ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------

PHẠM HOÀI LINH LY

NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC
VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng
GS. TS. Phạm Văn Ty

HÀ NỘI-2014

1


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.
HỌC VIÊN

Phạm Hoài Linh Ly

2


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU………………………………………………………................

1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN…………………………………………….

3

1.1. VIRUS CÚM B…………..…………………………………...……

3

1.1.1. Đặc điểm chung………………………………..…………………

3

1.1.2. Hình thái và cấu trúc virion của virus cúm B.................................

4

1.1.3. Cấu trúc phân tử của virus cúm B và chức năng….……………...


1.6. ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM……………………….

15

1.6.1. Các thuốc kháng virus……………………………...……...……..

15

4


1.6.2. Dự phòng…………….……………………………………...…….

17

1.7. CHẨN ĐOÁN VIRUS HỌC…...………………………..………..

19

1.7.1. An toàn phòng thí nghiệm………………………………………...

19

1.7.2. Thu thập mẫu để chẩn đoán virus …...………….……………...…

20

1.7.3. Phương pháp phân lập chủng và định typ virus……………..........

20


25

PHƯƠNG PHÁP..………………..…………………...………….

25

2.3.

2.3.1. Định typ virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu
(HAI)……………………………………………………..………..

25

2.3.2. Giải trình tự gen…………………………...………...…………....

27

2.3.3. Phương pháp phân tích kết quả và xử lý số liệu………..………….

34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………….………….….

36

3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ KHUẾCH ĐẠI CÁC CHỦNG
VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012…….……...
3.1.1. Sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010-2012.



3.3.4. Protein HA….………………...……………………………………

52

3.4. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN NA CÁC CHỦNG
VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012……………

57

3.4.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen NA của virus cúm B.……………....

57

3.4.2. Cây gia hệ gen NA………………………………………………...

61

3.4.3. Protein NA………………………………………….……………..

65

KẾT LUẬN………………………………………………………………

72

KIẾN NGHỊ………………………………………………………...........

74



Influenza like illness (Hội chứng cúm)

MDCK

Madin-Darby Canine Kidney Cells (Tế bào thận chó thường trực)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase)

QIV

Quadrivalent Influenza Vaccine (Vắc xin gồm 4 thành phần virus
H1N1, H3N2, B/Yamagata và B/Victoria)

RNP

Phức hợp Ribonucleoprotein

TCYTTG

World Health Oganization (Tổ chức Y tế Thế giới )

VSDTTƯ

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

7


41

3.4.

So sánh hiệu giá HAI giữa hai dòng B/Victoria và B/Yamagata…..

3.5.

So sánh kháng nguyên virus cúm B tại Miền Bắc Việt Nam với

42

thành phần vắc xin cúm tại Bắc và Nam Bán cầu theo khuyến cáo
của TCYTTG, 2010-2012………………………………………….
3.6.

Số lượng chủng phân tích gen HA và NA …………………………

3.7.

Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Vitoria, 20102012...................................................................................................

3.8.

57

64

Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Yamagata, 20102012…………………………………………………………………


66


DANH MỤC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1.

Mô hình cấu trúc chung của virus cúm......................................

4

1.2.

Chu trình nhân lên của virus cúm …………………………….

8

1.3.

Các vị trí đột biến trên cấu trúc không gian 3 chiều của
Neuraminidase ………………………………….…………….

3.1.


49

Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Yamagata,
2010-2012…………………………………..…………………

3.8.

Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Victoria……

3.9.

Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Yamagata.....

3.10.

Số axit amin khác nhau trên protein HA dòng B/Victoria giữa
các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin…………….

9

50
53
54

56


3.11.

Số axit amin khác nhau trên protein HA dòng B/Yamagata


3.18.

Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Yamagata…

3.19.

Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Victoria giữa
các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin………….…

61
63
64

65

Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Yamagata
giữa các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin……….

3.21.

60

Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Yamagata,
2010-2012………………………………………………….….

3.20.

59


Khi nghiên cứu 45 trường hợp tử vong do virus cúm B cho thấy 1/3 trong số này bội
nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus, trong đó số trường hợp tử vong trong 3 và 4
ngày sau khi nhiễm virus là 50% và 70% [20]. Như vậy, thời gian từ khi nhiễm
virus cúm B đến khi tử vong nhanh hơn so với virus cúm A/H1N1 1918, A/H2N2
1957, A/H3N2 1968, A/H1N1pdm 2009 và A/H3N2 [21, 26, 32, 35,]. Mặt khác,
virus cúm B kết hợp với các virus gây viêm đường hô hấp khác sẽ có khả năng gây
biến chứng nguy hiểm cho trẻ em, người già, người suy giảm miễn dịch hoặc mắc
các bệnh mạn tính và phụ nữ mang thai nếu không có biện pháp phòng ngừa kịp
thời.

11


Trên thế giới, từ những năm 1970, vắc xin cúm được sản xuất là vắc xin đa
giá, thành phần vắc xin bao gồm 2 phân týp virus cúm A (A/H1N1, A/H3N2) và 1
dòng virus cúm B (Trivalent influenza vaccine - TIV). Vào những năm của thập kỷ
80, virus cúm B đã xuất hiện 2 dòng, B/Yamagata và B/Victoria, lưu hành đồng thời
ở nhiều nước nhưng thành phần vắc xin vẫn lựa chọn chủng đại diện cho một dòng
kháng nguyên virus cúm B [37, 48]. Vì vậy, những năm virus cúm B lưu hành cả 2
dòng kháng nguyên thì hiệu quả của vắc xin dự phòng sẽ hạn chế. Mặt khác, nhiều
năm đã có sự không phù hợp giữa chủng virus cúm B đang lưu hành và chủng virus
cúm B được lựa chọn trong thành phần vắc xin hàng năm.
Tại Việt Nam, kể từ khi dịch viêm đường hô hấp cấp tính nặng (SARS), cúm
gia cầm A/H5N1 xuất hiện năm 2003 đến nay gánh nặng bệnh cúm gần đây đã được
quan tâm nhiều hơn. Tuy nhiên, virus cúm B dường như vẫn chưa đươc quan tâm
đúng mực. Với những gánh nặng bệnh của virus cúm B như vậy, việc triển khai
nghiên cứu về sự lưu hành, đặc điểm di truyền cũng như đặc tính kháng nguyên của
virus cúm B tại Việt Nam là hết sức cần thiết. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài:
“Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam”

về kháng nguyên bề mặt của virus cúm B hầu như không quan sát được nên danh
pháp quốc tế của virus cúm B không có sự tham gia của kháng nguyên bề mặt HA
và NA như đối với danh pháp quốc tế được quy định cho virus cúm A.
Virus cúm B được phân chia thành 2 dòng kháng nguyên phân biệt vào
những năm 1980, đó là dòng B/Victoria (B/Victoria/2/87-lineage viruses) và dòng
B/Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage viruses). Các dòng virus này được đặt tên
sau khi xuất hiện các đại diện đầu tiên là B/Victoria/2/87 - like virus và
B/Yamagata/16/88 - like virus [48].

13


1.1.2. Hình thái và cấu trúc của virus cúm B
Thành phần cấu trúc của virus cúm B gồm có: 1% ARN, 70% protein, 20%
lipit và 5-8% carbohydrate. Virion cúm (hạt virus hoàn chỉnh, dạng virus nghỉ ở
ngoài tế bào) có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc hình sợi kéo dài
tới 2000nm, đường kính trung bình từ 80-120nm. Virus cúm B có cấu trúc phức tạp
và có vỏ ngoài bao bọc. Vỏ ngoài virus có bản chất là protein có nguồn gốc từ màng
tế bào chất của vật chủ, bao gồm một số glycoprotein và một số protein dạng trần
không được glycosyl hoá. Các virion cúm có các tính chất hóa lý như rất nhạy cảm
khi xử lý bằng cách đun nóng, dùng dung môi lipit, chất tẩy rửa không chứa ion,
formaldehyde, tác nhân ô xi hóa, khả năng lây nhiễm của các virus cúm cũng bị
giảm đi sau khi chúng tiếp xúc với bức xạ.

Hình 1.1.

Mô hình cấu trúc chung của virus cúm

*Nguồn: Funtional and structure studies of influenza B virus Hemagglutinin
by Fengyun Ni [22 ]


PB1

ARN

(mRNA). Đóng vai trò làm enzyme phiên mã: gắn kết,
kéo dài, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp virus thế
hệ mới trong tế bào chủ

3

PA

Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN virion (vRNA).

4

HA

Phân tử có cấu trúc trimer, cắt bởi enzyme thuỷ phân

(Haemagglutinin
)

thành HA1 và HA2, là cơ sở cho khả năng nhiễm trùng.
HA gắn với tế bào túc chủ, dung hợp giải phóng phức
hợp ribonucleoprotein (RNP), mở đầu cho quá trình
nhân lên của virus.

5

(matrix protein)

M1: là kháng nguyên đặc hiệu týp, có chức năng ổn
định cấu trúc virus, điều khiển hoạt tính RNApolymerase và tham gia vào quá trình lắp ráp virus
(70%).
M2: kênh ion.

8

NS1-NS2

Là protein không cấu trúc, kết thúc quá trình tổng hợp
protein của tế bào túc chủ, chỉ có trong tế bào nhiễm
virus.

Qua những nghiên cứu về hoạt động chức năng các protein của virus cúm
trong quá trình nhân lên và sao chép trong tế bào chủ cho thấy vùng gen HA của
virus cúm B tiến hóa chậm hơn vùng gen của virus cúm A. Phân đoạn HA của virus
cúm B có cấu trúc và chức năng tương tự phân đoạn HA của virus cúm A, đó là một
kháng nguyên bề mặt chủ yếu, giúp virus bám dính và xâm nhập vào tế bào chủ [10,
47]. Khác với virus cúm A, virus cúm B được ghi nhận chỉ lưu hành ở người và hải
cẩu. Vì vậy chỉ quan sát thấy các thay đổi nhỏ kháng nguyên ở virus cúm B. Các
thay đổi nhỏ kháng nguyên ở phân đoạn HA của virus cúm B xuất hiện như ở virus
cúm A, bởi sự tích tụ của các axit amin thay thế trong polypeptide HA1, nhưng chỉ

16


khoảng ¼ tỉ lệ này ở virus cúm A. Do đó virus cúm B không gây ra đại dịch như
một số virus cúm A.


Hình 1.2. Chu trình nhân lên của virus cúm
* Nguồn: Funtional and structure studies of influenza B virus Hemagglutinin [22]
Đầu tiên, virus sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất của tế bào
chủ nhờ gai glycoprotein HA theo nguyên tắc khóa - chìa. Các thụ thể đặc hiệu có
bản chất là các axit sialic (N- acetyl neuraminic acid - NANA). Sau đó virus xâm
nhập vào bên trong tế bào theo cơ chế nhập bào. Các virion virus ấn sâu vào màng

18


tế bào tạo hốc rồi khép lại tạo túi nội bào hay bọng (endosome) nằm bên trong tế
bào chất. Bơm proton trong endosome vận chuyển H+ vào làm cho pH trong
endosome giảm xuống 5, pH thấp tạo điều kiện cho protein F (fusion) chồi lên cắm
vào màng endosome như chiếc neo, kéo vỏ ngoài virus sát với endosome và tiến
hành dung hợp với màng endosome để giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất. Sự
hợp nhất này chỉ xảy ra khi phân tử HA tiền thân (HA0) phân tách thành HA1 và
HA2 nhờ protease phổ biến là furin. Phân tử HA2 có đầu - N đóng vai trò hoà tan
trung gian giữa vỏ virus và màng nội bào (hình 1.2). Protein M2 ở virus cúm A hay
còn gọi là kênh ion (ion - channels) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình
thay đổi pH và dung hợp này.
Hầu hết các virus ARN tiến hành sao chép trong tế bào chất vì chúng có thể
mã hóa cho tất cả các enzym cần cho sao chép genome mà không cần đến các
enzym của tế bào nằm trong nhân, nhưng đối với virus cúm, chúng lại cần bộ máy
cắt nối của tế bào nên genome của chúng phải được đưa vào nhân. Sau khi hợp nhất
màng, nucleocapsid được vận chuyển vào trong nhân tế bào. Trong nhân, sợi ARN
(-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN (+) theo cơ chế bổ sung
[cARN (+)] nhờ enzyme RNA - polymerase phụ thuộc ARN của virus. Chính các
cARN (+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên
vật liệu di truyền của virus. Các sợi ARN (-) được tạo thành này là một sợi hoàn

giám sát này, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) sẽ đưa ra khuyến cáo về sự lựa chọn
dòng kháng nguyên B trong thành phần vắc xin cúm hàng năm cho các nước thuộc
khu vực Bắc bắn cầu hoặc Nam bán cầu. Trong giai đoạn từ năm 1999 đến năm
2002, dòng B/Yamagata chiếm ưu thế hơn đã được lựa chọn vào thành phần vắc
xin. Các virus cúm B thuộc dòng Yamagata trong giai đoạn này có đặc tính kháng
nguyên và di truyền giống với chủng B/Sichuan/379/99. Trong giai đoạn tiếp theo
từ năm 2002 đến năm 2004, ở cả Nam bán cầu và Bắc bán cầu dòng virus cúm B
chiếm ưu thế lại là dòng Victoria với các virus có đặc tính kháng nguyên và di
truyền giống với chủng B/HongKong/330/2001. Tương tự như vậy, dường như sự
lưu hành của virus cúm B có một quy luật lặp lại 2-3 năm một lần. Khi mà trong
giai đoạn từ năm 2004 đến năm 2006, dòng Yamagata quay trở lại chiếm ưu thế trên
thế giới với đại diện là chủng B/ShangHai/361/2002. Trong giai đoạn từ năm 2006
đến năm 2008, trên cả Nam bán cầu và Bắc bán cầu, dòng chiếm ưu thế là dòng
Victoria với đại diện là chủng B/Malaysia/2506/2004. Trong giai đoạn tiếp theo từ

20


năm 2008 đến năm 2009, dòng virus cúm B lưu hành chiếm ưu thế là dòng
Yamagata với đại diện là chủng B/Florida/4/2006.
Từ năm 2009 đến năm 2011, virus cúm B xuất hiện ở trên khắp các Châu
lục, cả 2 dòng virus cúm B là dòng Victoria và dòng Yamagata lưu hành đồng thời
nhưng dòng chiếm ưu thế là dòng Victoria. Các virus cúm B thuộc dòng Victoria có
mối quan hệ gần gũi về đặc tính kháng nguyên và di truyền với chủng vắc xin
B/Brisbane/60/2008. Phần lớn các virus thuộc dòng Yamagata có các đặc tính gần
với chủng đại diện trước đó là chủng B/Florida/4/2006. Tuy nhiên bắt đầu từ cuối
năm 2011, cả 2 dòng cúm B được quan sát thấy với tỉ lệ ngang nhau ở một số quốc
gia, điều này gợi ý đến khả năng quay trở lại lưu hành của dòng Yamagata mặc dù
số lượng virus thu thập được là tương đối ít. Hầu hết các virus dòng Yamagata đã
có sự khác biệt về tính kháng nguyên và di truyền với chủng B/Florida/4/2006 trước

1.3.

SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TẠI VIỆT NAM
Hội chứng cúm (Influenza like illness - ILI) là một trong 26 bệnh truyền

nhiễm có tỷ lệ mắc cao nhất trong các bệnh truyền nhiễm gây dịch tại Việt Nam.
Vai trò của virus cúm trong ILI cũng như ảnh hưởng của nhiễm virus cúm, gánh
nặng bệnh tật cùng với các biến chứng do virus cúm gây ra như viêm phổi cấp tính,
phụ nữ có thai 3 tháng đầu nhiễm virus cúm... với sức khỏe cộng đồng tại Việt
Nam vẫn chưa có những thống kê chính xác. Bắt đầu từ năm 2001, việc giám sát
chủ động sự lưu hành của virus cúm đã được triển khai tại Hà Nội. Theo Niên giám
thống kê các bệnh truyền nhiễm 2001-2005, tỷ lệ hội chứng cúm trung bình trong 5
năm (2001-2005) là 2040,4/ 100.000 dân, đứng đầu trong 10 bệnh có tỷ lệ mắc cao
nhất tại Việt Nam [1-5]. Năm 2006, Viện Viện Vệ sinh Dịch tễ (VSDTTƯ) đã bước
đầu thiết lập và triển khai hệ thống giám sát cúm trọng điểm để phát hiện và xác
định các chủng virus cúm gây bệnh hàng năm ở 15 điểm trong toàn quốc. Kết quả
giám sát cho thấy virus cúm lưu hành đồng thời các chủng cúm mùa khác nhau như
A/H3N2, A/H1N1 và B. Khác với virus cúm A là các phân týp A/H3N2 hoặc
A/H1N1có thể là căn nguyên chính trong mỗi năm và xuất hiện xen kẽ giữa các
năm, virus cúm B lưu hành hàng năm. (Nguồn từ Chương trình giám sát Cúm Quốc
Gia-Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương do CDC-Mỹ tài trợ).

22


Trong giai đoạn từ năm 2001 đến năm 2008, tại miền Bắc Việt Nam, virus
cúm B và các virus cúm mùa khác là A/H3N2 và A/H1N1 lưu hành quanh năm,
thường tập trung vào 2 thời điểm là cuối mùa xuân (tháng 2-3) và giữa mùa hè
(tháng 7-8). Trong đó, virus cúm B là căn nguyên chủ yếu gây ra các vụ dịch vào
cuối mùa xuân (2001, 2006 và 2008), virus cúm A/H1N1 hoặc A/H3N2 là căn

với tần suất thấp hơn [33, 36]. Hiện nay trên thế giới lưu hành 2 dòng cúm B là
dòng B/Victoria/2/87-like virus và dòng B/Yamagata/16/88-like virus, trong đó
dòng B/Victoria/2/87-like virus lưu hành chủ yếu ở Đông Nam Á còn dòng
B/Yamagata/16/88-like virus lưu hành trên khắp thế giới trong thế kỷ XX [48, 49].
Sự trao đổi chéo và tích hợp vật liệu di truyền của virus cúm B chỉ xảy ra khi hai
dòng này lưu hành đồng thời. Hiện tượng này đã được ghi nhận ở một số nước
Châu Âu vào năm 2001 [57].
1.5.

BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ SINH BỆNH HỌC BỆNH CÚM
Bệnh cúm là bệnh viêm nhiễm cấp tính đường hô hấp gây nên bởi virus cúm.

1.5.1. Biểu hiện lâm sàng của bệnh cúm
Sau thời gian ủ bệnh từ 2 - 4 ngày, bệnh thường khởi phát đột ngột với các
triệu chứng toàn thân như sốt cao, rét run, cơ thể rất mệt và yếu. Đồng thời xuất
hiện những dấu hiệu viêm đường hô hấp như ho khan, đau họng và viêm mũi. Với
trẻ em những triệu chứng như viêm tai giữa, buồn nôn và nôn cũng thường xảy ra.
Biến chứng thường gặp nhất của cúm là viêm phổi, trong đó viêm phổi do
bội nhiễm vi khuẩn là dạng phổ biến nhất và viêm phổi nguyên phát là dạng trầm
trọng nhất. Bệnh cúm kèm bội nhiễm vi khuẩn làm cho bệnh nặng lên nhiều lần [6].
Trong các vụ dịch thường có dạng kết hợp viêm phổi virus và vi khuẩn. Ngoài ra
còn có các biến chứng khác như viêm cơ, hội chứng sốc nhiễm độc, hội chứng Rey
[16, 51].
1.5.2. Sinh bệnh học bệnh cúm
Phương thức lây truyền virus cúm từ người sang người là virus cúm có trong
chất tiết hô hấp và hạt khí dung được phát tán trong không khí do bệnh nhân cúm
ho và hắt hơi đã thải virus ra không khí từ khoang mũi. Phương thức lây truyền
virus cúm từ động vật sang người là do con người đã tiếp xúc trực tiếp với gia cầm,
phân gia cầm bị bệnh hoặc ăn thịt gia cầm, tiết canh gia cầm chưa nấu kỹ. Nhiễm


Oseltamivir, Zanamivir, Permivir và Laninamivir, không sử dụng thuốc ức chế
kênh ion M2 như đối với virus cúm A vì virus cúm B không có protein M2. Tất cả
các thuốc đều có tác dụng điều trị hiệu quả nhất nếu được sử dụng trong vòng vài
giờ khi triệu chứng bắt đầu và thường được phép sử dụng trong vòng 48 tiếng sau
khi có triệu chứng đầu tiên. Thuốc có tác dụng làm giảm bớt mức độ trầm trọng của
bệnh cũng như các triệu chứng cúm và làm rút ngắn thời gian bệnh khoảng 1 - 3
ngày.

25