bộ y tế

chơng trình 33

trờng đại học y hà nội

báo cáo
tổng kết đề tài nhánh
Nghiên cứu những biến đổi di truyền (nhiễm sắc thể) ở các
đối tợng bị ảnh hởng do phơi nhiễm với chất độc hóa học
trong chiến tranh và các thế hệ tiếp theo (F1, F2) của họ.
CHủ NHIệM Đề TàI NHáNH: Gs. Trịnh Văn Bảo

thuộc đề tài cấp nhà nớc:
nghiên cứu các biến đổi về mặt di truyền, miễn Dịch,
sinh hoá, huyết học và tồn lu dioxin
trên các đối tợng phơi nhiễm có nguy cơ cao.
chủ nhiệm đề tài: pgs.ts Nguyễn văn Tờng
CƠ QUAN CHủ QUảN: bộ Y Tế
cơ quan CHủ TRì : TRƯờNG ĐạI HọC Y Hà NộI

hà nội 2003

5462-1
13/10/2005

0


đặt vấn đề
Trong cuộc chiến tranh ở Việt Nam, quân đội Mỹ đã sử dụng các chất



Với nhận thức: Việt Nam đã và đang chịu ảnh hởng nặng nề của
cuộc chiến tranh hoá học do quân đội Mỹ thực hiện, các nghiên cứu kỹ càng
và đồng bộ nhiều mặt tác hại và hậu quả của cuộc chiến tranh đó để có
những nhận xét, kết luận thực tế ở Việt Nam nhằm chăm sóc, bảo vệ sức
khoẻ cộng đồng. Trong khuôn khổ đề tài cấp nhà nớc "Nghiên cứu các
biến đổi về mặt di truyền, miễn dịch, sinh hóa, huyết học và tồn lu dioxin
trên các đối tợng phơi nhiễm có nguy cơ cao" đề tài nhánh "Nghiên cứu
các biến đổi về mặt di truyền.." đợc thực hiện với mục tiêu sau:
1. Xác định tần số các dạng đột biến nhiễm sắc thể ở nhóm chứng và
nhóm phơi nhiễm.
2. Xác định tần số trao đổi chromatid chị em ở nhóm chứng và nhóm
phơi nhiễm.
3. Xác định bộ nhiễm sắc thể ở một số đối tợng bị dị tật bẩm sinh.

2


I. tổng quan tài liệu
1.1. Tác nhân gây đột biến.
Các tác nhân trong môi trờng bao gồm các tác nhân môi trờng vĩ
mô và tác nhân môi trờng vi mô. Sự ô nhiễm của môi trờng toàn cầu hay
ở từng địa phơng với những tác nhân vật lý, hoá học, sinh học khác nhau
cũng nh những bất thờng tinh vi trong quá trình chuyển hoá vật chất trong
cơ thể, trong tế bào đều có thể dẫn đến những bất thờng của cơ thể. Sự trả
lời của cơ thể đối với những thay đổi đó trong đa số trờng hợp là sự thích
nghi để tồn tại và phát triển, nhng trong nhiều trờng hợp cơ thể không
thích nghi đợc và những bất thờng của cơ thể xuất hiện trong đó có những
bất thờng của tế bào:

những biến đổi của kiểu hình ở những mức độ khác nhau.
1.2. Đột biến nhiễm sắc thể.
Nh đã biết nhiễm sắc thể chỉ hình thành rõ rệt khi tế bào phân chia,
còn tế bào ở gian kỳ (interphasis) trong nhân tế bào chỉ có thể quan sát thấy
chất nhiễm sắc (chromatine).
Vào năm 1956 Tjio và Levan [28] đã xác định chính xác số lợng
nhiễm sắc thể ở tế bào soma của ngời là 2n = 46. Năm 1960 Moorhead và
cộng sự [19] đã đề xuất phơng pháp nuôi cấy tế bào lympho ở máu ngoại
vi của ngời để quan sát nhiễm sắc thể với sự sử dụng PHA
(Phytohemagglutinin) đợc chiết xuất từ Phaseolus vulgaris để kích thích
chuyển dạng lympho bào. Từ đó đến nay, phơng pháp này đợc sử dụng
rộng rãi trong các phòng di truyền tế bào để nghiên cứu nhiễm sắc thể với
những cải tiến nhỏ tuỳ từng phòng thí nghiệm.
1.2.1. Phơng pháp nghiên cứu nhiễm sắc thể.
1.2.1.1. Nghiên cứu nhiễm sắc thể ở gian kỳ.
Nh đã nêu ở trên, ở gian kỳ nhiễm sắc thể tồn tại ở dạng chất nhiễm
sắc. Đã có phơng pháp chính đợc đề xuất để nghiên cứu NST ở gian kỳ
này:

4


- Kỹ thuật phát hiện vật thể Barr: phát hiện chất nhiễm sắc giới tính
(biểu hiện cho một NST X không hoạt động sinh lý) để tham gia xác định sự
bất thờng của cặp NST giới tính.
- Kỹ thuật phát hiện vật thể Y: phát hiện vùng chất nhiễm sắc bắt màu
huỳnh quang đậm của NST Y để tham gia xác định sự bất thờng của NST
Y.
- Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (FISH): phát hiện sự bất thờng
của một NST nào đó tùy thuộc vào Kit đợc dùng.

nhuộm ở phần tâm (centromere); băng R: sự phân bố của các băng sẫm và
nhạt ngợc lại với băng G.
- áp dụng kỹ thuật FISH với NST ở metaphase hoặc intermetaphase.
Thờng đợc dùng để xác định một kiểu hình bất thờng nào đó
tơng ứng với kit ADN đã có. Sự bổ sung của ADN đích trên NST với kit
ADN sẽ đợc phát hiện bằng phơng pháp lai tại chỗ với các loại phẩm
nhuộm huỳnh quang thích hợp.
- áp dụng kỹ thuật nhân nhỏ ở tế bào lympho của ngời
(Micronucleus test)
Kỹ thuật này đợc Countryman và Headle đề xuất vào năm 1976 [8].
Nhân nhỏ đợc hình thành do sự kết đặc của các đoạn NST bị đứt
không mang tâm động, hoặc do có các NST bị thất lạc trong quá trình di
chuyển ở kỳ sau. Có thể nói nhân nhỏ là hình ảnh của các rối loạn cấu trúc
và rối loạn NST xảy ra trong lần phân bào trớc. Nhân nhỏ chỉ biểu hiện ở
các tế bào đang phân chia. Nhân nhỏ có thể quan sát thấy ở tế bào tạo hồng
cầu của tuỷ, ở tế bào lympho. Với việc dùng cytochalasin B để ức chế sự
phân chia của tế bào chất có thể quan sát các nhân nhỏ (nếu có đột biến) ở
các tế bào có hai nhân.
1.2.1.3. Phơng pháp trao đổi chromatid chị em (Sister Chromatid
Exchange = SCE).
Phơng pháp này đợc Perry và cs đề xuất vào năm 1974.
Bằng cách dùng 5 - Bromodeoxyuridin (5 - BrdU) và các tiền xử lý để
nhuộm hai chromatid chị em, từ đó quan sát thấy các trao đổi giữa hai
chromatid cũ và mới. Sự trao đổi này thể hiện các biến đổi bên trong NST ở
các locus tơng đồng của hai chromatid bao gồm sự đứt ra và nối lại của
từng phần của hai chromatid chị em trong chu kỳ tế bào. Tần số trao đổi

6




cấu trúc ở dạng chromatid (chromatide type). Đột biến cấu trúc dạng
chromatid gồm: gap (hoặc khuyết, nhạt), đứt đơn (break), trao đổi
chromatid tạo thành hình 3 cánh (triradial) hoặc 4 cánh (quadriradial).
+ Nếu các tác nhân gây đột biến tác động vào NST ở giai đoạn ADN
cha nhân đôi (vào giai đoạn G1 của chu kỳ tế bào) thì các đột biến cấu trúc
ở dạng nhiễm sắc thể (chromosome type). Đột biến cấu trúc dạng NST bao
gồm:
- Gap kép hoặc isogap
- Đứt kép.
- NST hình vòng (r = ring).
- NST hai tâm (d = dicentric).
- Nhân đoạn (dup = duplication).
- Các dạng NST chuyển đoạn (t = translocation).
- Các dạng NST đảo đoạn (inv = inversion).
- NST đều (i = isochromosome).
- Đứt đoạn nhỏ (minute).
- Hoặc các NST lạ (mar) cha xác định rõ nguồn gốc.
+ Trong một số trờng hợp cả bộ NST (genome) bị nát vụn hoặc bắt
màu không đều.
1.3. Đột biến NST do tác động của chất da cam / Dioxin.
1.3.1.Các nghiên cứu ở trong nớc.
Các nhà nghiên cứu Việt Nam là những ngời đầu tiên nghiên
cứu tác động của các chất diệt cỏ và làm rụng lá, trong đó có chất da cam /
dioxin lên NST của ngời.
Ngời đầu tiên đặt vấn đề và thực hiện nghiên cứu là giáo s Tôn
Thất Tùng và giáo s Bạch Quốc Tuyên. Trong công trình nghiên cứu Tác
hại của việc sử dụng chất diệt cỏ liên tục và liều cao đến ngời dân thờng
Việt Nam [33] đột biến NST đã đợc nghiên cứu. Công trình đã đợc báo
cáo ở Hội nghị chiến tranh hoá học do Liên đoàn những ngời làm khoa học

Những dẫn liệu khoa học trong các báo cáo trên là những số liệu khoa
học rất có giá trị, những nghiên cứu của các tác giả nớc ngoài hoặc các nhà
nghiên cứu Việt Nam ở các giai đoạn sau không thể có đợc.
Do cách nhìn nhận vấn đề khác nhau, thực hiện nghiên cứu ở các thời
điểm khác nhau, với các đối tợng với mức độ phơi nhiễm khác nhau nên
còn có những kết luận khác nhau. Hội thảo quốc tế lần thứ nhất đã có kết
luận nh sau: "Công trình của các nhà khoa học Việt Nam rất hấp dẫn
9


nhng vì tính gây tranh luận của các y văn đã xuất bản về kết quả di truyền
của các chất diệt cỏ này nên cần có các nghiên cứu thêm ở phòng thí
nghiệm"
Trong hội thảo quốc tế lần thứ hai (1993) về "Chất diệt cỏ trong chiến
tranh, tác hại lâu đối với con ngời về thiên nhiên" một số bản báo cáo khoa
học về di truyền tế bào học đã đợc trình bày. Nguyễn Trần Chiến và Cs [7]
đã giới thiệu tần số trao đổi chromatid chị em và tần số một số dạng đột
biến NST ở 9 ngời đã đợc xác định 2,3,7,8 - TCDD ở mô mỡ dao động từ
5,2ppt đến 34,8ppt. Các tác giả thấy tần số SCE và tần số đột biến NST tăng
cao ở những đối tợng này. Umnova NV và Cs [36] ở Trung tâm nhiệt đới
Việt Nga đã thông báo về tần suất chromatid chị em trong các lymphoxit
máu ngoại vi đợc nuôi cấy của c dân nông thôn tỉnh Sông Bé (nay là tỉnh
Bình Dơng). Bằng phơng pháp nuôi cấy máu 72 giờ và 96 giờ các tác giả
đã ghi nhận sự tăng cao của tần suất tế bào có rối loạn NST, tăng cao tần số
đơn bội và SCE.
Trịnh Văn Bảo và Cs [3] đã nghiên cứu NST ở thế hệ F1 và F2 của
những ngời tiếp xúc với chất độc hoá học trong chiến tranh: 15 trẻ em là
con của những cựu chiến binh đã bị rải CĐHH trực tiếp lên ngời (tuổi
trung bình là (11 5), 15 trẻ em là cháu của các cựu chiến binh đã bị rải
CĐHH trực tiếp lên ngời và 12 trẻ em là cháu của các cựu chiến binh

cứu đột biến NST ở các gia đình có nhiều con bị dị tật hoặc cháu bị dị tật.
1.3.2. Các nghiên cứu ở nớc ngoài.
2,4 - D và 2,4,5 - T là hai thành phần tạo nên chất da cam nên đã có
một số nghiên cứu di truyền tế bào học về hai chất này, chủ yếu là 2,4 - D,
vì chất này đợc sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp. Johnson, 1971 [14]
không thấy sự tăng cao của các dạng đột biến NST ở lympho bào của 10
công nhân sản xuất 2,4 - D; Andreasik và Cs, 1979 [1], Hửgstedt và Cs
1980 [11] cũng có nhận xét tơng tự khi nghiên cứu NST từ lympho bào của
15 công nhân đóng gói 2,4 - D. Nhng Yoder và Cs, 1973 [37], cũng nh
Crossen và Cs, 1978 [9] đã quan sát thấy sự tăng cao của các dạng rối loạn
NST ở lympho bào do tiếp xúc với các hoá chất trừ sâu có chứa 2,4 - D, nhất
là vào các thời vụ phải tiếp xúc nhiều. Bằng phơng pháp phân tích sự trao
đổi chromatid chị em Linnaimaa, 1983 [18] không thấy sự tăng cao tần số
SCE/tế bào ở những ngời phơi nhiễm với 2,4 - D. Lực thống kê của các
nghiên cứu này còn bị hạn chế vì hầu hết các mẫu đợc nghiên cứu không

11


đợc đo độ 2,3,7,8 - TCDD và số mẫu trong các nghiên cứu còn nhỏ. Chính
vì vậy, các kêt luận còn mâu thuẫn và không nhất quán.
Sau sự cố ở Seveso (Italy), các nhà khoa học đã thực hiện các điều tra,
nghiên cứu về di truyền tế bào học. Tenchini và Cs [27] đã thấy sự tăng cao
đáng kể tần số tế bào có rối loạn NST ở tế bào bào thai của các thai sẩy của
các bà mẹ có thể phơi nhiễm với 2,3,7,8 - TCDD. Nhng Reggiani, 1980
[23] không thấy sự tăng cao tần số rối loạn NST ở 17 ngời bị chloracne sau
sự cố Seveso.
Kaye và Cs, 1985 [16] thấy đột biến NST tăng cao ở 10 cựu chiến
binh đã tham chiến ở Việt Nam, nhng Mulcahy và Cs, 1980 [20] không
thấy tần số rối loạn NST và trao đổi chromatid chị em tăng cao ở 15 cựu

về mặt di truyền, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và tồn lu dioxin trên các
đối tợng phơi nhiễm có nguy cơ cao các đối tợng của từng đề tài nhánh
đều thực hiện chung trên cùng nhóm đối tợng chung.
2.1. Địa điểm nghiên cứu:
Đợt nghiên cứu thứ nhất đã đợc thực hiện vào tháng 11 năm 2001 ở
Biên Hoà - Đồng Nai. ở đây có sân bay Biên Hoà; nhiều nghiên cứu với các
mẫu đất ở sân bay Biên Hoà đã xác định có hàm lợng dioxin cao. Đây
cũng là thành phố công nghiệp với nhiều nhà máy, khu công nghiệp rộng
lớn. Ba phờng của Biên Hoà là phờng Trung Dũng, phờng Tân Hạnh,
phờng Tân Phong đã đợc chọn làm địa điểm nghiên cứu. Phờng Trung
Dũng tiếp giáp với sân bay Biên Hoà, nớc từ sân bay chảy ra hồ Biên
Hùng.
Đợt nghiên cứu thứ hai đã đợc thực hiện vào tháng 6 năm 2002 ở
Nam Đông Thừa Thiên Huế. Đây là vùng căn cứ địa cách mạng nằm trong
dãy Trờng Sơn nên quân đội Mỹ đã rải chất độc hoá học nhiều lần, nơi đây
cũng có một sân bay nhỏ. Đây cũng là vùng sốt rét lu hành nhiều năm.
Ngời dân sống ở đây chủ yếu là dân tộc Ka Tu, mức sống thấp, trình độ
văn hoá rất thấp. Ba xã đã đợc lấy mẫu để nghiên cứu di truyền là Hơng
Sơn, Hơng Hữu và Thợng Long.
Đợt nghiên cứu thứ ba đã đợc thực hiện vào tháng 10 năm 2002 tại
huyện An Hải Hải Phòng. Huyện này ở gần sân bay Cát Bi. 4 xã/phờng
đã đợc chọn làm địa điểm nghiên cứu là Tràng Cát, Cát Bi, Đằng Lâm và
Nam Hải. Địa điểm Hải Phòng đợc coi là địa điểm đối chứng vì trừ một số
cựu chiến binh có phơi nhiễm với chất độc hoá học trong chiến tranh còn đa
số ngời dân ở đây không bị phơi nhiễm.

14


2.2.Đối tợng nghiên cứu:

Tuæi

4

26 ± 19,8

ThÊp
Trung Dòng

6

2

T©n Phong

10

3

55 ± 7,07

7

44,17 ± 4,36

T©n H¹nh

5

2


T©n Phong

10

4

54,75 ± 9,03

6

44 ± 8,15

T©n H¹nh

5

1

4

16,33 ± 6,03

41

15

26

39,50 ± 18,96

Tæng sè

Nam

N÷

§Þa ®iÓm
Sè l−îng

Tuæi

Sè l−îng

Tuæi

11

23 ± 10,93

ThÊp
H−¬ng S¬n

21

10

27,2 ± 10,28

H−¬ng H÷u


H−¬ng S¬n

32

17

61,31 ± 12,94

15

53,57 ± 19,11

H−¬ng H÷u

32

17

51,94 ± 13,87

15

51,60 ± 14,62

Th−îng Long

21

11


- A2: Cựu chiến binh ở miền Bắc cỏ tuổi đời đến khi nghiên cứu là
40 tuổi, trong gia đình không có ai bị dị tật.
- B1: Cựu chiến binh miền Bắc đã tham gia chiến đấu ở miền Nam, có
con bị dị tật.
- B2: Cựu chiến binh nh B1 nhng vợ đã bị tai biến sinh sản hoặc bản
thân bị bệnh.
- B3: Cựu chiến binh nh B1 nhng không có bất thờng sinh sản,
không có con bị dị tật.
- E2: Con của cựu chiến binh bị dị tật.
Số liệu về các nhóm này đợc trình bày trong bảng 2.3

19


B¶ng 2.3.

Sè mÉu
Nhãm

Tæng sè

Nam

N÷

Sè l−îng

Tuæi

Sè l−îng


12

11

52,91 ± 5,49

1

B2

24

24

54,13 ± 8,70

B3

17

16

57,41 ± 5,03

E2

6

6

Tiêu bản NST đợc nhuộm bằng phơng pháp nhuộm giemsa thông
thờng và bằng phơng pháp nhuộm băng G có xử lý bằng trypsin.
2.3.2.2. Phơng pháp đánh giá đột biến NST,
Đánh giá đột biến NST đợc thực hiện trên tiêu bản nhuộm giemsa
thông thờng và nhuộm băng G.
Các tiêu bản NST đợc đánh giá theo các qui định quốc tế về xếp loại
đột biến và các danh pháp di truyền tế bào học (An International System for
Human Cytogenetic Nomenclature - ISCN). Các chỉ số chủ yếu đợc đánh giá
là:
- Các tế bào có rối loạn số lợng NST.
+ Các tế bào lệch bội (aneuploid cells): các nhân tế bào vẫn còn nền bào
tơng có chứa số NST dới lỡng bội (44 hoặc 45 NST) hoặc trên lỡng bội
(47- 48 NST).
21


+ Các tế bào đa bội (polyploid cells): các tế bào có chứa 69 hoặc 92
NST, các NST tơng đồng trong tế bào có hình thái và bắt màu giống nhau. Tế
bào đa bội nội sinh cũng xếp vào nhóm này.
- Các tế bào có rối loạn cấu trúc NST.
Bao gồm các tế bào có rối loạn cấu trúc kiểu nhiễm sắc tử (chromatid
type) và rối loạn cấu trúc kiểu nhiễm sắc thể (chromosome type).
+ Các rối loạn cấu trúc nhiễm sắc tử gồm:
* Gap (hay còn gọi là nhạt hoặc khuyết màu).
* Đứt (breaks).
* Trao đổi nhiễm sắc tử.
+ Các rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể gồm:
* Isogap (hay còn gọi là nhạt hoặc khuyết màu kép hoặc gap kép).
* Đứt kép (isobreaks): bao gồm các NST bị mất đoạn, các đoạn
không tâm, các minut.

Trung bình cho mỗi ngời 25 tế bào ở kỳ giữa đã đợc phân tích ở kính
hiển vi và 3 tế bào đã đợc chụp ảnh.
Hai chỉ số đợc đánh giá là:
- Tần số SCE / tế bào.
- Tần số SCE / nhiễm sắc thể.
2.3.4. Xử lý số liệu.
Các số liệu đợc xử lý bằng phơng pháp thống kê toán học. Giá trị
trung bình thực nghiệm, độ lệch chuẩn, so sánh hai giá trị trung bình đã đợc
tính toán.

23


III. kết quả và nhận xét
Sự phân bố của các đối tợng đợc phân tích NST ở các địa điểm đợc
trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Phân bố nhóm đối tợng nghiên cứu ở các địa điểm.
Số mẫu đợc đánh giá NST

Địa điểm
Nhóm

Số mẫu đợc
đánh giá SCE

Nam

Nữ

Nam


6
7
39

4
3
21

6
7
39

17
10

15
10

15
0

13
0

17
10

15
0

- Tân Phong
+ Nguy cơ cao
+ Nguy cơ thấp
Tổng số:
Nam Đông Huế
- Hơng Sơn
+ Nguy cơ cao
+ Nguy cơ thấp
- Hơng Hữu
+ Nguy cơ cao
+ Nguy cơ thấp
- Thợng Long
+ Nguy cơ cao
+ Nguy cơ thấp
Tổng số:

24