ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
------------------------

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG

Tên đề tài:
T

PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG
HỢP GAMMA-POLYGLUTAMIC ACID (γ-PGA) TỪ
ĐỒ UỐNG BOZA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2010 - 2014

Thái Nguyên, 2014




Khoá học

: 2010 - 2014

Giảng viên hướng dẫn

: 1. ThS. Bùi Tuấn Hà
2. TS. Dương Văn Cường
Khoa CNSH - CNTP
trường ĐHNL Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014


LỜI CẢM ƠN
Thực tập là quá trình học tập để cho mỗi sinh viên vận dụng những
kiến thức, lý luận đã được học trên ghế nhà trường vào thực tiễn, tạo cho sinh
viên làm quen những phương pháp làm việc, kỹ năng công tác. Đây là giai
đoạn không thể thiếu được đối với mỗi sinh viên trong quá trình học tập.
Trong suốt quá trình thực tập tại phòng Công Nghệ Vi Sinh, khoa Công
nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên, Tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, thầy cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình.
Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Tuấn Hà, giảng viên
khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên lời cảm ơn sâu sắc nhất. Thầy đã tạo điều kiện, trực tiếp hướng
dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn chân thành tới TS. Dương Văn Cường, các bạn trong
nhóm nghiên cứu và cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, khoa Công


Et alii

kGy

Kilo Gray

kDa

Kilo Dalton

LB

Lauria Broth

NPs

Nanoparticles

Nguyên tố nhỏ

OD

Optical Density

Độ hấp phụ ánh sáng

ORF

Open Reading Fame


MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................. 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
1.3. Yêu cầu ....................................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................... 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN.................................................................................. 3
2.1. Gamma-Polyglutamic acid ......................................................................... 3
2.1.1. Công thức phân tử ................................................................................... 3
2.1.2. Tính chất vật lý........................................................................................ 4
2.1.3. Ứng dụng của gamma-polyglutamic acid ............................................... 5
2.1.3.1. Ứng dụng trong y học .......................................................................... 5
2.1.3.2. Ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm...................................... 7
2.1.3.3.Ứng dụng trong công nghệ mỹ phẩm ................................................... 8
2.1.3.4. Ứng dụng trong xử lí môi trường ......................................................... 8
2.1.3.5. Ứng dụng trong ngành chăn nuôi......................................................... 9
2.1.3.6. Trong lĩnh vực nông nghiệp ............................................................... 10
2.1.4. Phương pháp kết tủa và tinh sạch acid gamma-polyglutamic .............. 11
2.2. Vi khuẩn tổng hợp gamma-polyglutamic acid ......................................... 13
2.2.1. Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Bacillus ............................................ 13
2.2.2. Tổ chức di truyền của vi khuẩn Bacillus tổng hợp gamma-polyglutamic
acid .................................................................................................................. 14
2.2.3. Quá trình tổng hợp γ-PGA trong vi khuẩn ............................................ 15
2.3. Boza - nguồn phân lập vi khuẩn Bacillus ................................................ 17
2.4. Tình hình nghiên cứu gamma-polyglutamic acid trong nước và ngoài nước........ 19



3.5.4.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng
tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn ......................................................................... 27
3.5.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng
tổng hợp gamma polyglutamic acid ................................................................ 27
3.5.5. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật .............................................. 28
3.5.6. Phương pháp nhân giống vi khuẩn........................................................ 28
3.6. Phương pháp sử lý số liệu ........................................................................ 28
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 29
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp gamma
polyglutamic acid từ mẫu đồ uống lên men Boza........................................... 29
4.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh tổng hợp gammma
polyglutamic acid từ mẫu đồ uống lên men Boza........................................... 29
4.2.1. Kết quả nghiên cứu hình thái của vi khuẩn BL4 .................................. 29
4.2.2. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh hóa của vi khuẩn BL4 ..................... 30
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình tổng hợp
gamma polyglutamic acid ............................................................................... 31
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình sinh
tổng hợp gamma polyglutamic acid của chủng BL4 ...................................... 31
3.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường tới khả năng tổng hợp
gamma polyglutamic acid của vi khuẩn BL4.................................................. 33
3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp gamma polyglutamic
acid của vi khuẩn BL4..................................................................................... 34
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 36
5.1. Kết luận .................................................................................................... 36
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 37
Tiếng việt......................................................................................................... 37
Tiếng anh ......................................................................................................... 37



Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh gamma polyglutamic
của vi khuẩn BL4 ............................................................................................ 34
Hình 4.4: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự tổng hợp gamma
polyglutamic acid của vi khuẩn BL4 .............................................................. 35


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Acid gamma polyglutamic (γ-PGA) là một polyme tự nhiên có các tính
chất sinh hóa học quan trọng như có khả năng hòa tan trong nước, phân hủy
sinh học, không độc và ăn được. γ-PGA được ứng dụng rộng rãi trong ngành
công nghệ thực phẩm, dược phẩm sinh học, y tế, mỹ phẩm, xử lý môi trường
và các lĩnh vực khác (Shih et al. 2001).
γ-PGA được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn (tất cả vi khuẩn gram
dương), trong đó chủ yếu là chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ sản
phẩm lên men truyền thống như: vi khuẩn Bacillus subtilis (Bacillus subtilis
Natto) được phân lập từ natto ở Nhật Bản (Shih et al. 2001), Thua-nao từ Thái
Lan, chungkookjang từ Hàn Quốc.
Bên cạnh các sản phẩm lên men kể trên, một loại sản phẩm lên men
truyền thống đang được quan tâm tới khả năng có thể phân lập được các
chủng Bacillus có hoạt lực sinh γ-PGA cao đó là Boza.
Boza được biết đến là một loại đồ uống lên men truyền thống được làm
từ lúa mì hoặc kê, có độ nhớt và nồng độ cồn thấp, thường là từ 0,5% – 1 %,
có vị ngọt và chua, đây là một sản phẩm lành tính và giàu dinh dưỡng. Trong
boza có chứa hỗn hợp vi khuẩn lactic và nấm men có lợi cho sức khỏe như:
Lactobacillus brevis subsp. lactis, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis,
Lactobacillus

- Đánh giá được ảnh hưởng của pH, thời gian, môi trường nuôi cấy tới
khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh γ-PGA từ Boza, đánh
giá được các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Giúp sinh viên rèn luyện thành thạo các kỹ thuật vi sinh như: phân
lập, nghiên cứu hình thái và động thái sinh tổng hợp γ-PGA của vi sinh vật.
- Kết quả phân lập và nghiên cứu điều kiện lên men có thể ứng dụng
trong sản xuất γ-PGA sử dụng trong thực tế.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN

2.1. Gamma-Polyglutamic acid
2.1.1. Công thức phân tử
Acid gamma-polyglutamic (γ-PGA) còn được gọi là gamma
polyglutamate. γ-PGA được tạo thành bởi đồng phân D-glutamic, Lglutamic hoặc cả hai đồng phân nối với nhau bởi liên kết amin giữa nhóm αamino và γ-carboxyl tạo thành liên kết γ-peptide (Ho et al. 2006).

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của gamma-polyglutamic acid
Tỷ lệ L-D-glutamate phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài, điều kiện nuôi
cấy. γ-PGA của chủng Bacillus subtilis (Natto) có tỷ lệ 50-80% là dạng Dglutamate và 20-50% là L-glutamate (Kubota et al. 1993). Nhiều yếu tố cũng
ảnh hưởng đến mức độ trùng hợp của phân tử γ-PGA. Nồng độ của Mn2+ có
thể ảnh hưởng đến cấu hình của axit glutamic trong γ-PGA được tổng hợp bởi
Bacillus subtilis. Khi môi trường có nồng độ Mn2+ cao thì trong γ-PGA có
đồng phân dạng D-glutamate >80%, môi trường có nồng độ Mn2+ thấp thì γPGA có đồng phân dạng D-glutamate 40% (Thorne et al. 1958).

- Hòa tan trong nước
- Không độc và có thể ăn được
- Có khả năng dẫn diện
- Nhận biết γ-PGA bằng xanh methylene

Tính chất hóa học

- không bị enzyme protease phân hủy
- Có phản ứng được với kim loại để tạo muối


5

2.1.3. Ứng dụng của gamma-polyglutamic acid
Ngày nay con người có nhu cầu hướng tới sử dụng các hợp chất có
nguồn gốc từ tự nhiên do nó có ưu điểm là an toàn với sức khỏe và thân thiện
với môi trường và γ-PGA là một trong số đó. γ-PGA đã được nghiên cứu
nhắm tối ưu hóa các phương pháp sản xuất với quy trình ít tốn kém, nâng cao
năng suất, hạ giá thành sản phẩm và sử dụng nguồn cơ chất đơn giản, dễ kiếm
để có thể sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm,
y học, xử lý nước thải, sản phẩm vệ sinh, nông nghiệp, chăn nuôi và các lĩnh
vực khác.
2.1.3.1. Ứng dụng trong y học
γ-PGA được sử dụng trong liệu pháp gen, thuốc điều trị ung thư và các
sản phẩm da nhân tạo để chữa bỏng, γ-PGA còn được dùng tạo ra các màng
tổng hợp để chống lại sự bám hút chặt giữa tế bào bình thường với lớp mô bị
tổn thương do tai nạn hay quá trình phẫu thuật...( Furuta et al. 2000).
a) Chất vận chuyển thuốc
γ-PGA được quan tâm về khả năng vận chuyển thuốc do có tính tương
thích sinh học và phân hủy sinh học. Trong chuỗi peptide của γ-PGA có nhóm

Dekie và cộng sự năm 2000 đã chỉ ra rằng liên kết giữa DNA và γ-PGA
tương đối ổn định đối với albumin huyết thanh. γ-PGA dễ dàng tạo ra các liên
kết với DNA, kết quả là điện tích bề mặt và kích thước của DNA giảm như
vậy có thể bảo vệ DNA không bị phân hủy bởi enzyme Dnase. γ-PGA mang
gen chuyển giúp cho DNA không bị phân hủy và tăng hiệu quả chuyển gene
(Dekie et al. 2000).
d) Chất phụ tá vaccine
Năm 2006, Sung và cộng sự đã đánh giá rằng γ-PGA như một chất phụ
tá cho vaccine, người ta đã phát hiện ra tổ hợp các thành phần gây miễn dịch
chứa γ-PGA cho 1 đáp ứng miễn dịch chống lại S. epiderrnidis,
staphylococcus và các loài liên quan. γ-PGA được chỉ ra có khả năng kích


7

thích cơ thể sinh kháng thể cao thậm trí khi được sử dụng với một kháng
nguyên có tính gây miễn dịch yếu. Các phân tử γ-PGA có khả năng phân hủy
sinh học là các thể mang vận chuyển rất tốt vaccine tới các khối u, chúng có
thể phát tán các protein kháng nguyên tới các tế bào trình diện kháng nguyên
(APCs) và đưa ra các đáp ứng miễn dịch hiệu lực dựa trên các kháng nguyên
đặc hiệu của tế bào lympho T. Kháng nguyên được chấp nhận bởi các tế bào
trình diện kháng nguyên còn được tăng cường bằng sự liên kết với các phân
tử polyme (Sung et al. 2006). Vaccine này có ưu điểm là khi tiêm dưới da
không tạo vết sưng tại vị trí tiêm như các vaccine thông thường khác (Uto et
al. 2009).
2.1.3.2. Ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm
Các nhà nghiên cứu đã chứng minh được γ-PGA có thể ứng dụng làm
chất bảo quản đông lạnh mà không gây ảnh hưởng tới sức khỏe do đặc tính
của γ-PGA là một polyme sinh học không gây độc cho người, γ- PGA còn sử
dụng làm chất ổn định mà không làm ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm

giữ ẩm và hình thành một hàng rào bảo vệ giúp tóc giữ được màu (Ben-Zur
and Goldman, 2007).
γ-PGA còn làm ức chế enzyme hyaluronidase giúp acid hyaluronic
không bị phân hủy, cùng với collagen là những thành phần thiết yếu của da. γPGA có khả năng hấp thụ nước nên nó có tác dụng làm ẩm da, sáng da, làm
đầy nếp nhăn và chống lão hóa, tăng độ đàn hồi da cao hơn collagen. γ-PGA
giúp tăng liên kết với vitamin C và vitamin E có trong thành phần của mỹ
phẩm do γ-PGA dễ dàng hòa tan trong nước và được ion hóa. Dung dịch ion
hóa γ-PGA được đưa vào sâu dưới da bằng công nghệ điện chuyển ion (Shih
et al. 2001).
2.1.3.4. Ứng dụng trong xử lí môi trường
Trong quá trình xử lí nước, các phương pháp loại bỏ và tách tạp chất
như kết tủa, tuyển nổi và lọc đều là quá trình tách chất rắn ra khỏi chất lỏng.


9

Trong phương pháp tách các kết tủa ra khỏi chất lỏng, thì các chất kết tủa
đóng vai trò quan trọng trong quá trình loại bỏ các tạp chất làm giảm thời gian
xử lí. Tuy nhiên các chất kết tủa thu được sau quá trình xử lí môi trường hiện
nay có chứa các thành phần độc hại gây ảnh hưởng tới sức khỏe như nhôm
sunfat là nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer, polyalumin clorua (PAC) và
một số polyme tổng hợp như polyacrylamid thì monome của nó có độc tố
mạnh gây ảnh hưởng tới sức khỏe và môi trường (Nguyễn Hương. 2005).
Vượt trội hơn những chất kết tủa thông thường trên, γ-PGA được coi là
một chất kết tủa sinh học vì nó có thể kết tủa thành từng mảng gồm các hợp
chất hữu cơ và vô cơ. γ-PGA có khả năng liên kết với kim loại (kim loại nặng,
chất phóng xạ) để tạo kết tủa điều đó thuận lợi cho việc cô lập các kim loại
không cho phát tán rộng ra môi trường hơn nữa γ-PGA còn có tính chất phân
hủy sinh học nên rất thân thiện với môi trường (Sung et al. 2005).
Do đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu γ-PGA như một chất kết tủa có


bình của củ

lượng của củ

Số cây khảo sát
Giống

trên cây bón
Không bón
Bón PGA

Không bón
Bón PGA

PGA

PGA

PGAvà không
bón PGA

KM140

8 cây

8 cây

362,5 g


pháp để kết tủa, tinh sạch và xác định γ-PGA theo hai con đường khác nhau là
phương pháp kết tủa γ-PGA bằng dung dịch ethanol (sơ đồ B) và bằng dung
dịch CuSO4 (sơ đồ A)


12

Lên men hang loạt

Ly Tâm (7800xg,15phút
,15oC)
Sinh khối
Tế bào-dịch

A

B

dd CuSO4
Trộn (RT:15phút)

Ethanol: 4oC

Ly tâm

Ly tâm

Dịch nổi
Phân tách


lượng protein là 48%, trong khi ở đồng sulfate chỉ có 3% protein điều đó chứng
tỏ rằng phương pháp kết tủa bằng đồng sulfate tinh sạch tốt hơn, không bị lẫn
tạp so với phương pháp kết tủa ethanol (Manocha and Margaritis 2010).
2.2. Vi khuẩn tổng hợp gamma-polyglutamic acid

2.2.1. Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Bacillus
Các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng tổng hợp γ-PGA là trực khuẩn
gram dương thuộc chủng Bacillus. Bacillus là những vi khuẩn gram dương.
Thuộc chi Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở
một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác
bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị
kí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động
bằng tiên mao. Chính nhờ khả năng sinh bào tử mà vi khuẩn Bacillus có khả
chống chịu được những điều kiện bất lợi như môi trường có nhiệt độ cao ở
suối nước nóng, nhiệt độ thấp ở bắc cực, những nơi có nồng độ muối cao như
ở mỏ muối hay ở nơi có nồng độ kháng sinh cao… (Tô Minh Châu, 2001).
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại
sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid
hữu cơ…Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và
butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ
để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là
loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30-45oC, nhưng cũng có nhiều
loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC (Rosovitz et al. 1998).


14

Đa số vi khuẩn Bacillus sinh trưởng ở pH7, một số phù hợp với pH= 910 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH=2–6 như Bacillus
acidocaldrius.
Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,

- Nếu PGA được sinh dưới dạng tự do thì gen tổng hợp γ-PGA là gen pgs.
2.2.3. Quá trình tổng hợp γ-PGA trong vi khuẩn
Năm 2007 Shi và cộng sự nghiên cứu và xác định các enzyme tham gia vào
con đường tổng hợp sinh hóa làm tăng hàm lượng γ-PGA (Shi et al. 2007).
Con đường để tổng hợp γ-PGA là từ L-glutamic acid, acid citric và
ammonium sulfate trong B.subtilis IFO 3335 (Kunioka et al., 1997), vì lượng
L-glutamic acid rất ít nên nó có thể được coi như là L-glutamic acid được
tổng hợp từ acid citric thông qua acid isocitric và acid 2-oxoglutaric trong chu
trình TCA. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng bước quan trọng trong quá tình là


16

tổng hợp 2-oxogluturate (α-ketoglutarate), tiền thân của acid L-glutamic được
tổng hợp qua đường phân và chu trình TCA (Shi et al., 2007).
Quá trình chuyển hóa từ acid 2-oxoglutaric đến L-axit glutamic được
tiến hành 2 cách:
- Khi không có L-glutamine hoặc có 1 lượng rất ít thì axit L- glutamic
được tổng hợp từ acid 2-oxoglutaric và ammonium sulfate xúc tác bởi
dehydrogena glutamate GD (Stadtman, 1966).
2-Oxoglutaric acid + NH3 + NAD(P)H + H+

L-glutamic acid +
GD

NAD(P)

- Khi có sự tham gia của L-glutamine, axit L- glutamic được tổng hợp
từ acid 2-oxoglutaric và L-glutamine dưới sự xúc tác bởi các enzyme
glutamine synthetase (GS) và Glutamate 2-oxoglutarate aminotransferase