết tự miễn như bệnh lupus ban đỏ hệ thống, xơ cứng bì, viêm bì cơ,
bệnh mô liên kết phối hợp, hội chứng Sjögren. Những tự kháng thể này được
coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán các bệnh mô liên kết tự miễn. Hiện
nay tỉ lệ mắc bệnh ngày càng tăng vì vậy việc ứng dụng những thành tựu về kĩ
thuật miễn dịch để phát hiện các tự kháng thể là một yêu cầu cấp thiết để chẩn
đoán sớm và điều trị kịp thời.
Với nền y học tiến bộ hiện nay có rất nhiều kĩ thuật miễn dịch giúp

Lupus ban đỏ hệ thống (Systemic lupus erythematosus - SLE) là một
bệnh tự miễn có tổn thương đa cơ quan được đặc trưng bởi sự có mặt của
kháng thể kháng nhân và nhiều tự kháng thể khác. Cơ chế bệnh sinh của SLE
rất phức tạp, bệnh là hậu quả của sự tương tác giữa yếu tố di truyền (gen
bệnh), nội tiết và yếu tố môi trường (thuốc, tia cực tím, virus ) dẫn đến đáp
ứng miễn dịch bất thường sản xuất không ngừng ra các tự kháng thể bệnh
lý,các tự kháng thể này kết hợp với kháng nguyên tạo phức hợp miễn dịch
9
gắn vào các mô đích gây tổn thương [4], [5]. Ở Mỹ, theo thống kê hàng năm
của CDC (Centers for disease control) có khoảng 1.8-7.6 trường hợp mắc mới
trên 100.000 dân, tỉ lệ mắc bệnh khoảng 52/100.000 dân. Bệnh gặp chủ yếu ở
nữ giới, tỷ lệ nữ/nam là 9/1[1], [2].
Biểu hiện lâm sàng của SLE gồm: [1], [4]
- Tổn thương ở da và niêm mạc (70% các trường hợp)
- Tổn thương cơ xương khớp gặp 90-100%
- Các tổn thương nội tạng như viêm cầu thận, viêm màng phổi, tim mạch, tổn
thương thần kinh trung ương, thiếu máu, giảm bạch cầu, loét miệng
Tiêu chuẩn chẩn đoán SLE của hội Khớp học của Mỹ năm 1997 gồm:[3][4]
1. Nổi hồng ban có dạng hình cánh bướm ở hai bên má, phía dưới 2 mắt, sang
thương có thể phẳng hoặc gồ lên mặt da.
2. Ban hình đĩa: những mảng màu đỏ, nổi gồ lên kèm theo nổi vảy ở phần da
phủ phía trên.
3. Nhạy cảm với ánh sáng, nổi ban do phản ứng với ánh sáng mặt trời.
4. Loét ở miệng, mũi hầu: thường ít đau
5. Viêm khớp, thường không gây biến dạng khớp, có thể sưng khớp và ấn đau.
6. Viêm thanh mạc là tình trạng viêm của các túi hoặc màng bao bọc phổi, tim
và lát khoang ổ bụng.
7. Bệnh tổn thương cầu thận: Protein niệu >500mg/24h hoặc tế bào niệu.
8. Rối loạn về thần kinh, biểu hiện bằng cơn động kinh hoặc rối loạn tâm thần
không do các nguyên nhân khác

cao.
Biểu hiện lâm sàng:
- Tổn thương da: gặp ở 100% các trường hợp [1]: vị trí tổn thương hay
gặp ở mặt, tay, chân, da cứng lại, giảm hoặc mất tính đàn hồi. Tiến triển tổn
thương thường qua 3 giai đoạn: phù nề, cứng hoặc xơ hóa da và cuối cùng là
teo da.
- Hội chứng Raynaud: gặp 85-100% các trường hợp và thường xuất hiện
sớm và nặng [1]. Biều hiện: bệnh nhân thấy tê, giảm cảm giác đầu chi, chuột
rút, rối loạn vận mạch. Điển hình hội chứng Raynaud có các giai đoạn:
+ Co mạch: bàn tay trắng bệch
+ Giãn mạch gây ứ huyết: tím, đau nhức
+ Trở lại bình thường
+ Nặng: tắc mạch, hoại tử, loét đầu chi.
- Tổn thương hệ vận động: đau mỏi cơ, teo cơ, giảm cơ lực gốc chi,
viêm cơ, tổn thương khớp
- Tổn thương hệ tiêu hóa: thực quản biểu hiện sớm khó nuốt, ứ nước
bọt, xo cứng, giảm co bóp, dạ dày biểu hiện kém nhu động, hẹp môn vị, đau
bụng, chướng bụng
- Tổn thương phổi: gặp 25% bao gồm: xơ phổi kẽ lan tỏa dẫn đến rối
loạn thông khí, tăng áp lực động mạch phổi Tổn thương tim: xơ cơ im, suy
tim phải tổn thương thận, tổn thương mắt
Xơ cứng bì có biểu hiện lâm sàng đa dạng, gây tổn thương nhiều
cơ quan đe dọa tính mạng người bệnh vì vậy việc chẩn đoán sớm vô
cùng quan trọng giúp ngăn chặn tốc độ phát triển, phục hồi chức năng
cho người bệnh và kéo dài tuổi thọ.
Tiêu chuẩn chẩn XCBHT theo Hội thấp khớp học Mỹ (ACR) 1980.
12
- Tiêu chuẩn chính: XCB hướng tâm, đối xứng, da dầy, căng cứng.
- Tiêu chuẩn phụ:
+ Xơ cứng da đầu chi.

1.Yếu cơ gốc chi: chi trên, chi dưới, thân mình.
2.Tăng creatinin kinase (CK) hoặc aldolase huyết thanh.
3. Đau cơ khi cầm hoặc đau tự nhiên.
4. Thay đổi trên điện cơ (đơn vị vận động đa pha ngắn có điện thế rung
tự nhiên).
5. Xét nghiệm kháng thể kháng Jo-1 dương tính.
6. Viêm khớp không có phá hủy khớp.
7. Dấu hiệu viêm hệ thống: sốt, C reaction protein (CRP) tăng, máu
lắng >20mm/h.
8.Mô bệnh học có tình trạng viêm cơ vân, thoái hóa sợi cơ.
14
Chẩn đoán xác định viêm bì cơ khi có ít nhất 1/3 tiêu chuẩn về da và 4/8
tiêu chuẩn về cơ và ngoài cơ. Chẩn đoán viêm đa cơ khi có ít nhất 4/8 triệu
chứng về cơ và ngoài cơ
1.2 Các tự kháng thể trong bệnh mô liên kết tự miễn
Các tự kháng thể trong bệnh mô liên kết tự miễn là các tự kháng thể kháng
lại nhiều thành phần tế bào: kháng thể kháng nhân, kháng thể kháng ty thể,
lạp thể, kháng thể kháng màng tế bào, kháng thể kháng tương bào
1.2.1 Kháng thể kháng nhân (ANA- antinuclear antibody): tỉ lệ dương
tính cao, gặp 94% BN SLE và ANA được coi là một tiêu chuẩn trong số 11
tiêu chuẩn để chẩn đoán bệnh lupus ban đỏ hệ thống, gặp ở 78% ở bệnh nhân
xơ cứng bì, trong viêm da cơ là 19%. Tuy nhiên độ đặc hiệu không cao có thể
gặp trong các bệnh tự miễn khác, bệnh lý nhiễm trùng mãn tính và gặp cả ở
người bình thường đặc biệt là người già.[7]
1.2.2 Kháng thể kháng DNA [1], [7]
Gồm:
Kháng thể kháng DNA chuỗi kép (anti-ds DNA- antibodies to double-
stranded DNA): tỉ lệ dương tính cao 60-70%, độ đặc hiệu cao rất có ý nghĩa
trong chẩn đoán SLE
Kháng thể kháng DNA chuỗi đơn (anti-ss DNA- antibodies to single-

Gặp ở 40% bệnh nhân. Hội chứng kháng phospholipid đặc trưng bởi
sẩy thai nhiều lần, tiền sản giật, huyết khối tĩnh mạch, động mạch trung tâm
và ngoại vi.
1.2.7 Kháng thể Topoisomerase I (Scl - 70/Topol)
Kháng thể kháng đoạn trọng lượng phân tử 70 kilodalton của enzym DNA
topoisomerase I, enzyme có vai trò tháo xoắn chuỗi DNA xoắn kép trong quá
trình phiên mã. Gặp ở 25 - 40% bệnh nhân XCB, tổn thương da lan toả
1.2.8 Kháng thể kháng Centromere
Kháng thể kháng đoạn trung tâm của chromosome, gặp ở 60% bệnh
nhân xơ cứng bì hệ thống thể giới hạn, đặc hiệu cho thể này (98%). Chúng
cũng có 6% ở bệnh nhân lupus (SLE), 17% ở bệnh nhân xơ gan đường mật
tiên phát.
1.2.9 Kháng thể Jo-1
Kháng Histidyl tRNA synthetase, gặp khoảng 20-30% bệnh nhân viêm
bì cơ liên quan đến hội chứng antisynthetase (antisynthetase syndrome) với các
triệu chứng viêm cơ, bệnh phổi kẽ, viêm đa khớp mãn tính.
1.3 Các kĩ thuật xét nghiệm phát hiện tự kháng thể
1.3.1 Miễn dịch kết tủa khuếch tán kép trên thạch (ouchterlony)
Kháng nguyên và kháng thể được đặt vào những lỗ đục ở trong thạch
agarose. Phức hợp này sẽ khuếch tán và tạo nên những đường kết tủa trên bề
mặt thạch, sau đó dùng huyết thanh chuẩn hoặc kháng nguyên mẫu để so
17
sánh. Kỹ thuật này được đánh giá có độ nhạy, độ đặc hiệu thấp hơn các kỹ
thuật ELISA, miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, miễn dịch đánh dấu
1.3.2 Miễn dịch gắn men (ELISA)
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay) dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong
đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp
(thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ
chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng

xác định dễ dàng các kháng thể mà trên mảnh cắt tổ chức không cho phép.
Tế bào HEp-2 được sử dụng như một cơ chất nền trong phương pháp này
để phát hiện các loại kháng thể kháng nhân, kháng hạt nhân, kháng các thành
phần của bào tương (AND, histon, nucleosom, ribosom, enzyme…).
Cách tiến hành:
- Lam kính đã gắn sẵn tế bào hep-2
- Huyết thanh bệnh nhân có chứa kháng thể được nhỏ vào từng giếng. Ở
đây có hiện tượng liên kết kháng thể người bệnh với kháng nguyên có
mặt trên tế bào hep-2.
19
- Sau khi rửa huyết thanh người bệnh, các giếng được ủ với kháng thể
kháng IgG có gắn FITC. Các kháng thể kháng IgG có gắn FITC sẽ kết
hợp với kháng thể của người bệnh đã gắn vào tế bào hep-2.
- Sau khi rửa những kháng thể không kết hợp, lam kính sẽ được đọc dưới
kính hiển vi huỳnh quang( bước sóng 490-630nm).
- Gián tiếp thông qua kháng thể IgG có gắn FITC, dưới kính hiển vi
huỳnh quang sẽ phát hiện được các kháng thể người bệnh gắn trên tế
bào hep-2. Tuỳ vị trí gắn và mức độ huỳnh quang, kết quả sẽ đưa ra
kiểu lắng đọng và đậm độ huỳnh quang.
Nhận định kết quả:
- Âm tính: nhân không nhuộm màu sáng xanh, toàn bộ tế bào màu đỏ
nhân sẫm hơn.
- Dương tính: trên nền tế bào đỏ, nhân tế bào to tròn nhuộm màu sáng
xanh. test được nhận định dương tính khi hiệu giá huyết thanh pha loãng là
1/40 trở lên.
• Âm tính
- nhân không nhuộm màu
sáng xanh, toàn bộ tế bào
màu đỏ, nhân màu đỏ
sẫm hơn.

không bắt.
– Số lượng đốm bắt
màu: 40 – 60 hạt.
– Tế bào phân chia: các
đốm xếp theo đường
ngang.
• Thoi suốt (Spindle):
Hình 1.1: Một số dạng lắng đọng huỳnh quang thường gặp
22
Ý nghĩa kết quả:
Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2 cung cấp hai thông tin:
nồng độ và kiểu lắng đọng huỳnh quang. Trong đó:
Nồng độ quyết định ngưỡng dương tính, gợi ý loại kháng thể (vì có những
kháng thể dương tính ở những nồng độ pha loãng rất lớn và ngược lại, có
những kháng thể dương tính ở nồng độ nhỏ hơn).
Kiểu lắng đọng huỳnh quang và vị trí xuất hiện huỳnh quang trong tế bào
giúp định hướng một cách trực tiếp tình trạng bệnh học, có thể gợi ý loại tự
kháng thể có khả năng nhất trong huyết thanh của bệnh nhân.
Có nhiều yếu tố làm ảnh hưởng đến kết quả của kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang gián tiếp như: bản chất của chất nền, bản chất huyết thanh, sự chọn lựa
dung dịch đệm pha loãng và sự kết hợp huỳnh quang, điều kiện ủ và rửa, kính
hiển vi huỳnh quang, huyết thanh chứng và phụ thuộc chủ quan người đọc.
23
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Bệnh nhân nghiên cứu
Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân
• Lựa chọn bệnh nhân phục vụ mục tiêu 1
- Đối tượng: tất cả bệnh nhân được chỉ định làm xét nghiệm miễn

• Các số liệu định lượng được biểu hiện dưới dạng trung bình ±
SD
• Các số liệu định tính được biểu hiện dưới dạng tỷ lệ %.
2.2.2 Khống chế sai số
- Các công cụ thu thập thông tin, mẫu bệnh án được thiết kế thích hợp
theo mục tiêu nghiên cứu.
- Quá trình tiến hành kỹ thuật được thực hiện theo đúng quy trình và
việc nhận định kết quả được thực hiện bởi các bác sĩ chuyên khoa da liễu
- Người nghiên cứu sẽ tiến hành thu thập thông tin và thống kê lại các
kết quả xét nghiệm đã được nhận định bởi các bác sĩ giàu kinh nghiệm
tại bệnh viện da liễu trung ương.
25