1

MỤC LỤC


2

DANH MỤC BẢNG


3

DANH MỤC CÁC HÌNH


4

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Tên đầy đủ
HIV
Human immunodeficiency
virus
Gag
Group-associated anti- gen
Env
envelop
Pol
polymerase
RT
Reverse transcriptase


A recombinant fusion is
encoded by a fusion gen of trx
and p24, produced in E. coli

PBS
SDS
TBS
TEMED

Phosphate buffered saline
Sodium dodecyl sulfat
Tris buffered saline
N,N,N’,N’- tetramethyl
ethylenediamine
Joint United Nations
Programme on HIV/AIDS
World Health Organization
United Nations Children's
Emergency Fund

UNAID
WHO
UNICEF

Tiếng việt
virus suy giảm miễn dịch ở người
Kháng nguyên liên kết nhóm
Vỏ
Enzym kéo dài

Tổ chức y tế thê giới
Quỹ Nhi đồng Liên Hiệp Quốc


5

AIDS
CD4
BSA
mARN

acquired immunodeficiency
syndrome
cluster of differentiation 4
Bovine serum albumin
Messenger ribonucleic acid

Hội chứng suy giảm miễn dịch
mắc phải
Tế bào CD4
Huyết thanh bò
ARN thông tin


6

ĐẶT VẤN ĐỀ
HIV là virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch ở người. Từ một căn
bệnh không được ai biết đến nay đã trở thành nỗi sợ hãi, ám ảnh của hàng
triệu người trên toàn cầu. Kể từ trường hợp nhiễm đầu tiên được ghi nhận vào

Đánh giá độ tương đồng trong khả năng phát hiện HIV giữa sinh phẩm ngưng
kết hạt latex và kit nhập ngoại trên huyết thanh bệnh nhân.


8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1

Tình hình nhiễm HIV ở Việt Nam và trên thế giới
1.1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới
Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới WHO, chương trình Phối hợp

của Liên Hợp Quốc về HIV/AIDS (UNAIDS) và Quỹ Nhi đồng Liên Hiệp
Quốc (Unicef) năm 2010, có khoảng 34 triệu người sống chung với HIV trên
toàn thế giới, trong đó có 3,4 triệu trẻ em dưới 15 tuổi. Chỉ tính riêng năm
2010 đã có thêm 2,7 triệu ca nhiễm mới HIV, 390 000 ca trong số đó là trẻ
em dưới 15 tuổi [10]. Sự phân bố tỷ lệ nhiễm mới HIV trên toàn thế giới
không đồng đều giữa các quốc gia và khu vực. Cụ thể, Sub-Saharan Châu Phi
là khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề nhất với 70% tổng số ca nhiễm mới trên
toàn thế giới, tiếp theo là khu vực Đông Nam Á (17%) và một số quốc gia
đang phát triển khác [10].
Mặc dù số trường hợp nhiễm HIV vẫn đang gia tăng nhưng tỷ lệ nhiễm
đang có xu hướng giảm trong những năm qua. Theo số liệu thống kê tại 39
quốc gia từ năm 2001 đến 2011cho thấy, tỷ lệ nhiễm HIV trong nhóm người
trưởng thành đã giảm hơn 25%. Riêng khu vực châu Phi cận Sahara, số lượng
người nhiễm HIV trong năm 2011 là 1,8 triệu người, thấp hơn đáng kể so với
2,4 triệu người vào năm 2001 [11].
1.1.2. Tình hình nhiễm HIV ở Việt Nam
Tại Việt Nam, kể từ ca nhiễm HIV đầu tiên được phát hiện năm 1990,


Vỏ capsid gồm 2 lớp protein:
+ Lớp ngoài hình cầu có trọng lượng phân tử 18 kDa (p18).
+ Lớp trong hình trụ có trọng lượng phân tử 24 kDa (p24).

gp120, gp41 và p24 là những kháng nguyên rất quan trọng để chẩn đoán
HIV.
-

Lõi nằm bên trong của vỏ capsid là vật chất di truyền của HIV gồm hai

phân tử ARN mạch đơn, chuỗi dương. Hệ gen HIV chứa 3 nhóm gen cấu trúc:
+ Gen gag (group specific antigen) là các gen mã hoá cho các kháng
nguyên đặc hiệu trên vỏ capsid của virus.


10

+ Gen pol (polymerase) mã hoá cho các enzyme phiên mã ngược (RT Reverse transcriptase), protease và endonuclease (còn gọi là integrase).
+ Gen env (envelop) mã hoá cho glycoprotein vỏ ngoài của HIV [2].
1.2.2. Chu trình sống HIV
Chu trình sống của virus HIV được tóm tắt trong sơ đồ hình 2.

Hình 1.2: Chu trình sống của HIV
(1)

Sự hấp phụ lên bề mặt tế bào: Do sự phù hợp cấu trúc giữa

gp120 với thụ thể biểu hiện trên màng tế bào, HIV có thể hấp phụ lên bề mặt
tế bào chủ. Trong đa số các trường hợp, thụ thể này là CD4 biểu hiện trên bề

trạng thái tiềm tàng này có thể hoạt động như những virus độc lực dưới các
tác động của môi trường; hai là dạng hoạt động, ADN bổ sung của HIV được
sao chép thành các hạt virion mới.
(5)

Giai đoạn sinh tổng hợp: Giai đoạn này ADN bổ sung của HIV

được phiên mã thành ARN genome và ARN thông tin (mARN) để dịch mã
thành các protein (enzyme, protein vỏ,..) của thế hệ virus HIV mới [13].
(6)

Giai đoạn lắp ráp: Từ các thành phần đã được tổng hợp, các hạt

virus mới được lắp ráp ở bào tương tế bào chủ [14].
(7)

Giai đoạn phóng thích: Từ vị trí lắp ráp các hạt HIV gần màng

nguyên sinh chất, HIV nảy chồi thoát khỏi tế bào chủ. Sau đó các hạt virus
này tiếp tục gây nhiễm cho tế bào mới trong khi các tế bào chủ đã giúp chúng
nhân lên bị tiêu diệt [15].


12

1.2.3. Phân loại HIV
HIV có hai type gây bệnh trên người là HIV-1 và HIV-2. Cả hai týp đều
lây truyền qua quan hệ tình dục, qua máu và từ mẹ sang con, và dường như
bệnh cảnh lâm sàng AIDS của chúng giống nhau. Tuy nhiên, HIV-2 khó lây
truyền hơn và thời kỳ giữa sơ nhiễm HIV-2 đến biểu hiện bệnh dài hơn. Trên


Giai cấp tính: kéo dài từ 3 – 6 tháng sau hành vi nguy cơ. Ở giai

đoạn này nồng độ HIV có thể lên đến vài triệu hạt virus/ml máu. Số lượng tế
bào T-CD4+ bị giảm đáng kể nhưng có đến 80% người bị nhiễm virus hoàn
toàn không có biểu hiện gì của bệnh, 20% còn lại có một số những biểu hiện
nhiễm trùng cấp như: sốt, đau cơ khớp, nôn, tiêu chay, phát ban, hạch to…
Các triệu chứng này hiện diện trong vòng 5-10 ngày rồi tự khỏi hoàn toàn.
Trong giai đoạn này rất khó phát hiện được kháng thể kháng HIV.
(2)

Giai đoạn mạn tính: nhờ sự bảo vệ mạnh mẽ của hệ miễn dịch sẽ

làm giảm số lượng của các hạt virus trong máu, cơ thể chuyển sang giai đoạn
nhiễm HIV mạn tính. Giai đoạn này có thể kéo dài từ 2 tuần-20 năm tùy theo
từng người mà không có bất kể triệu chứng gì.
(3)

Giai đoạn AIDS: số lượng các tế bào CD4+ giảm xuống dưới 200

tế bào/1ml máu, sự miễn dịch qua trung gian tế bào bị vô hiệu và xuất hiện
nhiễm trùng do một loạt các vi sinh vật cơ hội gây ra. Các triệu chứng đầu
tiên thường bao gồm giảm cân vừa phải và không giải thích được, nhiễm
trùng đường hô hấp tái phát (như viêm xoang, viêm phế quản, viêm tai
giữa, viêm họng), viêm tuyến tiền liệt, phát ban da, và loét miệng.
1.3.

Kỹ thuật phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV
Phương pháp chẩn đoán gián tiếp sự có mặt của HIV là phương pháp


tính giả. Hiện nay kit test nhanh dựa trên nguyên lý kỹ thuật ngưng kết sử
dụng thường quy tại các cơ sở y tế hiện nay là Serodia HIV 1/2 kit


15

(Fujirebio Inc., Tokyo, Nhật Bản). Kháng nguyên được gắn trên hạt gelatin
bao gồm protein tái tổ hợp gp41, p24 của HIV-1 và gp36 của HIV-2.
1.3.2. Kỹ thuật miễn dịch enzyme pha rắn ELISA
ELISA là phương pháp cho phép phát hiện hầu hết các mẫu xét nghiệm
có kháng thể kháng HIV. Tuy nhiên, đây là phương pháp có độ nhạy cao, do
đó có thể cho những kết quả dương tính giả. ELISA được ứng dụng để phát
hiện các kháng thể IgG anti-HIV, IgA anti-HIV hoặc IgM anti-HIV bằng 3 kỹ
thuật sau:

Kỹ thuật ELISA gián tiếp
Kháng thể kháng HIV trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với
kháng nguyên HIV đã được cố định sẵn trên giá đỡ (ở các giếng phản ứng
trên hạt nhựa). Phức hợp kháng nguyên - kháng thể được nhận biết bởi một
cộng hợp là kháng thể kháng Ig người có gắn enzyme và sẽ cho phản ứng
hiện màu với một cơ chất thích hợp. Giá trị mật độ quang của phản ứng màu
tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử. Đây là
xét nghiệm có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu không cao do thường bị dương
tính giả.[6]
Kỹ thuật ELISA Sandwich
Kháng thể kháng HIV được cố định trong giếng để tóm bắt các kháng
nguyên virus trong mẫu thử và được phát hiện bởi kháng thể 2 gắn enzyme.
Giá trị mật độ quang của phản ứng màu tỷ lệ thuận với kháng nguyên hiện
diện trong mẫu thử. ELISA sandwich thường được sử dụng để phát hiện
kháng nguyên p24 của HIV trong chẩn đoán sớm HIV [18].


17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là kháng thể kháng HIV trong các mẫu huyết
thanh bệnh nhân được thu thập từ trung tâm phòng chống AIDS-Bộ Quốc
Phòng.
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2016.
Địa điểm nghiên cứu tại Labo sinh học phân tử Viện Hàn lâm và Công
nghệ Việt Nam và Labo Sinh học phân tử Trường Đại học Y Dược Hải
Phòng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

-

Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm kết hợp mô tả cắt ngang và hồi cứu.
2.2.2. Sinh phẩm, hóa chất và vật liệu, trang thiết bị
2.2.2.1. Sinh phẩm, hóa chất
Bộ sinh phẩm PolyLink Protein Coupling Kit chứa các hạt beads latex

của Bangs Labroratories, Inc,
Polyacrylamide, EDTA, SDS 10%, glycerol, TEMED, APS, Tris–HCl,
ethidium bromide... đạt độ tinh sạch sử dụng trong sinh học phân tử.
2.2.2.2.
Nguyên vật liệu
kháng nguyên tái tổ hợp p24, gp 41 và gp 120 của phân type virus

Kiểm tra chất lượng protein tái tổ hợp
Thực hiện quy trình gắn từng loại kháng nguyên tái tổ hợp lên hạt latex
Phối trộn 3 loại hạt latex gắn kháng nguyên theo tỷ lệ 1:1:1
Tối ưu hóa điều kiện phản ứng ngưng kết
Kiểm tra phản ứng ngưng kết với kháng thể bệnh nhân nhiễm HIV
Đánh giá độ tương đồng của chế phẩm với các kit đang lưu hành

-

2.4. Tiến trình triển khai nghiên cứu
2.4.1. Điện di kiểm tra chất lượng protein tái tổ hợp
2.4.1.1
Biến tính protein tái tổ hợp
Trộn từng loại protein tái tổ hợp p24, gp120 và gp41 với C1- buffer

-

theo tỷ lệ 40µl protein với 10µl C1- buffer (tỷ lệ 4:1)
Đun sôi biến tính protein ở 100ºC trong 10 phút
2.4.1.2
Chuẩn bị gel polyacrylamide %
Điện di gel polyacrylamide được tiến hành theo phương pháp
của
Laemmli U.K. (1970), thường được sử dụng để tách riêng các băng
protein có trọng lượng phân tử khác nhau. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật
này để kiểm tra các protein tái tổ hợp sau khi biểu hiện.
Quy trình:
Đổ gel theo công thức :
(1) Công thức đổ gel cô


- TEMED

-

1,7 ml
312,5 ml
12,5 µl
25 µl
425 µl
2 µl

2.4.1.3 Điện di protein
Gắn bản gel vào buồng điện di
Đổ dung dịch SDS-page 1X với nồng độ 10% đầy bể điện di
Tra 15 µl và 10 µl marker lần lượt từng loại protein tái tổ hợp vào mỗi giếng
điện di
Điện di 40mA trong 45 phút
- Sau khi điện di, gel được nhuộm với dung dịch Coomasie brilliant blue
(0,1% Coomassie Brilliant Blue R- 250 (w/v)
+ 40% methanol (v/v), 10% acid acetic (v/v)) trong 2 giờ trên máy lắc,
sau đó đổ dịch nhuộm, thay bằng dịch tẩy, lắc trong 30 phút thì đổ dịch
tẩy đi cho nước vào.
- Có thể quan sát trực tiếp hoặc soi kiểm tra mẫu trên nguồn sáng trắng và ghi

-

lại kết quả.
2.4.2. Quy trình gắn kháng nguyên tái tổ hợp lên hạt latex
Trước khi thực hiện quy trình, làm ấm hạt latex, Polylink Coupling Buffer và
Polylink Wash/Storeage Buffer ở nhiệt độ phòng.

Ly tâm 3000vòng/phút trong vòng 10 phút, loại dịch
Hòa tủa trong 400µl Wash Buffer, ly tâm 3000vòng/phút trong 10 phút, loại

-

bỏ dịch nổi.
Tiếp tục hòa tủa trong 400µl Wash Buffer, ly tâm 3000vòng/phút trong 10

-

phút, loại bỏ dịch nổi.
Lưu trữ dung dịch hạt latex trong đệm Wash buffer/Storage buffer trong
-200C
2.4.3. Thử nghiệm khả năng phát hiện kháng thể kháng HIV của
chế phẩm
-

Chuẩn bị 3 lam kính, ghi nhãn (-),

-

Nhỏ 1 giọt huyết thanh bệnh nhân bằng pipetman (tương đương 10 µl)

lên mỗi lam kính
-

Nhỏ 1 giọt (tương đương 10 µl) dung dịch hạt latex không gắn kháng

nguyên vào lam thứ nhất
-

-

Tiến hành pha loãng chế phẩm gắn kháng nguyên HIV tái tổ hợp theo

cấp số 2 để thu được các dung dịch có độ pha loãng từ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 đến
1/32 bằng cách:
+
Hút 120μl dung dịch hạt latex trộn đều trong 120 μl dung dịch
PBS 5% để thu được dung dịch pha loãng 1/2
+
Hút 120μl dung dịch hạt latex trộn đều với 120 dung dịch PBS
5% để thu được dung dịch pha loãng 1/4
+

Với phương pháp tương tự để thu được các dung dịch pha loãng

1/8-1/32.
2.4.5. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của chế phẩm
Độ nhạy là tỷ lệ những trường hợp thực sự có bệnh và có kết quả xét
nghiệm dương tính trong toàn bộ các trường hợp có bệnh. Như vậy độ nhạy
cho cả kết quả dương tính giả.
Độ đặc hiệu là tỷ lệ những trường hợp thực sự không có bệnh và có kết
quả xét nghiệm âm tính trong toàn bộ các trường hợp bị bệnh, độ đặc hiệu
càng cao kết quả càng chính xác.


22

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1


3.1.2 Kiểm tra độ tinh sạch của Protein tái tổ hợp
Để có thể ứng dụng các protein tái tổ hợp cho nghiên cứu vào ứng dụng
tạo Kit chẩn đoán HIV bằng kỹ thuật ngưng kết hạt latex, trước tiên phải kiểm
tra độ tinh sạch của protein tái tổ hợp.
Việc kiểm tra độ tinh sạch được tiến hành bằng phương pháp điện di
protein trên gel polyaryamide.
Kết quả điện di của protein tái tổ hợp Gp120


23

Hình 3.1: Kiểm tra độ tinh sạch của GP120 tái tổ hợp sau tinh chế bằng điện
di trên gel polyacryamide . M: Thang protein chuẩn (Fermentas); 1, 2, 3: các
phân đoạn của protein tái tổ hợp đã được tinh sạch.
Kết quả cho thấy băng đậm xuất hiện ở vị trí khoảng 120kDa đúng với
dự đoán theo lý thuyết. Điều đó có nghĩa là Gp120 tái tổ hợp sau khi được
tinh sạch có độ tinh sạch cao, không có các băng tạp nhiễm.


24

Kết quả điện di của protein tái tổ hợp Gp41

kDa
66,2
45,0
35,0
25,0
18,0


Để đánh giá chất lượng kháng nguyên đã được gắn lên bề mặt hạt latex
chúng tôi tiến hành thử phản ứng ngưng kết trên kháng thể kháng Trx
Những hạt latex đã được gắn kháng nguyên được trộn với dung dịch
chứa kháng thể kháng HIV theo tỷ lệ 1:1 và được so sánh với chứng âm là các
hạt latex trộn với dung dịch PSB