1

Bộ giáo dục và đào tạo
Trờng Đại học vinh

Đoàn Thị Tuyến

Bớc Đầu nghiên cứu thành phần hoá Học
CủA ông trùng hạ thảo (Cordyceps sp1)
ở Nghệ An

Luận văn thạc sĩ hoá học

Vinh

M U
1. Lý do chn ti
Vit Nam nm vựng trung tõm ụng Nam hng nm cú lng
ma v nhit trung bỡnh tng i cao. Vi khớ hu nhit i giú mựa
núng, m ó cho rng Vit Nam mt h thc vt a dng v phong phỳ.


2
Nấm ký sinh côn trùng không chỉ là một nhóm có tính đa dạng sinh
học cao mà còn có vai trò quan trọng trong phòng trừ sinh học sâu hại cây
trồng và trong y - dược tạo các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Trên thế
giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó có hơn 400 nghìn loài nấm ký
sinh côn trùng đã được biết ở trên thế giới.
Nghệ An là tỉnh có Vườn Quốc gia Pù Mát, khu Bảo tồn thiên nhiên Pù
Huống và khu Bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt. Đây là những vùng
được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao. Tại đây chứa


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Chi Cordyceps
1.1.1. Phân loại
Đông trùng hạ thảo còn gọi là trùng thảo, hạ thảo đông trùng hay
đông trùng thảo là một giống nấm túi có tên khoa học là Cordyceps


4
sinensis thuộc nhóm Ascomycetes mọc ký sinh trên sâu non ( ấu trùng) c ủa
một loại sâu thuộc họ sâu Cánh bướm thuộc chi Hepialus. Thường gặp
nhất là sâu non của loài Hepialus armoricanus. Ngoài ra còn 40 loài khác
thuộc chi Hepialus cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh. Chi nấm
Cordyceps có tới 350 loài khác nhau, chỉ riêng ở Trung Quốc đã tìm th ấy
60 loài. Tuy nhiên cho đến nay người ta m ới chỉ nghiên cứu nhi ều nh ất
được về 2 loài Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris Link. Lo ài th ứ
hai được gọi là Nhộng trùng thảo [5].


5

Hình 1: Ảnh của một số loài nấm ký sinh Cordyceps
Nấm và sâu hợp sinh với nhau. Vào mùa đông, con sâu non nằm ở


6
dưới đất, nấm phát triển trên toàn thân con sâu để hút ch ất dinh d ưỡng l àm
cho con sâu chết. Đến mùa hạ, nấm sinh cơ chất (stroma) m ọc ch ồi khỏi
mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào đầu sâu. Người ta thường đào l ấy t ất



7
1.1.2. Thành phần hoá học của chi Cordyceps
Về thành phần hóa học, đông trùng hạ thảo chứa 25-32% protit (gần
đây có thông báo cho rằng tỷ lệ này đạt tới 44,26%), khi thủy phân cho t ới
14 - 19 axit amin khác nhau. Ngoài ra, còn có ch ứa nhi ều lo ại vitamin nh ư
A, B1, B2, B12, C, E, K (trong 100g đông trùng hạ thảo có 0,12 g vitamin
B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, ...) và các nguyên tố vi
lượng như Na, K, Ca, Mg, Al, Mn, Cu, Zn, Bo, Fe... trong đó cao nh ất l à
phosphor, một lượng đáng kể nước, chất béo, protein, chất sợi thô,
carbohydrat tro khoáng chống oxy hóa, chống virus, chống ung bướu, axit
glutamic [5], [45].
Mười một bioxanthracen (1-11) và 2 đồng phân (12 và 13), được phân
lập từ nấm ký sinh trên côn trùng Cordyceps pseudomilitaris BCC1620 [25].

H3CO

H3CO

OH

OH
O

O
H 3CO

CH3




8
H3CO

H3CO

OH

OH

O
H 3CO

OAc
OAc

O
CH3

H 3CO

CH3

OH
H

CH3
O



O
CH3

H 3CO

CH3

H
H

CH3

CH3

O

H CO

O

H3CO
H3CO

OH

(5)

H3CO


CH3

CH3

O

H CO

O

H3CO
H3CO

OH

OH

H3CO

(7)

(8)
H3CO

OH

(9)
OCH3 OH

OCH3 OH

CH3
O

O
OCH3 OH

(10)

OCH3 OH

(11)


10
OCH3 OH

OCH3 OH

O

O
H3CO

CH3

H3CO

CH3

H


O O

O

O

(15) Cordyanhydride B
Kou Y.C và cộng sự [31] dã phân lập từ dịch chiết metanol của loài
Cordyceps cicadae là beauvericin (16), beauvericin A (17), beauvericin B
(18) bassiatin (19), bassiatin A (20).


11
CH2CH3

CH3
N

O
O

O
O

N

O

N


O

O

(17) Beauvericin A
CH2CH3

(18) Beauvericin B

N

O
O
N

N
O

O

O
O

O
O

O

O

N
N

N O N

HO
O
OH OH
OH OH

NH2
N NH
2

N

N
N
N N
HO
N O N
HO
O

O


12
Hydroethyladenosine
(24) Dideoxyadenosine


NH2
O

(25) Cordycedipeptide A

(27) 3,6di(4-hydroxy)
benzyl-2,5- HO

H
O

O

(26)3-isopropyl-6-isobutyl
2,5-dioxopiperazine

O

H
N

OH
O

N
H

dioxopiperazine


Gần đây, Jia J. M. và cộng sự [27] đã phân lập từ loài Cordyceps
sinensis hai hợp chất mới cordyceamide

A, cordyceamide

B và

aurantiamide.
OH
O

O

HO

HN

N
H
O

O
O

(32) Cordyceamide A

HO

HN



OH

HO

O

H
N

O

O

OH
O

O
N
H

Quan trọng hơn là trong sinh khối Đông trùng hạ thảo có nhiều chất
hoạt động sinh học mà các nhà khoa học đang phát hiện dần dần ra nhờ
các tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất t ự nhiên. Nhi ều ho ạt ch ất n ày
có giá trị dược liệu thần kỳ như axit cordiceptic, cordycepin, adenosine,
hydroxyethyl - adenosine và đặc biệt là nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy Ethyl - Adenosine - Analogs) [17], [18].
Kredich

N.M.



HN

O
NH2

N
H

H2N

Homocitrullylaminoadenasine
OHC
(37) Cordyformamide

OH
NH

HO

OH
HN

HO

CHO

hợp

chất

CO2CH3

OH
CH3

OH

O

HO

HO

CH3

(40) Cordyol C

(41) Diorcinol

OH

OH

CH3

OH

O
H 3C



Seephonkai P., và cộng sự [43] đã phân lập 1 propolone từ nấm ký
sinh trên công trùng Cordyceps sp. BBC 1681,
O
OH
HO
O


16
(44) Cordytropolone
1.1.3. Sử dụng và hoạt tính sinh học [1], [5],
Từ lâu, Đông trùng hạ thảo vẫn được xem là bài thuốc quý cho y học
phương Đông. Cho tới bây giờ, người Việt Nam và cả thế giới cũng còn chưa
biết nhiều về loài dược liệu này nhưng ở Trung Quốc, các danh y đã sử dụng
Đông trùng hạ thảo trong các bài thuốc của mình từ hơn 2.000 năm trước.
Đông trùng hạ thảo có nguồn gốc từ cao nguyên Thanh Tạng - Trung
Quốc. Trước thời Hán, dân tộc Tạng phát hiện ra m ột loại dược ph ẩm có tên
gọi địa phương là “Ya Zha Geng Bu” điều trị bệnh phổi, khi nhà vua
Songzain Gambo đến kinh thành Trường An thành hôn với công chúa V ăn
Thành, Ya Zha Geng Bu đã đến Trung Nguyên, góp phần điều trị bệnh tật
cho các dân tộc, loại dược phẩm này đã được ghi vào sách “Nguyệt Vương
Dược Chẩn” vào thế kỷ thứ VIII trước Công nguyên.
Do loại thực vật này sinh sống trên vùng đất giá rét cao nguyên, có
hình dạng như con trùng nên dân tộc Hán còn gọi nó l à Trùng Tuy ết. Trong
“Bản thảo cương mục” của nhà y dược học nổi tiếng đời Minh - ông Lý Th ời
Trân ghi nhận: Trùng Tuyết “Cam hạn vô độc ”, có tác dụng đi ều trị bệnh
“giải nội nhiệt khát”. Đến đời Thanh, căn cứ vào đặc tính về hình d ạng
“mùa đông là trùng, mùa hạ là thảo” của Trùng Tuyết ng ười ta g ọi nó l à
“Đông Trùng Hạ Thảo”. Danh y đời Thanh - ông Ngô Ngh ĩa L ạc trong sách

trùng hạ thảobắt đầu xuất hiện vào khoảng sau thế k ỷ thứ 10, khi nh ững
người Hán đầu tiên đặt chân lên cao nguyên Tây Tạng, tận mắt nhìn thấy
loài thuốc này sinh trưởng, tồn tại và phát triển trong thiên nhiên hoang dã.
Đông trùng hạ thảo(các tên khác là Trùng thảo, Đông trùng th ảo, mùa Đông
có dạng con sâu, mùa hạ mọc thành cây cỏ) là một loài thực vật thuộc h ọ
nấm. Đông trùng hạ thảodo chất đệm nấm mọc dính liền vào đầu sâu non
mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3-5cm, đường kính
khoảng 0.3-0.8cm. Bên ngoài có mầu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng
20-30 vằn khía, vằn khía ở phần đầu nhỏ hơn. Phần đầu có m ầu nâu đỏ,
đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân. Chất đệm n ấm hình que
cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non m ột chút. Sâu non d ễ b ẻ gãy,
ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; ch ất đệm nấm khá dai v à bên
trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà. Vào mùa đông, sâu n ằm d ưới đất,
nấm phát triển và hút chất bổ toàn thân làm sâu chết. Đến mùa hạ, nấm mọc
chồi khỏi mặt đất, hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4-11cm, nhưng gốc
vẫn dính liền vào đầu sâu. Khi thu hoạch Đông trùng hạ thảo, người ta
thường đào lấy cả xác sâu lẫn nấm.
Theo Toan Ánh trong cuốn Phong tục Việt nam t ừ bản thân đến gia
đình, ngoài Bắc ta có ăn: “Đông trùng hạ thảo ăn béo ngầy ngậy. Ta cho đây
là một món ăn bổ. Đông trùng hạ thảocòn được dùng để ngâm rượu như


18
ngâm rượu thuốc”. Một số bác sĩ Việt Nam cho biết hiện nay cũng có vài
người bị ung thư dùng Đông trùng hạ thảophụ trợ với hóa h ọc và x ạ tuy ến tr ị
liệu hiện đại, tuy không chữa lành nhưng có thấy hiệu quả trong s ự nâng đỡ
và bồi bổ thể trạng giúp cho bịnh nhân chịu đựng cầm cự với t ử th ần lâu d ài
hơn.
Trong Đông y, Đông trùng hạ thảo được liệt vào danh sách những loài
thuốc quý hiếm nhất, khó tìm nhất. Theo Bản thảo cương m ục viết năm

trên sâu non của một loài sâu thuộc họ sâu Cánh bướm. Nấm và sâu hợp sinh
với nhau. Vào mùa đông, con sâu non nằm dưới đất, nấm phát triển vào toàn
con sâu để hút chất trong con sâu làm cho con sâu chết. Đến mùa hạ, nấm
sinh cơ chất (stroma) mọc chồi khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính liền vào
đầu sâu, đào lấy tất cả xác sâu và nấm mà dùng.
Vị thuốc bao gồm cả nấm và sâu, hái vào tháng 6 – 7. Rửa sạch, phơi
khô, phun rượu vào rồi phơi khô hẳn. Bó thành từng bó 10 – 15 con một.
Ngang chỗ nấm, người ta buộc sợi chỉ đỏ trông rất đẹp [1], [5].

Hình
1.2: Ảnh của
Đông trùng hạ
thảo
(Cordyceps sp1)
Vị thuốc
như vậy gồm có
phần sâu non
dài 2.5 – 3 cm, đường kính 3 – 5 mm, màu vàng nâu hay xám nâu. Từ đầu
con sâu mọc ra một thân nấm hình trụ đặc biệt có khi 2 hay 3 con sâu. Thân
nấm thường dài 3 – 6 cm, đặc biệt có thể dài 11cm. Phía dưới thân nấm có
đường kính1.5 – 4mm, phía trên to phình ra, cuối cùng lại thon nhọn, cả
phần này dài 10 – 45mm, đường kính 2.5 – 6mm. Nếu còn non thì đặc, nếu
già thì thân rỗng. Dùng kính hiển vi, ta sẽ thấy phần phình to này có vỏ sần
sùi, có những hạt nhỏ tức là tử nang xác nổi lên. Phần đầu thon nhọn không
mang tử nang xác và dài 0.5 – 3.5mm.
1.2.2. Thành phần hoá học của đông trùng hạ thảo (Cordyceps sp1)
Chưa được nghiên cứu.


20

theo phương pháp của Samson [42]. Đặc điểm hình thái của bào tử, sợi nấm,
cấu trúc quả thể và một số đặc điểm sinh học khác được đánh giá, nhận dạng
các loài nấm ký sinh côn trùng theo phương pháp của Luangsa-ard và cộng
sự [38].
2.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các
hợp chất
Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sử dụng
các phương pháp sắc ký như:
- Sắc ký khí (GC)
- Sắc ký khí- khối phổ (GC-MS)
- Sắc ký cột (CC).
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích.
- Các phương pháp kết tinh phân đoạn.
2.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương
pháp phổ:
- Phổ tử ngoại (UV)
- Phổ hồng ngoại (IR)
- Phổ khối lượng va chạm electron (EI - MS).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR.
- Phổ DEPT.


22

Chương 3
THỰC NGHIỆM
3.1.Thiết bị và phương pháp
3.1.1. Hoá chất

Việc phân tích định tính được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký
khí và phổ ký liên hợp GC/MS của hãng Agilent Technologies HP 6890N.
Agilent Technologies HP 6890N/ HP 5973 MSD được lắp với cột tách mao
quản và vận hành sắc ký như ở trên với He làm khí mang.
Việc xác nhận các cấu tử được thực hiện bằng cách so sánh các dữ
kiện phổ MS của chúng với phổ chuẩn đã được công bố có trong thư viện
Willey/Chemstation HP.
3.1.2.3. Sắc ký bản mỏng
Sắc ký bản mỏng phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính
silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm.
Hiện màu: hơi Iot và đèn UV 254 nm.
3.1.2.4. Sắc ký cột
Sắc ký cột thường, sử dụng silicagel cỡ hạt 230-400/mesh.


24
3.2. Dụng cụ và thiết bị
- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetius.
- Phổ tử ngoại UV được ghi trên máy Agilent.
- Phổ hồng ngoại IR ghi trên máy Bruker.
- Phổ khối lượng va chạm electron EI-MS được ghi trên máy ghi trên
máy Agilent Technologies 5973.
-Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker
500MHz, phổ 13C-NMR và DEPT trên máy Bruker 125 MHz.
3.3. Nghiên cứu các hợp chất từ đông trùng hạ thảo
3.3.1. Nghiên cứu thành phần hoá học dầu béo
Nấm được nuôi cấy trong môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
(5L), ở nhiệt độ 25 - 260C trong 14 ngày, được lọc, rửa với nước bằng phễu
lọc chân không. Sau khi lọc chiết với metanol, quay cất chân không thu
được dịch dầu thô (25g). Dịch dầu này được phân tách trên bằng sắc ký nhồi

nước