ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Kiên Cường

NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA
VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Kiên Cường

NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA
VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
2. PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh

và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên .
Tôi xin gửi lời cảm ơn đ ến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học , Ban Chủ
nhiệm Khoa Sinh học và các Phòng ch ức năng của Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điề u kiê ̣n cho tôi h ọc tập, hoàn thành các
thủ tục cần thiết của một nghiên cứu sinh.
Tôi xin chân thành cám ơn đến TS. Đặng Thị Lụa, Viện nghiên cứu nuôi
trồng thủy sản I và TS. Trần Thị Tuyết Hoa, Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần
Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp và chia sẻ thông tin trong quá trình thử ng hiê ̣m
ứng dụng thực tế sản phẩm của đề tài luận án.
Luận án đã được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài thuộc chương
trình Trọng điểm cấp nhà nước do Bộ Khoa học và Công nghệ tài trợ, mã số
KC.04.09/11-15 và bản thân tôi cũng đã được hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với
tư cách là một nghiên cứu sinh của đề tài.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới bố , mẹ, vợ, con, gia đình, những
người đã luôn bên tôi, cổ vũ, động viên và tạo điề u kiê ̣n thuận lợi nhất cho tôi có thời
gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
NCS. Phạm Kiên Cường

3


MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC..................................................................................................................1
DANH MỤC CÁC KÝ HIÊU
̣ VÀ CHỮ VIẾT TẮT..............................................3
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................8
DANH MỤC HÌNH .................................................. Error! Bookmark not defined.
MỞ ĐẦU ................................................................... Error! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................... Error! Bookmark not defined.


4


1.3.3. Biểu hiện protein ngoại lai trên bề mặt bào tử Error! Bookmark not defined.
2.1. NGUYÊN LIỆU ................................................. Error! Bookmark not defined.
2.1.1. Mẫu tôm thử nghiệm ....................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Các hoá chất và nguyên vật liệu...................... Error! Bookmark not defined.
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ ................. Error! Bookmark not defined.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................... Error! Bookmark not defined.
2.3.1. Thu nhận virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm nhiễm bệnh ................ Error!
Bookmark not defined.
2.3.2 Nuôi cấy tạo bào tử B. subtilis ......................... Error! Bookmark not defined.
2.3.3. Tách chiết, định lƣợng DNA ........................... Error! Bookmark not defined.
2.3.4. Nhân dòng, biểu hiện VP28 trong E. coli và B. subtilisError! Bookmark not
defined.
2.3.5. Phát hiện, định lƣợng và tinh sạch VP28 ........ Error! Bookmark not defined.
2.3.6. Thử nghiệm khả năng phòng WSSV của bào tử B. subtilis tái tổ hợp ... Error!
Bookmark not defined.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............ Error! Bookmark not defined.
3.1. NHÂN DÕNG, XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÀ MỘT SỐ ĐẶC TRƢNG CỦA
GEN vp28 TỪ CÁC MẪU WSSV THU NHẬN Ở VIỆT NAMError!

Bookmark

not defined.
3.1.1. Nhân bản đoa ̣n gen mã hóa VP28 bằ ng PCR .. Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Nhân dòng gen mã hóa VP28 vào vector pGEM-TError!

Bookmark

KẾT LUẬN ............................................................... Error! Bookmark not defined.
KIẾN NGHỊ .............................................................. Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN ................................................................. Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................9

6


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
BCIP

5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate

BSA

Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin)

Cm

Chloramphenicol

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

DSM

Môi trƣờng tạo bào tử Difco (Difco Sporulation medium)


Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline)

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PVDF

Polyvinylidere Fluoride

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

GST

Glutathione S-transferase

TSA

Tryptic Soy Agar

TTFC

Phân đoạn đầu C của độc tố uốn ván (C- terminal fragment of the
tetanus toxin)

WSSV

Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus)

Bảng 3.6: Số copy trong từng dung dịch WSSV ...... Error! Bookmark not defined.

8


TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tiếng Việt
1. Đoàn Văn Cƣờng, Phạm Thị Tuyết Anh, Ngô Xuân Tuyến, Nguyễn Văn Hảo
(2007), "Xác định quá trình phát sinh bệnh của virus gây hội chứng đốm trắng",
Tuyển tập nghề các sông Cửu Long, pp. 265-278.
2. Nguyễn Viết Dũng, Ngô Xuân Tuyến, Phạm Võ Ngọc Ánh , Trƣơng Hồng Việt,
Nguyễn Văn Hảo (2007), "Đặc trƣng bộ gen và hình thái của virus gây hội
chứng đốm trắng trên tôm sú nuôi Penaeus monodon phân lập tại Việt Nam",
Tạp chí Viện nghiên cứu nuôi trông thủy sản II, pp. 222- 230.
3.Huỳnh Trƣờng Giang, Vũ Ngọc Öt, Trƣơng Quốc Phú (2011), "Sử dụng chiết suất
β-Glucan từ rong biển để tăng sức đề kháng của tôm biển: Tổng quan", Kỷ yếu
Hội nghị Khoa học thủy sản lần 4, pp. 103-113.
4. Nguyễn Văn Hảo, Lâm Trâm Anh, Phạm Thị Tuyết Anh, Đoàn Văn Cƣờng, Ngô
Xuân Tiến, Nguyễn Thị Hiền (2007), "Xây Dựng mô hình gây bệnh thực
nghiệm chuẩn đối với bệnh đốm trắng trên tôm sú Penaeus monodon", Tuyển
tập nghề các sông Cửu Long, pp. 257-264.
5. Trần Thị Minh Tâm (1999), "Bệnh thường gặp ở tôm phương pháp chẩn đoán và
phòng trị". Nhà xuất bản Nông nghiệp. 126 trang.
6. Bùi Quang Tề (2003), Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị, Nhà xuất bản
Nông Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh. 184 trang.
7. Đỗ Thị Thảo; Đỗ Thị Phƣơng; Đỗ Khắc Hiếu; Hà Thị Thu; Đinh Thƣơng
Vân; Đinh duy Kháng; Lê Trần Bình (2008), "Tạo dòng tế bào lai sản xuất
kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên
tôm sú", Tạp chí Công nghệ Sinh học 2, 203-208
8. Tổng cục thủy sản (2010), Báo cáo về thành tựu thủy sản năm 2010 và phương

pp. 247-256.
11. Balasubramanian G., Sarathi M., Venkatesan C., Thomas J., Sahul-Hameed A.
S. (2008), "Oral administration of antiviral plant extract of Cynodon dactylon
on a large scale production against white spot syndrome virus (WSSV) in
Penaeus monodon", Aquaculture 279, pp. 2–5.
12. Bradford (1976). "A dye binding assay for protein". Analytical Biochemistry 72,
pp. 248-254.
13. Braunig P., Rosa R. D. D., Caroline C. H. S. H., Borsa M., Stoco P. H.,
Edmundo E. C. C. G., Pinto A. R. (2011), "Molecular cloning and recombinant
expression of the VP28 carboxyl-terminal hydrophilic region from a brazilian
white spot syndrome virus isolate", Brazilian Archives of Biology and
Technology 54, pp. 399-404.
14. Bright S. I. S., Manjusha M., Pai S. S., Philip R. (2005), "Fenneropenaeus
indicus is protected from white spot disease by oral administration of
inactivated white spot syndrome virus", Diseases of Aquatic Organisms 66, pp.
265-270.
15. Cai S., Huang J., Wang C., Song X., Sun X., Yu J. (1995), "Epidemiological
studies on explosive epidemic disease of prawn 1994-1994", Journal of
Fisheries China 19, pp. 112-117.
16. Caipang C. M., Verjan N., Ooi E. L., Kondo H., Hirono I., Aoki T., Kiyono H.,
Yuki Y. (2008), "Enhanced survival of shrimp, Penaeus (Marsupenaeus)
japonicus from white spot syndrome disease after oral administration of

10


recombinant VP28 expressed in Brevibacillus brevis", Fish and Shellfish
Immunology 25, pp. 315-320.
17. Campadelli-Fiume G., Amasio M., Avitabile E., Cerretani A., Forghieri C.,
Gianni T., Menotti L. (2007), "The multipartite system that mediates entry of

syndrome virus and iTRAQ differentiation of envelope and nucleocapsid
subproteomes", Molecular and Cellular Proteomics 6, pp. 1609-1620.

15


60. Lightner D. V. (1999), "The penaeid shrimp viruses TSV, IHHNV, WSSV, and
YHV: current status in the Americas, available diagnostic methods and
management strategies", Journal of Applied Aquaculture 9, pp. 27–52.
61. Lin S. T., Chang Y. S., Wang H. C., Tzeng H. F., Chang Z. F., Lin J. Y., Wang
C. H., Lo C. F., Kou G. H. (2002), "Ribonucleotide reductase of shrimp white
spot syndrome virus (WSSV): expression and enzymatic activity in a
baculovirus/insect cell system and WSSV-infected shrimp", Virology 304, pp.
282-290.
62. Liu W. J., Chang Y. S., Wang A. H., Kou G. H., Lo C. F. (2007), "White spot
syndrome virus annexes a shrimp STAT to enhance expression of the
immediate-early gene ie1", Journal of Virology 81, pp. 1461-1471.
63. Lo C. F., Ho C. H., Peng S. E., Chen C. H., Hsu H. C., Chiu Y. L., Chang C. F.,
Liu K. F., Su M. S., Wang C. H., Kou G. H. (1996), "White spot syndrome
baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other
arthropods", Diseases of Aquatic Organisms 27, pp. 215-225.
64. Lo C. F., Kou G. H. (1998), "Virus-associated white spot syndrome of shrimp in
Taiwan: A review", Fish Pathology 33, pp. 365-371.
65. Lu Y., Tapay L. M., Gose R. B., Brock J. A., Loh P. C. (1997), "Infectivity of
Yellow Head Virus (YHV) and the Chinese baculo-like virus (CBV) in two
species of penaeid shrimp Penaeus stylirostris (Stimpson) and Penaeus
vannamei (Boone). In: Diseases in Asian Aquaculture III, Flegel TW and
MacRae IH, (Eds)", Asian Fisheries Society, Manila, the Philippines, pp. 297–
304.
66. Luna-Acosta A., Thomas-Guyon H., Amari M., Rosenfeld E., Bustamante P.,

A., Phan T. N., Cutting S. M. (2013), "Killed Bacillus subtilis spores expressing
streptavidin: a novel carrier of drugs to target cancer cells", Journal of Drug
Targeting 21, pp. 528-541.
74. Ning D., Leng X., Li Q., Xu W. (2011), "Surface-displayed VP28 on
Bacillus subtilis spores induce protection against white spot syndrome

17


virus in

crayfish

by

oral

administration",

Journal

of

Applied

Microbiology 111, pp. 1327-1336.
75. Ning J. F., Zhu W., Xu J. P., Zheng C. Y., Meng X. L. (2009), "Oral delivery of
DNA vaccine encoding VP28 against white spot syndrome virus in crayfish by
attenuated Salmonella typhimurium", Vaccine 27, pp. 1127-1135.
76. Perazzolo L. M., Barracco M. A. (1997), "The prophenoloxidase activating

black tiger shrimp", Vaccine 25, pp. 2778-2786.
84. Sarathi M., Simon M. C., Ahmed V. P., Kumar S. R., Hameed A. S. (2008),
"Silencing VP28 gene of white spot syndrome virus of shrimp by bacterially
expressed dsRNA", Marine Biotechnology (NY) 10, pp. 198-206.
85. Sathish S., Musthaq S., Hameed A. S. S., Narayanan R. B. (2004), "Production
of recombinant structure protein from the Indian WSSV", Aquaculture 242, pp.
69-80.
86 Sharma S. R., Shankar K. M., Sathyanarayana M. L., Sahoo A. K., Patil R.,
Narayanaswamy H. D., Rao S. (2010), "Evaluation of immune response and
resistance to diseases in tiger shrimp, Penaeus monodon fed with biofilm of
Vibrio alginolyticus", Fish and Shellfish Immunology 29, pp. 724-732.
87. Sithigorngul P., Chauychuwong P., Sithigorngul W., Longyant S.,
Chaivisuthangkura P., Menasveta P. (2000), "Development of a monoclonal
antibody specific to yellow head virus (YHV) from Penaeus monodon",
Diseases of Aquatic Organisms 42, pp. 27-34.
88. Söderhäll K. (1999), "Invertebrate immunity", Developmental and Comparative
Immunology 23, pp. 263–266.
89. Sritunyalucksana K., Söderhäll K. (2000), "The proPO and clotting system in
crustaceans", Aquaculture 191, pp. 53–69.
90. Sritunyalucksana K., Wannapapho W., Lo C. F., Flegel T. W. (2006), "PmRab7
is a VP28-binding protein involved in white spot syndrome virus infection in
shrimp", Journal of Virology 80, pp. 10734-10742.
91. Syed M. S., Kwang J. (2011), "Oral vaccination of baculovirus-expressed VP28
displays enhanced protection against White Spot Syndrome Virus in Penaeus
monodon", PloS One 6, p e26428.

19


92. Syed M.S, Kwang J. (2015), "Reprint of “Evolution of specific immunity in

White Spot Syndrome Virus (WSSV) envelope protein VP24 expressed in

20


Escherichia coli against WSSV", Journal of Invertebrate Pathology 123, pp.
17–24.
100. Tran T. T. H., Phuong T. N., Vlak J. (2008), "High variation of tandem repeat
sequences in ORF94 among WSSV outbreak strains in the Mekong Delta,
Vietnam", Handbook & Abstracts of the 7th Symposium on Diseases in Asian
Aquaculture,. Taipei, Taiwan, pp. 222 - 222.
101. Tsai J. M., Wang H. C., Leu J. H., Hsiao H. H., Wang A. H., Kou G. H., Lo C.
F. (2004), "Genomic and proteomic analysis of thirty-nine structural proteins of
shrimp white spot syndrome virus", Journal of Virology 78, pp. 11360-11370.
102. Tseng D. Y., Ho P. L., Huang S. Y., Cheng S. C., Shiu Y. L., Chiu C. S., Liu
C. H. (2009), "Enhancement of immunity and disease resistance in the white
shrimp, Litopenaeus vannamei, by the probiotic, Bacillus subtilis E20", Fish
and Shellfish Immunology 26, pp. 339-344.
103. Van Hulten M. C., Goldbach R. W., Vlak J. M. (2000), "Three functionally
diverged major structural proteins of white spot syndrome virus evolved by
gene duplication", The Journal of General Virology 81, pp. 2525-2529.
104. Van Hulten M. C., Tsai M. F., Schipper C. A., Lo C. F., Kou G. H., Vlak J. M.
(2000), "Analysis of a genomic segment of white spot syndrome virus of shrimp
containing ribonucleotide reductase genes and repeat regions", The Journal of
General Virology 81, pp. 307-316.
105. Van Hulten M. C., Tsawestenberg M., Goodall S. D., Vlak J. M. (2000),
"Identification of two major virion protein genes of white spot syndrome virus
of shrimp", Virology 266, pp. 227-236.
106 Van Hulten M. C., Vlak J. M. (2001), "Identification and phylogeny of a
protein kinase gene of white spot syndrome virus", Virus Genes 22, pp. 201207.

115. Wongprasert K., Khanobdee K., Glunukarn S. S., Meeratana P.,
Withyachumnarnkul B. (2003), "Time-course and levels of apoptosis in various
tissues of black tiger shrimp Penaeus monodon infected with white-spot
syndrome virus", Diseases of Aquatic Organisms 55, pp. 3-10.
116. Wongteerasupaya C., Vickers J. E., Sriurairatana S., Nash G. L., Alarajamorn
A., Boonsaeng V. (1995), "A non-occluded, systemic baculovirus that occurs in

22


cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the
black tiger prawn Penaeus monodon", Diseases of Aquatic Organisms 21, pp.
69–77.
117. Wongteerasupaya C., Wongwisansri S., Boonsaeng V., Panyim S., Pratanpipat
P., Nash G. L. (1996), "DNA fragment of Penaeus monodon baculovi-rus
PmNOBII gives positive in situ hybridization with white spot viral infections in
six Penaeid shrimp species", Aquaculture 143, pp. 23–32.
118. Wu C., Yang F. (2006), "Localization studies of two white spot syndrome
virus structural proteins VP51 and VP76", Virology Journal 3, pp 76-83.
119. Wu J. L., Nishioka T., Mori K., Nishizawa T., Muroga K. (2002), "A timecourse study on the resistance of Penaeus japonicus induced by artificial
infection with white spot syndrome virus", Fish and Shellfish Immunology 13,
pp. 391-403.
120. Xie X., Xu L., Yang F. (2006), "Proteomic analysis of the major envelope and
nucleocapsid proteins of white spot syndrome virus", Journal of Virology 80,
pp. 10615-10623.
121. Xie X., Yang F. (2005), "Interaction of white spot syndrome virus VP26
protein with actin", Virology 336, pp. 93-99.
122. Xu H., Yan F., Deng X., Wang J., Zou T., Ma X., Zhang X., Qi Y. (2009),
"The interaction of white spot syndrome virus envelope protein VP28 with
shrimp Hsc70 is specific and ATP-dependent", Fish and Shellfish Immunology

pp.239–242.

24