VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

-----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG
VI KHUẨN PHOTOBACTERIUM DAMSELAE GÂY BỆNH TỤ HUYẾT
TRÙNG Ở CÁ BIỂN NUÔI LỒNG TẠI HẢI PHÒNG

Giáo viên hướng dẫn: TS. Phạm Thị Tâm
Sinh viên thực hiện: Trương Thu Hương
Lớp: 1102

Hà Nội – 2015


LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Phạm Thị
Tâm, người đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt em trong suốt quá trình em thực tập và
hoàn thành khóa luận này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ thuộc Khoa
Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho
em có thể thực tập và hoàn thành khóa luận này..
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân đã luôn ở
bên em cổ vũ, động viên, cảm ơn các anh-chị, bạn bè trong phòng thí nghiệm Vi
Sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã luôn tận tình giúp đỡ
trong suốt thời gian em thực tập và hoàn thiện đề tài này.

1.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................................................ 9
1.3.4. Đặc điểm gây bệnh của Photobacterium damselae ..................... 10
1.3.5. Độc tố vi khuẩn và cơ chế gây bệnh............................................ 13
1.3.6. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Photobacterium
damselae .............................................................................................. 14
1.3.7. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Photobacterium
damselae .............................................................................................. 15
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 16
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ....................................................... 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................. 16


2.1.2. Động vật thí nghiệm ................................................................... 16
2.1.3. Môi trường và hóa chất ............................................................... 16
2.1.4. Thiết bị và dụng cụ ..................................................................... 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 21
2.2.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu ................................................... 22
2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn P.damselae ............................... 22
2.2.3. Phương pháp hóa sinh ................................................................. 24
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tính kháng kháng sinh của một số chủng
vi khuẩn P.damselae phân lập ............................................................. 25
2.2.5. Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm ............................. 26
2.2.6. Phương pháp đánh giá sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự
phát triển và khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P.damselae................. 26
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................... 27
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên cá
biển nuôi lồng........................................................................................... 27
3.2. Xác định sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển và
khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P.damselae .................................. 31
3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy ............................ 32


PCR

Polymerase Chain Reaction

D

Đường kính

R

Resistant

I

Intermediate

S

Susceptible

OD (đo mật độ quang
học)

Optical Density


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Biểu đồ nuôi trồng thủy sản toàn cầu theo vùng năm 2012 ............. 4
Hình 1.2. Biểu đồ sản lượng thủy sản Việt Nam qua các năm 1995-2012 ...... 6



MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản (NTTS) đã không ngừng phát

triển và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành Thủy sản nói riêng và kinh tế
đất nước nói chung. Với kim ngạch xuất khẩu năm 2010 đạt 4,94 tỷ USD, thủy sản
là một trong ba ngành có đóng góp lớn nhất cho tổng kim ngạnh xuất khẩu của Việt
Nam. Trong sự phát triển chung của ngành NTTS thì nuôi biển được coi là chiến
lược hàng đầu và mở ra nhiều hứa hẹn với mục tiêu xuất khẩu trong tương lai. Các
đối tượng nuôi biển chủ yếu là cá, tôm hùm, động vật thân mềm và rong biển trong
đó cá có nhiều tiềm năng để phát triển nuôi với quy mô công nghiệp. Thống kê của
Bộ Thuỷ sản năm 2006, số lồng nuôi cá biển ở nước ta có 16.319 lồng, tổng sản
lượng cá nuôi đạt 3.508 tấn. Trong đó, vùng nuôi tập trung chủ yếu ở Hải Phòng
(Vịnh Lan Hạ, Bến Bèo - Cát Bà) có 6.000 lồng, với sản lượng nuôi 1.200 tấn;
Quảng Ninh (Vịnh Hạ Long) có 5.700 lồng, với sản lượng đạt 1.300 tấn; Kiên Giang
(huyện đảo Phú Quốc) có 131 lồng, sản lượng nuôi đạt 90 tấn.
Tuy nhiên, khi nghề nuôi cá biển phát triển thì người nuôi cũng gặp không ít
khó khăn, trong đó, vấn đề lo ngại lớn nhất là dịch bệnh gây ra trên cá. Qua một số
nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cá biển nuôi lồng
thường là virus, nấm và vi khuẩn trong đó nguy hiểm nhất là bệnh tụ huyết trùng
(xuất huyết nhiễm trùng) do vi khuẩn Photobacterium damselae gây ra. Vi khuẩn
tấn công và gây bệnh trên cá biển nuôi ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ giai
đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm. Khi bị bệnh cá có thể biểu hiện ở
dạng mãn tính và cấp tính, biểu hiện bệnh tụ huyết trùng như: gây loét trên da, xuất
hiện các nốt kem trắng hoặc u hạt tubercules màu trắng ở một số cơ quan nội tạng,
gây hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng và

Phân lập và xác định được các đặc tính sinh học điển hình của vi khuẩn
Photobacterium damselae.
2.2. Mục tiêu cụ thể
-

Phân lập được 06-08 chủng vi khuẩn P.damselae từ mẫu bệnh phẩm một số

loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) nghi mắc bệnh tụ huyết trùng ở cá biển nuôi
lồng tại Cát Bà.
-

Xác định được các đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn P. damselae phân lập

được: khả năng sinh enzym catalase, tryptophanase, khả năng sử dụng các loại
đường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh hơi, khả năng gây dung huyết.
-

Xác định khả năng gây bệnh của các chủng P.damselae phân lập.

-

Xác định tính kháng kháng sinh của các chủng P.damselae phân lập.

2


3.

Ý nghĩa của đề tài


tổng sản lượng và 77% tổng giá trị sản phẩm thủy sản nuôi trồng thế giới năm 2006.
Năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản thế giới là 51 triệu tấn và sản lượng
khai thác là 92 triệu tấn. Trong số này, Trung Quốc chiếm 66,7% tổng sản lượng
nuôi, các nước Châu Á khác chiếm 22,8%, và các nước khác còn lại ở Châu Âu,
Châu Mỹ, Úc,… chiếm 10,5% [1,5].

Hình 1.1. Biểu đồ nuôi trồng thủy sản toàn cầu theo vùng năm 2012
Trong những năm qua, sản lượng nuôi trồng thủy sản thế giới tăng trưởng với
tốc độ vừa phải. Theo báo cáo mới nhất của FAO, năm 2012, sản lượng nuôi trồng
thủy sản đạt mức cao kỷ lục, 90,4 triệu tấn, tương đương 144,4 tỷ đô la Mỹ; trong
đó có 66,6 triệu tấn thủy sản các loại (137,7 tỷ đô la Mỹ) và 23,8 tỷ tấn thực vật

4


thủy sinh nuôi(chủ yếu là tảo biển), tương đương 6,4 triệu đô la Mỹ. Các đối tượng
nuôi bao gồm cá có vẩy, động vật giáp xác, động vật thân mềm, ếch, bò sát (không
tính cá sấu) và các loài thủy sản khác phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng của con người.
Năm 2013, sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 70,5 triệu tấn, tăng 5,8%; trong đó,
sản lượng các loài thực vật thủy sinh là 26,1 triệu tấn.
Sản lượng nuôi trồng thủy sản chiếm tỷ trọng ngày càng tăng trong tổng sản
lượng thủy sản toàn cầu (158 triệu tấn), từ 20,9% năm 1995 lên 32,4% năm 2005 và
40,3% năm 2010 và ở mức cao kỷ lục là 42,2% trong năm 2012. Châu Á chiếm tỷ
trọng cao nhất trong tổng sản lượng nuôi toàn cầu 54%, châu Âu chiếm 18% và các
châu lục còn lại
Trong giai đoạn 1995-2012, sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng
trưởng liên tục với mức tăng bình quân là 9,07%/năm. Đến năm 2014, tổng sản
lượng thủy sản đạt 6,3 triệu tấn, trong đó nuôi trồng thủy sản đạt 3,6 triệu tấn; giá trị
xuất khẩu thủy sản đạt 7,92 tỷ USD, tăng 18% so với năm 2013, góp phần thúc đẩy
phát triển nền kinh tế của cả nước và đem lại nhiều lợi nhuận cho người dân. Tuy
nhiên, tình hình dịch bệnh thủy sản vẫn còn xảy ra ở nhiều nơi [3]. Theo Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2014, kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản đạt trên
7,9 tỷ USD, tăng 18% so với năm 2013 và vượt 13% so với mục tiêu 7 tỷ USD. Đây
được xem là con số ấn tượng của ngành thuỷ sản trong năm 2014 và vượt qua
những kịch bản lạc quan nhất. Tuy nhiên, theo nhiều chuyên gia, xuất khẩu thuỷ
sản, năm 2015 ngành này vẫn còn nhiều khó khăn do chưa giải quyết triệt để những
tồn tại và còn phụ thuộc nhiều vào yếu tố thị trường bên ngoài [6].

6


1.2. Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae
1.2.1. Lịch sử phát hiện bệnh trên thế giới
Bệnh tụ huyết trùng (pseudotuberculosi) hay còn được gọi là xuất huyết
nhiễm trùng, gây ra bởi vi khuẩn ưa mặn Photobacterium damselae (P.damselae).
Nó lần đầu tiên được phân lập từ các quần thể cá rô trắng (Morone americanus)
hoang dã và cá vược (M. saxatilis) vào năm 1963 ở vịnh Chesapeake, Hoa Kỳ, hiện
là tác nhân gây bệnh của nhiều loại cá biển. Căn bệnh này có ảnh hưởng lớn về kinh
tế cả ở Nhật Bản, và ở khu vực Địa Trung Hải, do nó gây ra thiệt hại trong các trang
trại cá tráp và cá chẽm [26]. Từ năm 1969, căn bệnh này đã là một trong những
bệnh nguy hiểm tại Nhật Bản (Kusuda & Yamaoka, 1972). Từ năm 1990 nó đã gây
ra thiệt hại về kinh tế ở các nước châu Âu khác nhau trong đó có Pháp, Ý, Tây Ban
Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Bồ Đào Nha và Malta [24].
Bệnh lý bùng phát phụ thuộc vào nhiệt độ và thường xảy ra khi nhiệt độ
nước tăng lên trên 18-20°C. Dưới nhiệt độ này, cá ở tình trạng ủ bệnh (Romalde,

1.3. Tổng quan về vi khuẩn Photobacterium damselae
1.3.1. Phân loại khoa học
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Vibrionales
Họ: Vibrionaceae
Chi: Photobacterium
Loài: Photobacterium damselae
Theo Love và các cộng sự, ban đầu Photobacterium damselae được mô tả như
một loài Vibrio gây bệnh mới, gây lở loét ở Chromis punctipinnis. Kể từ đó, các báo
cáo về khả năng gây bệnh đối với nhiều loài cá khác nhau (cá bơn, cá hồi vân, cá
tráp, cá vược, cá mập) và động vật có vú (cá heo, con người) đã tăng lên rất nhiều.
Ban đầu, P.damselae được mô tả như Vibrio damselae, sau đó chúng được phân
loại lại là một thành viên trong chi Listonella. Đến năm 1991, được chuyển giao cho
các chi Photobacterium. Trong một nghiên cứu sau đó của Gauthier và các cộng sự
(1995) về các tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng ở một số loài cá đã xác định chủng

8


vi khuẩn này là một thành viên của Photobacterium damselae bằng phương pháp
phân tích loài theo các trình tự 16S rDNA và DNA [18].
1.3.2. Đặc điểm hình thái

Hình 1..3. Hình thái vi khuẩn P.damselae dưới kính hiển vi điện tử
Photobacterium damselae là trực khuẩn Gram âm, kích thước khoảng 0.5 - 0.8
µm x 0.7 - 2.6 µm, lưỡng cực [10].
1.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Về điều kiện nuôi cấy, vi khuẩn phát triển tốt nhất trên môi trường có nồng độ


Esculin

-

Ornithine

-

Lysine

V

Indole

-

Catalase

+

Gelatinase

-

Khử Nitrat

+

Sử dụng citrate


-

Phát triển ở nhiệt độ:
4°C

V

35°C

+
(+) dương tính; (-) âm tính; (V) dương tính hoặc âm tính

1.3.4. Đặc điểm gây bệnh của Photobacterium damselae
Gây bệnh trên cá:
Rất nhiều báo cáo khoa học đề cập đến bệnh do Photobacterium damselae
(P.damselae) trên cá biển nuôi công nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới. Các loài
cá tự nhiên (cá Trinh nữ, cá da trơn, cá Mập, cá Đuối gai độc, vv…), cũng như các

10


loài cá có tầm quan trọng kinh tế trong nuôi trồng thủy sản (cá Mú, cá Giò, cá Tráp,
cá Bống bớp, cá Vược) đã chịu rất nhiều thiệt hại do P.damselae gây ra [7].
Các báo cáo gần đây về sự cô lập của tác nhân gây bệnh này từ cá biển bị bệnh
trên các loài nuôi mới, cho rằng P.damselae có thể được coi như là một tác nhân
gây bệnh mới nổi trong nuôi trồng thủy sản biển (Labella et al, 2011).
P.damselae được tìm thấy nhiều hơn trong các loài cá biển trong những tháng
thời tiết ấm áp, khi hầu hết các dịch truyền nhiễm đã lây lan. Phát hiện này cho thấy
P. damselae đã xuất hiện ít nhiều trong cá khỏe mạnh được nuôi trong cùng khu vực

và điều trị phẫu thuật. Trong một trường hợp tử vong được báo cáo trong năm 1984,
một bệnh nhân đã bị thương trong khi xử lý cá da trơn, vết thương xảy ra trên tay và
hiện tượng phù nề đã lan rộng ra cẳng tay trong vòng chưa đầy 24 giờ [12]. Trong
một trường hợp tử vong khác được báo cáo, một bệnh nhân bị thương trong khi xử
lý cá, chủng vi khuẩn P.damselae được phân lập trong môi trường nhân tạo từ các
mẫu vết thương của người này nhưng không được phân lập từ mẫu máu [17].
Những đối tượng trong nhóm này đều có sức khỏe bình thường và chỉ bị nhiễm
bệnh khi có các vết thương hở tiếp xúc với mầm bệnh. Thông qua các dữ liệu và
quan sát cho thấy rằng, sự lây nhiễm từ cá bệnh đem lại nguy cơ rất cao gây hại cho
sức khỏe con người và những người suy giảm miễn dịch có nguy cơ lây nhiễm lớn
hơn đặc biệt là nếu họ bị thương trong khi chế biến xử lý cá. Do đó các cá nhân nên
thực hiện theo biện pháp phòng ngừa thích hợp, chẳng hạn như đeo găng tay và sử
dụng xà phòng kháng khuẩn [12].
Hiện nay, trên thế giới đã xuất hiện rất nhiều trường hợp bệnh nhân bị nhiễm
P.damselae với tỷ lệ tử vong cao.
-

Dịch tễ học
P.damselae tồn tại trong môi trường nước mặn, bắt buộc phải có Na+, chúng

được tìm thấy quanh năm nhưng chưa có một kết luận nào về mùa vụ phát triển
bệnh của nó . Tuy nhiên, vào mùa đông thì số lượng vi khuẩn rất ít, có thể phân lập
khi sử dụng môi trường tăng sinh chọn lọc.
P.damselae cũng được phân lập từ lớp dịch nhầy, chất bẩn tích tụ trong lồng
nuôi hoặc từ mẫu nước nuôi cá bị bệnh. Cá sống sót sau dịch bệnh có thể trở thành
nguồn mang mầm bệnh P.damselae trong nước [28].
Cá có thể được gây nhiễm bằng cách tiêm, ngâm, cho ăn thức ăn chứa vi
khuẩn, nuôi chung cá khoẻ với cá bệnh.
-


(Finkelstein et al., 1992; Silva et al., 2003). Tuy nhiên, Osorio và các cộng sự
(2000) đã chứng minh rằng sự có mặt của các sản phẩm ngoại bào này không phải
là điều kiện quyết định cho khả năng phát sinh độc lực gây bệnh của chủng vi khuẩn
này. Một số protease trong sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn cũng được coi là yếu
tố độc lực ở nhiều vi khuẩn gây bệnh (Ishihara et al., 2002; Miyoshi et al., 2002;

13


Farto et al., 2006). Protrease hạn chế sự hoạt động của enzym đã được phát hiện ở
P.damselae bao gồm cả phosphatases, esteraza, amylase và glycosidases [34].
Rất ít thông tin về các yếu tố độc lực của P. damselae gây nhiễm trùng huyết ở
động vật thủy sản và con người. Một thông tin ban đầu đã được quan sát thấy giữa
khả năng gây bệnh của P.damselae ở chuột và cho sản lượng lớn một độc tố tiêu tế
bào. Chuẩn bị dly lấy từ phần tinh khiết trong môi trường nuôi cấy cho thấy khả
năng chống lại hồng cầu của 16 loài động vật homeotherm, và chuột là loài động vật
nhạy cảm hơn. Các nghiên cứu khác đã báo cáo rằng các sản phẩm ngoại bào của vi
khuẩn này cũng có hoạt tính gây dung huyết trên hồng cầu cá bơn. Một đặc tính sâu
sắc hơn về dly cho thấy nó có hoạt động D-phospholipase chống sphingomyelin,
phosphatidylcholine và phosphatidylethanolamine. Các gen độc tố dly, được nhân
bản vô tính và trình tự của nó đã được xác định. Tuy nhiên, bối cảnh của bộ gen của
gen dly vẫn khó nắm bắt, các quan sát ban đầu thấy rằng chủng cao huyết tán mang
lại đột biến tự phát và giảm đáng kể hoạt động tán huyết khi đã bị mất gen dly [13].
Nghiên cứu ban đầu đã chứng minh rằng, ảnh hưởng lớn nhất của khả năng
dung huyết của P.damselae gây nguy hiểm cho chuột. Trên thực tế, các nghiên cứu
trước đây đã báo cáo rằng liều gây tử vong cho người, cá gần như giống nhau đến
50% liều gây tử vong cho chuột. Các nghiên cứu khác đã báo cáo rằng, các chủng
thiếu gen dly vẫn cho thấy tính độc đối với chuột và cá, điều này chỉ ra rằng dly
không phải là một điều kiện tiên quyết cho độc lực vi khuẩn này [14, 21, 24]. Ngoài
ra, các sản phẩm ngoại bào của chủng độc lực không có sự hiện diện của gen dly

1.3.7. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Photobacterium damselae
Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện P.damselae như dựa vào
quan sát hình thái dưới kính hiển vi điện tử, các đặc tính sinh hóa và các kỹ thuật
sinh học phân tử như PCR, RAPD…
Theo Kudo và cộng sự, các loài P.damselae khi nuôi cấy trên môi trường chọn
lọc Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) có khuẩn lạc màu xanh lá cây
[28]. Ngoài ra, P.damselae còn phát triển trên môi trường khác là môi trường thạch
nước biển cho thấy các khuẩn lạc có màu nâu đỏ hoặc trắng đục, trơn, tròn và lồi.

15


PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu cá biển có các biểu hiện của bệnh tụ huyết trùng được thu thập ở
vùng biển quanh khu vực đảo Cát Bà.
2.1.2. Động vật thí nghiệm
Động vật thí nghiệm: Cá mú có trọng lượng 50-100g, khỏe mạnh được nuôi
trong bể nuôi phòng thí nghiệm.
2.1.3. Môi trường và hóa chất
Một số môi trường sử dụng cho phân lập và nuôi cấy
-

Môi trường Marine agar
Thành phần

Khối lượng

Peptone


Sodium Bicacbonat

0,16g

Potassium Bromide

0,08g

Chloride Strantium

34mg

Acid Boric

22mg

Sodium Silicat

4mg

Sodium Fluorid

2,4mg

Ammonium nitrat

1,6mg

Disodium Phosphate


Polypeptone

10 g

NaCl

5g

Na2HPO4

2,5 g

Dextrose

2g

Nước cất

1000 ml

Môi trường Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS)
Thành phần

Khối lượng

Peptone

10 g


20 g

Dung dịch xanh thymol

4 ml

1%

17


Dung dịch xanh

20 ml

bromothymol 0,2%
Thạch sợi

-

15 g

Môi trường Indol:
Thành phần

Khối lượng

Tryptone

2%