ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

HOÀNG THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KERATINASE TRONG TẾ BÀO
ESCHERICHIACOLI VÀ BACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

HOÀNG THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KERATINASE TRONG TẾ BÀO
ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420122

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


1.5. Tình hình nghiên cứu ......................................... Error! Bookmark not defined.
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Error! Bookmark not defined.
1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Error! Bookmark not defined.

PHầN II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ERROR! BOOKMARK NOT
DEFINED.
2.1. Nguyên liệu ........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.2.Phương pháp ...................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn

Error! Bookmark not defined.

2.2.2.Phản ứng PCR Error! Bookmark not defined.
2.2.3. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn

Error! Bookmark not defined.

2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Error! Bookmark not defined.

3


2.2.5. Điện di protein trên gel Polyacrylamide (SDS-PAGE)
defined.
2.2.6. Thiết kế vector biểu hiện trong E. Coli

Error! Bookmark not


3.3.2. Kết quả phân tích trình tự gen

Error!

Error! Bookmark not defined.

3.3.3. Thiết kế vector biểu hiện trong E.coli

Error! Bookmark not defined.

3.3.4. Biểu hiện gen Ker trong E.coli BL21Error! Bookmark not defined.
3.4. Biểu hiện gen kerB trong tế bào B.subtilis 168MError! Bookmark not defined.
3.4.1 Tái tổ hợp gen KerB bằng phương pháp Megaprimer
defined.

Error! Bookmark not

4


3.4.2. Tách dòng tổ hợp gen keratinase bằng vector pTZ57RT trong E.coli TOP10F’
Error! Bookmark not defined.
3.4.3. Thiết kế vector biểu hiện trong Bacillus subtilis Error! Bookmark not defined.
3.4.4 Biểu hiện keratinase trong tế bào Bacillus subtilis 168M Error! Bookmark not
defined.
3.5. Xác định hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ E.coli BL21 và B.subtilis 168MError!
Bookmark not defined.

PHầN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
DEFINED.

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 08 năm 2014

6


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
B.subtilis

Bacillus subtilis

bp

Base pair(c

DNA

Deoxyribonucleic acid

E.coli Escherichia coli
EtBr

Ethidium Bromide

IPTGIsopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Ker

Keratinase

LB


Tên bảng

Số hiệu

Trang

Bảng 1

Trình tư các cặp mồi

21

Bảng 2

Thành phần một phản ứng PCR

23

Bảng 3

Thành phần gel cô 5% và gel tách 10% polyacrymide

25

Bảng 4

Thành phần phản ứng cắt với enzymeXhoI và BamHI

26

Hình 1

Một số sản phẩm chứa keratin

3

Hình 2

Cấu trúc xoắnα và gấp nếp β của keratin

4

Hình 3

Cấu tạo phân tử của keratinase

6

Hình 4

Vi khuẩn E.coli

9

Hình 5

Vi khuẩn B. subtilis

10



34

Hình 11

Điện di sản phẩm cắt bằng 2 enzyme giới hạn XhoI và
BamHI

36

Hình 12

Trình tự được đọc bằng mồi vector (T7 promoter và T7
terminator)

37

Hình 13

Cắt kiểm tra sản phẩm tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới
hạn

39

Hình 14

Điện di protein trên gel polyacrylamide –SDS ở nồng độ
12,5%

40


Hình 19

Điện di dịch enzyme thô trên gel SDS-PGE

47

10


MỞ ĐẦU
Ngày nay, ngành công nghệ sinh học chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế
nước ta. Trong đó, công nghệ DNA tái tổ hợp đang được chú trọng đầu tư và là công
nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời dựa
trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép
phân lập và khuếch đại một gen từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến
đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Việc nâng cao hoạt tính và khả
năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi.
Trong đó có tạo dòng và sản xuất keratinase.
Keratinase là enzyme có khả năng thủy phân các protein cứng, các cấu trúc phức
tạp trong lông, tóc, móng, sừng...Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase là thành viên
của nhóm protease serine. Đây là nhóm enzyme thương ma ̣i , có nhiều ứng dụng quan
trọng trong các ngành công nghiê ̣p, trong các quá trình công nghệ sinh học liên quan đến
chất thải có chứa keratin, các ngành công nghiệp gia cầm và công nghê ̣da.
Với sự bùng nổ của ngành công nghiệp gia cầm, hàng năm tồn đọng hàng tấn lông
gà trong tự nhiên, điều này gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường. Trong khi đó, lông gà
chiếm khoảng 90% là keratin, việc thủy phân keratin đem lại được những ứng dụng to
lớn, có thể làm phân bón , keo, tạo ra các axit amin hiếm như serin , cystein và prolin, đặc
biệt là tạo ra thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, nếu xử lý lông vũ bằng các loại hóa chất như
những phương pháp trước đây sẽ làm mất hàm lượng axit amin của thức ăn và rất tốn

Chọn dòng gen biểu hiện keratinase từ chủng vi khuẩn hoang dại

-

Thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli và B.subtilis.

-

Biểu hiện gen mã hóa keratinase trong E.coli và B.subtilis.

-

Đánh giá mức độ biểu hiện của chủng tái tổ hợp so với chủng hoang dại.

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Keratin
Keratin là một hợp chất sừng, thành phần chính trong da, tóc, lông, móng tay,
móng guốc, sừng, răng và len (Hình 1).Đây là protein có cấu trúc bền vững, khó hòa tan,
chứamột lượng lớn sulfua, các axitamin, đặc biệt là cystein (chiếm 24%), ngoài ra có các
axit amin khác như: glycin, alanin, serin và valin. Ngoài các liên kết hydro nội phân tử và
liên phân tử, keratin còn có hàm lượng lớn lưu huỳnh trong cystein. Chính các cystein có
thể tạo thành cầu disulfide.Những cầu nối này được tạo từ các nguyên tử lưu huỳnhliên
kết với nhau, do đó nó không dễ dàng hòa tan, không dễ dàng bị phân hủy bởi các
enzyme thông thường như: trypsin, pepsin, và papain… Tùy thuộc số lượng liên kết

12


cysteindisulfide chứa trong keratin, có thể chia thành 2 loại: keratin cứng được tìm thấy
trong móng guốc và keratin mềm tìm thấy trong mô linh hoạt như tóc và da (Hình 1).

thiết mà cơ thể không tự tổng hợp được,đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì và phát
triển cơ thể. Mặc dù rất khó phân hủy bởi những enzyme thông thường nhưng các chất
thải keratin có thể bị phân hủy bởi vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm do chúng tạo ra các
protease – keratinase.
Thủy phân keratin từ vi sinh vật đã được nghiên cứu từ năm 1959[28], tuy nhiên
cơ chế thủy phân từ vi khuẩn vẫn chưa được nghiên cứu nhiều.Việc giảm cầu nối disulfur
có thể có ảnh hưởng đáng kể đến sự phân hủy keratin[9],[40]Keratinase là enzyme, có
khả năng phân hủy cấu trúc protein keratin khó tan. Các keratinase tham gia thủy phân
các chất thải keratin từ lông vũ trong công nghiệp chăn nuôi gia cầm đã tạo ra các sản
phẩm có giá trị như thức ăn chăn nuôi, phân bón, các polymer và các axit amin hiếm như
serin, cystein và prolin.
1.2. Keratinase
Keratinasethuộcnhómcácprotease

kiềm

cókhả

năng

hoạt

động

mạnh

trênkeratinkhông hòa tan. Enzyme này đóng vai tròquan trọngtrongviệc thủy phân cấu

14


Bacillus được nghiên cứu nhiều nhất. Nhiều chủng B. licheniformis và B. subtilis được
mô tả có khả năng thủy phân keratin, những loài khác như B. pumilus và B. cereus cũng
có khả năng tổng hợp keratinase. Sinh tổng hợp keratinase cũng được nghiên cứu ở xạ
khuẩn, chủ yếu là từ các chi Streptomyces. Nhóm vi khuẩn này được phân lập từ các
vùng đất khác nhau, có khả năng thủy phân một loạt các chất chứa keratin như tóc, len và
lông.
Tính chất:
Keratinase thuỷ phân thành các axit amin:
Với tính chất thuỷ phân của keratinase, nó phá vỡ cầu nối disunfua của keratin làm
đứt liên kết của vòng xoắn. Như vậy, sau khi thuỷ phân hợp chất keratin trong lông vũ đã
được phân huỷ và chia nhỏ thành các axit amin và peptit ngắn. Khi đó protein keratin
mang đầy đủ các tính chất của protein tan như là: Tính hoà tan, kết tủa, điện ly lưỡng
tính, thuỷ phân và phản ứng màu đặc trưng. Keratinase chủ yếu tấn công vào các liên kết
disulfide (S-S), làm suy giảm các protein dạng sợi fibrin, elastin, collagen và sợi protein
khác.
pH và nhiệt độ:
Keratinase hoạt động được ở nhiệt độ từ 30oC - 80oC nhưng nhiệt độ tối ưu là: 50oC
và enzyme này được ổn định khi bảo quản ở -20oC[60]. Keratinase bền vững trong
khoảng pH từ 6,0 - 9,0 nhưng pH tối ưu là 7,5 [51].;

16


Chất kìm hãm:
Khi bổ sung đường sucrose và lactose làm ức chế sự tổng hợp keratinase[51]. Chất
nền có nồng độ và lượng cơ chất quá cao cũng sẽ làm ức chế sự tổng hợp keratinase[51].
Khi bổ sung các chất có chứa các ion kim loại nặng hoá trị hai như: Cu2+, Ag2+, Hg2+ và
Pb2+ thì cũng làm ức chế sự hoạt động của keratinase. Một số hoá chất khác cũng ức chế
phản ứng enzyme keratinase như: EDTA,…[30].
Chất hoạt hoá:

1.3.1. Chủng chủ E. coli
E. coli là vi khuẩn Gram âm, có thể hiếu khí hoặc kị khí, không sinh bào tử. Chúng
có bộ máy di truyền tương đối đơn giản, thành phần di truyền sơ cấp chỉ là một nhiễm sắc
thể đơn với khoảng 5 triệu cặp bazơ. Tế bào E. coli có khả năng sinh sản với tốc độ
nhanh trên môi trường nuôi cấy đơn giản, trung bình 20 phút chúng lại phân chia một lần.
Đặc biệt, E. coli có khả năng thu nhận rất nhiều yếu tố di truyền từ môi trường ngoài như
plasmid, phage... với khả năng sao chép DNA rất lớn. Chính vì vậy, chúng đã được cải
biến để sử dụng như một vật chủ hữu hiệu trong kỹ thuật tách dòng cùng như biểu hiện
gen, có rất nhiều chủng được sử dụng như: E. coli BL21(DE3), E. coli DH5...

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt

1.

2.

3.
4.

5.
6.

Nguyễn Văn Hiếu Phí Quyết Chiến, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Gia Hy (2010), "Tách
dòng và biểu hiện gen mã hóa protease serin của chủng Bacillus subtilis HT 24
trong Escherichia coli", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A), pp. 841-846.
Văn Thị Hạnh Trần Tích Cảnh (1993), "Tạo protein hoà tan từ kazetine lông vũ
phế liệu.", Khoa học và công nghệ., 2, pp. 1-6.", Khoa học và công nghệ, 2, pp. 16.
Nguyễn Đình Kim (2001), "Giáo trình vi sinh vật đất", pp.
Nguyễn Đình Quyến Trần Thị Lan Phương (2001), "Phân lập và tuyển chọn các


34.

35.

36.

37.

38.
39.

40.

41.

42.

43.

44.
45.
46.

application in wool fiber processing.", Word J Microbiol Biotechnol 29, pp. 825832.
Longeveld JPM, Wang, JJ, Shih, GC, Garssen, Shih (2003), " Enzymatic
degradation of prion protein from infected cattle and sheep brain stem. EMBO J.
(submitted)", EMBO J. (submitted)pp.
Matsui T., Yamada Y., Mitsuya H., Shigeri Y., Yoshida Y., Saito Y., Matsui H.,
Watanabe K. (2009), "Sustainable and practical degradation of intact chicken

characterization and application of keratinase from Streptomyces gulbargensis",
Bioresour Technol., 100(5), pp. 1868-71. Epub 2008 Nov 5.

21


47.

48.
49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

Szabo L., Benedek A., Szabo M. L., Barabas G. (2000), "Feather degradation with
a thermotolerant Streptomyces graminofaciens strain.", World J Microbiol
Biotechnol. , 16, pp. 252-255.
Tec. Mo Bi (2005), "Bacillus subtilis Expression Vectors. Product Information and
Instructions."
Tork SE, Shahein YE, El-Hakim AE, Abdel-Aty AM, MM. Aly (2013),
"Production and characterization of thermostable metallo-keratinase from newly