ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội loài người ngày càng phát triển, cùng với nó là sự bùng nổ của
các đại dịch mà nổi bật nhất là lao, HIV và sốt rét. Theo thống kê của tổ chức
Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Mỗi
năm theo ước tính có khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu
người chết vì lao, tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện bệnh chỉ đạt 37%. Như vậy còn
rất nhiều bệnh nhân mắc lao không được phát hiện và chữa trị kịp thời, đây sẽ
là nguồn lây nhiễm rất khó kiểm soát. Việt Nam hiện đứng thứ 12 trong tổng
số 22 nước có tỉ lệ nhiễm lao lớn nhất trên Thế giới, trong khu vực Tây Thái
Bình Dương đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippin [2, 10, 54].
Ngày nay bệnh lao càng trở nên nguy hiểm hơn do tính kháng thuốc,
đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử vong rất lớn, do vậy, việc phát hiện để
điều trị sớm càng trở nên cần thiết. Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp rất
nhiều khó khăn. Ở Việt Nam, phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen hiện nay
vẫn được coi là phổ biến nhất. Hạn chế của phương pháp này là chỉ có khả
năng phát hiện trong trường hợp số lượng vi khuẩn lao ≥ 10 4 AFB/1ml bệnh
phẩm, do vậy nếu chỉ áp dụng phương pháp này sẽ để sót nhiều bệnh nhân.
Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường Lowenstein-Jensen được
coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, tuy nhiên phải mất 4 đến 8 tuần nuôi cấy
mới cho kết quả. Ngay cả trên môi trường nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC
cũng mất đến 2 tuần, điều này khó đáp ứng được mục tiêu phát hiện nhanh để
kiểm soát bệnh lao [4, 18].
Trước yêu cầu bức thiết đó đòi hỏi phải có một phương pháp chẩn đoán
đáp ứng được hai yêu cầu nhanh và chính xác. Ngày nay sự phát triển mạnh
mẽ của sinh học phân tử đã tạo ra một bước đột phá trong việc chẩn đoán lao.
Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán lao đã rút ngắn

1


thời gian chẩn đoán từ vài tuần xuống còn hai ngày với độ nhạy và độ đặc

2. So sánh tỷ lệ xuất hiện các trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên
các chủng lao ở ba miền Bắc – Trung – Nam tại Việt Nam.

Chương 1

3


TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO
1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gới
Lao là một bệnh truyền nhiễm và đã từng được Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu của căn bệnh này. Hiện
nay, bệnh lao đang được khuyến cáo là một trong ba bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch AIDS và sốt
rét. Hiện có tới hơn 2 tỷ người nhiễm lao chiếm gần 1/3 dân số thế giới, mỗi
năm có khoảng 9 triệu bệnh nhân mới được phát hiện và trên 3 triệu người
chết vì lao [2]. Tình hình cũng diễn biến xấu hơn ở những nước đang phát
triển, nơi chiếm 95% số người mắc lao. Bệnh lao chiếm 25% nguyên nhân tử
vong ở những nước này. Khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22
quốc gia có gánh nặng bênh tật cao. Đặc biệt trong những năm gần đây tình
hình lao đồng nhiễm với HIV – AIDS và lao kháng thuốc đang nổi lên như
một vấn đề nhức nhối, đặc biệt là ở các nước kém và đang phát triển, điều này
đòi hỏi sự vào cuộc của toàn xã hội. Theo thống kê năm 2005 toàn thế giới có
gần 8,8 triệu người mắc bệnh lao và đã dẫn tới 1,6 triệu người bị chết.
Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu
nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động.
Trong đó có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh
nặng bệnh lao [54, 69]. Vào năm 2007, WHO ước tính khu vực Đông Nam Á
có số người nhiễm lao chiếm 34% trên toàn thế giới.

Những năm gần đây việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử như PCR vào
chẩn đoán lao đã mang lại nhiều kết quả khả quan, với các kĩ thuật trên đã rút
ngắn thời gian chẩn đoán và cho độ chính xác cao. Tuy vậy cần có các nghiên
cứu nhằm hiểu rõ hơn về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao nhằm hoàn thiện

5


hơn kĩ thuật chẩn đoán lao bằng phương pháp phân tử.
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LAO
1.2.1. Đặc điểm phân loại
Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ
Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống
Mycobacterium. Vi khuẩn lao có tên khoa học là: Mycobacterium
tuberculosis [15].
Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium được chia làm 2 nhóm
• Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm:
M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti. Trong đó M.
tuberculosis và M. bovis gây bệnh lao điển hình.
• Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm:
M. avium, M. ortuitum, M. govdovac, M. kansasii... Nhóm này không
gây bệnh lao.
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc
1.2.2.1. Cấu trúc hình thái
Vi khuẩn lao được phát hiện bởi Robert Koch khoảng 100 năm trước
đây. Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 2-3 µm, dày 0,3 µm. Khi nhuộm
Ziel-Nellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn và axit làm mất
màu fucsin, do vậy chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid
fast bacilli-AFB). Đây là đặc điểm nổi bật của Mycobacteria có thể giúp phát
hiện vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm. Trực khuẩn lao trong dịch huyền

enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia
tế bào, tập hợp và tiết một số protein ngoại bào, sao chép DNA [3, 4, 11].
7


Lớp tiếp theo là peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân
tử axit mycolic tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vỏ
vi khuẩn có độ cứng nhất định [1]. Thành tế bào của Mycobacteria là cấu trúc
phức tạp nhất được biết ở prokaryote, có một số thành phần hoá học và nhiều
liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglycan ở thành tế bào
M. tuberculosis là 70-80% trong khi ở E. coli là 20-30% [45].
Lớp ngoài là lớp được tạo nên bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và
các lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc
làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn
tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị huỷ diệt bởi đại thực bào
và các tế bào miễn dịch [1]. Bám với peptidoglycan là một polysaccharide
phân nhánh, arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử này được ester hoá
với axit béo có khối lượng phân tử cao là axit mycolic. Sự sắp xếp của các
axit mycolic có tính đặc hiệu loài cho phép xác định loài mycobacteria bằng
sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí-lỏng. Các axit
mycolic đặc hiệu M. tuberculosis là alpha-keto và mythoxymycolate chứa 76
đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon. Lớp ngoài của thành tế bào có các
phân tử lipid tự do như phthiocerol dimycoserosates (PDIM), phenolic
glycolipids (PGL), trehalose-containing glycolipids và sulfolipids (SL). Nằm
ngang qua toàn bộ lớp màng là một số glycolipid như phosphatidylmyoinositol mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM),
được đính vào màng sinh chất và mở rộng ra bên ngoài thành tế bào trong đó
LAM có tính đặc hiệu loài. Thành tế bào mycobacteria chứa các protein nằm
rải rác, một vài protein này có tác dụng cấu trúc thành tế bào, một số protein
porin hình thành các kênh ưa nước cho phép vận chuyển tích cực các chất tan
trong nước thông qua lớp axit mycolic. Porin ở mycobacteria khác so với các

9


1- Lipid ngoài
2- Axit mycolic
3- polysaccharides
(arabinogalactan)
4- peptidoglycan
5- màng sinh chất
6- lipoarabinomannan (LAM)
7- phosphatidylinositol
mannoside
8- Khung thành tế bào

Hình 1.3. Thành tế bào Mycobacteria
[ />
1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy
Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều
kiện kị khí. Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37oC. Hầu như không mọc ở nhiệt
độ dưới 37oC hoặc trên 42oC.
Vi khuẩn lao phát triển trong môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng,
chứa trứng, khoai tây, xitrat, glixerol, asparagin, xanh malachit. Môi trường
thường dùng là môi trường đặc Loewenstein được cải tiến bởi Jensen; (hoặc
môi trường lỏng Sauton).
Trực khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, phải 4-6 tuần sau mới hình

10


thành khuẩn lạc điển hình, dạng R.


1.2.4. Hệ gen vi khuẩn lao
1.2.4.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis

Hình 1.5. Hệ gen vi khuẩn lao

M. tuberculosis H37Rv (Cole 1998a) chứa một trình tự gồm 4.411.529
bp, có đặc tính chứa nhiều Guanine và Cytosine (G+C 65,61%) không thay
đổi ở các vị trí khác nhau trong toàn bộ hệ gen, kiểm chứng cho giả thuyết là
không có các nhân tố chuyển gen theo phương ngang trong hệ gen M.

12


tuberculosis [22, 29, 45].
Ở Mycobacteria có một nhóm gen với tỷ lệ G+C cao (>80%) mã hoá
cho họ protein PE (Pro-Glu) hoặc PPE (Pro-Pro-Glu). Trình tự PE và PPE có
ở vùng đầu N và bảo thủ trong từng họ protein, chiều dài lần lượt xấp xỉ 110
và 180 amino axit. Trong 172 gen thì có 104 gen mã hoá PE và 68 mã hoá
PPE chiếm hơn 4% các gen của M. tuberculosis. Các protein PE và PPE đóng
một vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên và sống sót của mycobacteria
trong các môi trường khác nhau. Họ PE được chia thành 3 phân họ, họ quan
trọng nhất chứa các trình tự đa hình giàu G-C (PGRS) và có 61 thành viên.
Các protein được mã hoá bởi các gen 104 PE được chia nhỏ hơn thành 3 lớp,
lớp thứ nhất chứa 29 protein chỉ với vùng PE, lớp thứ hai gồm 8 protein trong
đó vùng PE đi kèm với các trình tự đầu C độc lập, và lớp thứ ba gồm 67
protein tạo thành dưới họ PE-PGRS. PGRS (polymorphic GC-rich repetitive
sequences) là nhóm các protein có vùng PE bảo thủ và đầu C mở rộng với sự
lặp lại nhiều lần Gly-Gly-Ala hoặc Gly-Gly-Asn. Chức năng của các họ này
vẫn chưa biết rõ nhưng có một số giả thuyết cho rằng một số protein này có

ORF (Open Reading Frame), sự khởi đầu khác ở codon GTG được sử dụng
trong 35% trường hợp so với 14% hoặc 9% trong Bacillus subtilis hoặc
Escherichia coli. Từ trình tự hệ gen cho thấy M. tuberculosis có khả năng
chuyển từ một con đường trao đổi chất này thành con đường trao đổi chất
khác bao gồm cả hiếu khí và hô hấp kỵ khí . Tính mềm dẻo này rất có lợi cho
sự sống sót trong các môi trường khác nhau bên trong cơ thể người cả trong
trạng thái áp lực oxy cao trong phế nang và các điều kiện kỵ khí, vi kỵ khí
trong các nang lao. Một đặc tính nữa của hệ gen M. tuberculosis là có các gen
tổng hợp và phân huỷ hầu như tất cả các loại lipid như các axit béo và các
phân tử phức như axit mycolic. M. tuberculosis có các gen mã hoá cho 250
enzyme khác nhau liên quan đến trao đổi axit béo, so với 50 loại trong hệ gen
của E. coli [35]. Trong số các protein điều khiển, M. tuberculosis có 13 yếu tố

14


sigma (protein liên quan đến tính đặc hiệu sao mã trên RNA polymerase)
tương ứng 0,3% tổng số gen và 22 protein điều khiển khác bao gồm 13 nhân
tố điều khiển đáp ứng hai thành phần, tương ứng 0,6% tổng số. Số lượng
tương ứng trong M. tuberculosis là 125 gen được nghiên cứu cho các chức
năng vận chuyển, tương ứng 3% tổng số [50].
Trong hệ thống trao đổi chất DNA của M. tuberculosis có một hệ thống
sửa chữa DNA rất hiệu quả, bộ máy sao chép có độ chính xác cao. Hệ gen của
M. tuberculosis không có hệ thống sửa chữa bắt cặp sai dựa trên mutS nhưng
được khắc phục bởi sự có mặt của gần 45 gene liên quan đến các cơ chế sửa
chữa DNA, bao gồm 3 bản copy của gen mutT. Gen này mã hoá cho enzyme
chịu trách nhiệm loại bỏ các Guanine đã bị oxy hoá gây ra sự bắt cặp sai giữa
các cặp base trong quá trình sao chép [22, 29, 45].
1.2.4.2. Các trình tự chèn
• Cấu tạo:


16


gồm 2 hoặc 3bp ở cuối liên quan đến sự phân cắt và các phản ứng chuyển
chuỗi dẫn đến chuyển vị trí của các trình tự chèn. Các promoter của IS thường
định vị một phần bên trong trình tự IR về phía đầu gen Tpase, sự sắp xếp này
có thể cung cấp một cơ chế tự điều hoà sự tổng hợp Tpase bằng cách gắn
Tpase. Các vị trí gắn các protein đặc hiệu cũng được tìm thấy bên trong hoặc
ở gần đầu IR, và đóng vai trò kích hoạt tính di chuyển hoặc biểu hiện Tpase.
• Cấu trúc vùng Tpase:
Hoạt tính gắn vào các trình tự DNA đặc hiệu của các protein được quy
định ở vùng đầu N trong khi vùng xúc tác thường được quy định ở vùng C.
Cấu trúc này tạo nên sự tương tác của phân tử protein mới sinh với các trình
tự đích trên IS.
• Các đoạn lặp lại trực tiếp:
Đặc điểm khác của IS là có khả năng chèn, đa số tạo nên các trình tự DNA
ngắn lặp lại trực tiếp (DR-Direct Repeat), độ dài của DR vào khoảng từ 2 đến
14bp, chèn vào chuỗi DNA tại các vị trí nhất định.
• Chức năng của IS:
Một số trình tự chèn có tác dụng hoạt hoá sự biểu hiện của các gen lân
cận, trong trường hợp di chuyển tạo nên vị trí thích hợp thì các promoter mới
có khả năng điều khiển sự biểu hiện của các gen bên cạnh.
Thông qua biểu hiện và hoạt động của Tpase như cô lập các tín hiệu khởi
đầu dịch mã, thay đổi khung dịch mã, kết thúc dịch mã, tác động đến sao mã
và độ bền của Tpase [45].
• Trình tự IS6110
Trình tự IS6110 (IS – Insertion Sequence) được mô tả lần đầu tiên vào
năm 1989. IS6110 có nhiều bản copy (4 đến 25 bản copy), số lượng bản
copy IS6110 có trong hệ gen thay đổi và phụ thuộc vào loài và chủng.

tính đa hình và số lượng bản sao của nó. Ở một số vùng số lượng bản copy
IS6110 thấp (
biệt M. tuberculosis và M. bovis và cũng được sử dụng để phân biệt các chủng
lao gây bệnh trong các mycobacteria [41].
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO
1.3.1. Phương pháp soi trực tiếp
Phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn lao trước đây thường dựa vào
thao tác nhuộm Ziehl-Neelsen sau đó soi trực tiếp trên kính hiển vi. Đây là
một phương pháp phát hiện nhanh chỉ trong 30 phút đến 1 giờ, khá đơn giản

20


và có chi phí thấp nhưng nồng độ vi khuẩn phải đạt 10 4 khuẩn/1ml nên độ
nhạy thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao. Người ta đã cải tiến
phương pháp này bằng kĩ thuật li tâm và cô đặc để làm tăng độ nhạy của chẩn
đoán. Ở các nước phát triển họ sử dụng kính hiển vi huỳnh quang nhằm nâng
cao độ nhạy và rút ngắn thời gian chẩn đoán so với các phương pháp truyền
thống dựa trên cơ sở của phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen. Phương pháp
này có ưu điểm là cho kết quả nhanh và không đòi hỏi quá khắt khe về kỹ
thuật do đó làm giảm những lỗi nhỏ trong quá trình làm thí nghiệm. Nhược
điểm của phương pháp là giá thành của các hóa chất, thiết bị dùng cho thí
nghiệm rất đắt đó là vấn đề lớn đối với các nước nghèo và có thu nhập thấp.
Những năm gần đây phương pháp nhuộm diacetate đánh dấu huỳnh
quang được sử dụng nhằm đánh giá sự có mặt cũng như khả năng tồn tại của
vi khuẩn trong các mẫu đờm. Phương pháp này được đề xuất để phát hiện
sớm và chính xác vi khuẩn lao đã qua điều trị nhưng chưa thành công do giá
thành cao [27, 34].
1.3.2. Phương pháp nuôi cấy
Nuôi cấy vi khuẩn lao trước đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn trong
chẩn đoán phát hiện trong phòng thí nghiệm. Đây là phương pháp được thực
hiện trong môi trường Lowenstein . Nhược điểm của nó là chậm và mất nhiều

truyền trong cộng đồng, sự bùng nổ dịch và đặc biệt là đường lây của các
chủng kháng thuốc. Có hai dạng yếu tố DNA lặp lại đó là: yếu tố IS 6110, yếu
tố này có khả năng di chuyển, đoạn gen đích này có chiều dài 1300 cặp base.
Ngoài ra còn có yếu tố khác là yếu tố lặp lại trực tiếp DR (Direct Repeat).
Yếu tố IS6110 là yếu tố được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu dịch tễ
học vì có trong nhiều chủng vi khuẩn lao khác nhau. Tuy nhiên một số nghiên
cứu gần đây chỉ ra rằng một số chủng M. tuberculosis không chứa trình tự

22


IS6110, như các chủng phân lập được từ Đông Nam Châu Á và Ấn Độ. Theo
Ernesto Liebana và cs (1996) thì có tới 4 chủng trong 304 chủng M.
tuberculosis phân lập ở Việt Nam không có trình tự IS6110 do đó có thể gây
ra hiện tượng âm tính giả [30]. Các nghiên cứu cũng đã phát hiện trình tự IS
1081 có ở tất cả các chủng M. tuberculosis nghiên cứu và không tìm thấy ở
các loài thuộc họ Mycobacteria khác, do đó có thể dùng cả IS 1081 cho phản
ứng PCR và Multiplex PCR để phát hiện M. tuberculosis đặc biệt là các
chủng ở Đông Nam Á [23]. Ngoài ra gen 23S rDNA là đoạn gen mã hoá cho
tiểu phần 23S của ribosome cũng được các tác giả gợi ý sử dụng trong việc
phát hiện và xác định sự có mặt của vi khuẩn lao [39].
1.3.4.2. Kĩ thuật multiplex PCR
Kỹ thuật multiplex PCR đã ra đời như một bước hoàn thiện hơn về khả
năng chẩn đoán của PCR. Chamberlain và cộng sự là những người đầu tiên
mô tả, phát triển kỹ thuật multiplex PCR vào năm 1988. Trong kỹ thuật
multiplex PCR, nhiều gen đích được khuếch đại cùng một lúc bằng nhiều cặp
mồi trong cùng một phản ứng. Kỹ thuật multiplex PCR tiết kiệm thời gian,
công sức và đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm
phân tích đột biến gen, tính đa hình DNA, phân tích định lượng, phân tích đột
biến và phát hiện RNA. Trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm, kỹ thuật này rất

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các mẫu chủng vi khuẩn lao M.

24


Tuberculosis được thu thập từ 3 bệnh viện ở cả ba miền Bắc – Trung – Nam
Việt Nam.
Miền Bắc: Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TƯ – Kí hiệu chủng TB02
Miền Trung: Bệnh viện Đa Khoa TW Huế - Kí hiệu chủng TB05
Miền Nam: Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch – Kí hiệu chủng TB06
Tất cả các mẫu chủng trên được phân lập sau đó tăng sinh trên môi trường
Lowenstein rồi tách chiết thu DNA sử dụng trong quá trình nghiên cứu.
2.1.2. Cỡ mẫu nghiên cứu
Cỡ mẫu được tính theo công thức tính cỡ mẫu theo khuyến cáo của
WHO cho các nghiên cứu dịch tễ học [54]
n = Z21-α/2 P (1-P)/ d2
Trong đó :
Z1- α/2 = 1,96 (với độ tin cậy β= 95%)
P : Tỉ lệ ước đoán trong quần thể (tỷ lệ ước đoán khuyết gen đích
IS6110 ở Việt Nam là 5 % theo các nghiên cứu trong nước công bố).
d : Độ dao động của tỉ lệ phát hiện không quá 5% so với tỷ lệ thực
n : Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt được
Căn cứ công thức trên, chọn d = 2% thì cỡ mẫu tối thiểu cần đạt là n =
456, thực tế đã thu thập 750 chủng vi khuẩn lao ở cả 3 miền.
Cách lấy mẫu: Thu thập ngẫu nhiên chủng vi khuẩn phân lập được trong
khoản thời gian thuộc giai đoạn 2007-2010 tại các điểm nghiên cứu.