ĐẶT VẤN ĐỀ
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong
nhiều loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật
khác nhau. Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,53%[1].
Berberin được biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli,
điều trị bệnh lỵ. Thuốc được sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an
toàn, không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của vi khuẩn có ích ở
ruột.
Hiện nay trên thị trường có các dạng bào chế của Berberin như: thuốc
nhỏ mắt, viên nén, viên bao…. Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lượng nguyên liệu
làm thuốc cũng như thành phẩm là rất quan trọng.
Dược điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm
nguyên liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phương pháp đo quang phổ
hấp thụ tử ngoại UV- VIS, dược điển Trung Quốc (2005) định lượng Berberin
bằng HPLC. Để có cơ sở lựa chọn phương pháp định lượng Berberin thích
hợp, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “ So sánh hai phương pháp
định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc
(2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam
III” với những mục tiêu sau:
 Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng
HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005)
 Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng đo
quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III
 So sánh hai phương pháp định lượng trên để tìm phương pháp
thích hợp cho việc định lượng berberin trong các cơ sở kiểm tra
chất lượng thuốc trong nước.

1


PHẦN I. TỔNG QUAN

tan trong ether.[6]
1.5. Tác dụng dược lý:
- Berberin có tác dụng kháng vi trùng như: vi khuẩn ( shigella, tụ cầu
và liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh
trùng gây bệnh (kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đường ruột) [12], [17].
- Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E.coli, đặc biệt khi dùng sẽ
không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột,
khi dùng phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây
ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đường ruột [17].
- Berberin có tác dụng ức chế sự bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co
cơ, giảm cholesterol và trigycerid, chống tiểu đường, ức chế cơn nhịp nhanh
thất, giảm viêm cho người bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất
huyết, giảm tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ
bilirubin[17].
Chỉ định: [9],[12],[17]
- Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật
và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt.
- Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài( do nắng,
gió, lạnh, bụi, khói…) và điều trị bệnh đau mắt hột.
- Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas.

3


1.1.6. Chống chỉ định: [17]
- Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin
- Người dị ứng với berberin ( rất hiếm gặp)
1.1.7. Dạng thuốc và hàm lượng: [11]
- Dạng viên nén, viên bao, viên nang với hàm lượng 10 mg, hoặc 50100 mg/ viên
- Dạng thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích


P=

At
1
×
×a
As 1,006

a: khối lượng ( mg) kali dichromat.
 Phương pháp 2 [6]
Xác định hàm lượng berberin clorid trong viên nén.
* Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình và nghiền thành
bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 80 mg
berberin clorid, thêm 10ml nước để thấm đều bột viên, sau đó thêm khoảng
200ml nước sôi, khuấy kĩ 5 phút, để nguội rồi chuyển vào bình định mức
500ml, thêm nước tới vạch, lắc đều. Để lắng tự nhiên hoặc đem ly tâm. Lấy
chính xác 5ml dung dịch trong ở trên đem pha loãng với nước cất vừa đủ
100ml.
* Dung dịch chuẩn : pha tương tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu
berberin clorid.
* Mẫu trắng: nước cất.
* Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn trong cùng điều
kiện tại bước sóng cực đại 345 nm, cốc đo dầy 1 cm.
1.2.3. Phương pháp cân [5]
Áp dụng để định lượng viên nén berberin clorid, dựa trên khả năng tạo
tủa của berberin với acid picric.

5




- Thể tích tiêm: 10 µl.
- Nồng độ dung dịch thử và chuẩn: 0,1mg/ml và cách tiến hành pha 2 dung
dịch này giống nhau.
* Tiến hành:
Lần lượt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic
berberin trong các dung dịch thử , chuẩn và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính
lượng berberin trong chế phẩm.
* Cách tính: Lượng Wt (mg) của berberin clorid (C20H18ClNO4).
Wt = Ws x (At / As)
Ws = Lượng (mg) của berberin chuẩn, tính theo lượng khan.
 Phương pháp 2: [13]
* Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Cột được nhồi bởi các hạt silicagel đã được octadecylsilan hóa.
- Pha động: Hỗn hợp dung dịch đệm phosphate [ 0,05 mol/L kali
dihydrophosphat với 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chứa 0,2%
triethylamin, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric] và acetonitril
(60:40).
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút.
- Detector UV ở bước sóng 263 nm.
- Thể tích tiêm: 20 µl
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 32 µg/ml
* Tiến hành:
Lần lượt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic
berberin trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính
lượng berberin có trong chế phẩm.
 Phương pháp 3: [16]

7


8


Kết quả của quá trình sắc kí được detector phát hiện, phóng đại và ghi
thành sắc ký đồ( hình 1):

t R2
t R1

to
W 0.5-1

t' R1

W 0.5-2

W b1

W b2

t' R2

Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng
Trong đó :
to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách
tR (thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào
cột cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích.
tR’ (thời gian lưu thực ) =


R
0

−1

[8]
Nếu k' nhỏ thì tR

cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất.
Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau.
1.3.2.2 Độ chọn lọc α (selectivity - factor)

9


α=

k' = t
k' t

− t0

2

R2

1

− t0
R1

)

+ w1 / 2 A
1/ 2B

=

N  α − 1  k 'B 


4  α 1+k 'B 

[4], [8]

Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5
1.3.2.4. Hệ số bất đối AF
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức:
AF =

w

1 / 20

2a

[4], [8]

Trong đó:
W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép


Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H
được tính bằng công thức:

H=

L
N

1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8]
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao
gồm 6 bộ phận chính sau:
a/Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất
(0 - 400 bar)
a/ Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung
môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm ) và
đuổi khí hòa tan.
c/ Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu phân tích vào cột.
Có nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng
một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động.
Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng có thể được tiêm ngay sau khi lọc loại tạp
qua màng lọc 0,45 µm, còn mẫu rắn cần hòa tan trong 1 dung môi
thích hợp.
d/ Cột sắc ký lỏng HPLC
Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được với áp
suất cao đến vài trăm bar.
- Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha


1.3.5. Cách đánh giá pic[7]
* Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tương ứng với tổng
lượng chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích
phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ
học (sai số 1,3 %). Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi
đường nền và cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu
điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa,
trung bình và cao.
* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic
(khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích

12


pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ. Phương pháp chỉ áp dụng khi các
chỉ số k' là hằng định.
* Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc bị hẹp thì việc xác định chiều cao
pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic.
1.4.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS
1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6]
1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer
Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng ở và cường độ I o qua
dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là l. Khi đi qua dung
dịch ,một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) thì
đi qua dung dịch .
Mối quan hệ giữa I và Io được thể hiện bằng định luật Lambert-Beer.
I = Io × 10 -ồCl
Với ồ là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc
vào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bước sóng của ánh sáng

suốt (về mặt quang học) của dung dịch, được định nghĩa:
T=

I
I

t

= 10-ồCl

0

Thường T tính ra phần trăm (%). Một chất có T=1(hay100%), nghĩa là
hoàn toàn không có hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong
suốt.
b/ Độ hấp thụ (A-Absorbance):
Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa :
A = lg

1
= ồ.C.l
T

Đối với một chất xác định (có ồ xác định), thường đo trên một loại cốc
đo (có bề dày thông thường là l=1 cm), như vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với
nồng độ dung dịch:

14



d/ Hệ số hấp thụ phân tử (ồỡ):
Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol là độ hấp thụ của
dung dịch có nồng độ 1M/l, dùng cốc đo có bề dày1cm.
Cũng như

E

1cm
1%

, với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác

định (ở, dung môi, nhiệt độ,...) ồỡ là một hằng số.
Giữa

E

E

1cm
1%

1cm
1%

và ồỡ có mối liên hệ ồỡ = 10 × M

ở đây M là phân tử gam của chất tan.
1.4.2. Một số kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-VIS.
[2],[4],[8]

1%

Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sóng (ở) và
mật độ quang A bằng cách:

15


• Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D 2 (cho một vạch sáng có bước sóng xác
định).
• Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.
• Dùng một kính lọc Holmium (có các giá trị ởmax xác định cho trong tài
liệu )để kiểm tra lại máy.
• Dùng dung dịch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiết quang phổ pha thành
dung dịch có nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị ởmax và tìm
Amax.
1.4.2.2. Phương pháp so sánh
Đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử có nồng độ Cx (chưa biết) và của
dung dịch chuẩn có nồng độ Ac (đã biết).
Ta có:

A
A

x
c

=

C

2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất, thuốc thử:
2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu:
. Berberin clorid: Chất chuẩn hàm lượng 83,3% do Viện kiểm nghiệm
thuốc TW cung cấp
. Berberin clorid dạng nguyên liệu do bộ môn Hoá Dược cung cấp
. Palmatin: do viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp
2.1.1.2. Hoá chất, thuốc thử:
. Muối potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric
(H3PO4)
. Heptane sodium sulfonate, triethylamine
. Acetonitril dùng cho HPLC (Merk)
. Nước cất 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ môn Hóa vô cơ trường đại học
Dược Hà Nội) dùng cho máy HPLC
. Một vài hóa chất khác
2.1.1.3. Thiết bị:
+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX- Detector UV Diode
array- PDA 100
+ Cân phân tích AY 220 , Max = 220 g, độ chính xác 0,1 mg
+ Máy đo pH JENWAY của Anh
+ Máy cất nước 2 lần
+ Máy lắc siêu âm EBRO ARMATUREN của Đức
+ Máy lọc hút chân không Satorius
+ Bình định mức các loại: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml ...

17


+ Cốc có mỏ: các loại 100; 200; 500
+ Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh.
+ Bơm tiêm, lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 µm...


1 n
∑
n i =1 x i

∑ (x − x)
n

S=

- Độ lệch chuẩn:

18

i =1

i

n −1

2


- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): RSD% =

S
× 100
x

S


2
1
2

; trong đó S1 > S2

2

Ftn>Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác nhau có ý nghĩa
thống kê
 Ftn>Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác
nhau có ý nghĩa thống kê
 Ftn

1

19

2

2

2
2


 T


t αn


+ Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng
điều kiện tại bước sóng cực đại 421 nm với mẫu trắng là nước cất, cốc đo dày
1 cm.
* Cách tính kết quả :

*

Do có sẵn berberin, mặt khác dự định áp dụng phương pháp này cho cả berberin trong các dạng bào chế nên
chúng tôi thay kali dicromat bằng berberin chuẩn.

20


Theo phương pháp so sánh, hàm lượng phần trăm được tính theo công
thức :

C% =

A ×m
A ×m
t

c

c

t

× C


0,272
0,280
0,285
0,277
0,263

Theo kết quả ở bảng 1, ta có:

21

C%
86,50
85,76
86,06
86,42
86,48
83,30


• Giá trị trung bình:

X = 86,24%

• Độ lệch chuẩn

S = 0,324

:

• Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%):


2
0,0180

3
0,0202

22

4
0,0220

5
0,0240


(mg/ml)
A

0,215

0,239

0,262

0,286

0,315

Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào

Khối

Lượng hoạt

lượng cân chất có thực
(g)

Độ hấp

Lượng tìm

Phần trăm

thụ trung

lại trung

tìm lại

bình (A)

bình b (g)

(b/a.100%)

0,208
0,267
0,313

0,1322


Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 3,182Sa = 1,052 ± 0,060 hay 0,992
< a < 1,112
Khoảng tin cậy của y_intercept: b ± 3,182Sb = - 0,008 ± 0,009
hay - 0,017 < y_intercept < 0,001

Hình 7: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối
tương quan giữa lượng hoạt chất tìm lại và lượng hoạt chất có thực
Kết luận:
- Không có sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của
y_intercept chứa 0.
- Không có sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy độ dốc chứa 1.
- Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,17% nghĩa là nằm trong
khoảng từ 98% đến 102%.
Như vậy, phương pháp đưa ra là đúng trong khoảng khảo sát.
2.2.2.4. Tính đặc hiệu:
Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong
Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí
nghiệm không có chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tôi chỉ tiến hành xác định sự
ảnh hưởng của tạp chất Palmatin đối với phương pháp định lượng
Tiến hành:
+ Cân 0,200 g chất chuẩn berberin clorid và hòa tan trong 200 ml
nước bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml, thu

25