ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======
VŨ ANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU
ĐỊNH LƯỢNG
PARAQUAT
TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TẠ THỊ THẢO
2. TS. HÀ TRẦN HƯNG

HÀ NỘI
LỜI CẢM ƠN


Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và
TS. Hà Trần Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân
viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
được học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc

1.3. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat........................22
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................26
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................26
2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị...........................................................................26
2.2.1 Chất chuẩn..................................................................................................26
2.2.2 Hoá chất......................................................................................................26
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ........................................................................................27
2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................28

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


2.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat...............................28
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn............................................................................28
2.3.1.2. Phương pháp tách PQ từ huyết tương.................................................28
2.3.1.3. Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ trong huyết
tương...................................................................................................28
2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương...........................30
2.3.2.1. Tính chọn lọc.......................................................................................30
2.3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính.................................................................30
2.3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.........................................30
2.3.2.4. Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại).....................30
2.3.2.5. Độ ổn định...........................................................................................30
2.3.3. Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên
lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ.........................31
2.3.3.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................31
2.3.3.2. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân............................................................31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................33

3.3.2. Đánh giá độ đúng của phương pháp.........................................................60
3.3.2.1. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp................................................60
3.3.2.2. Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích...................................61
3.3.3. Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại................................................................62
3.3.3.1. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị...........................................................62
3.3.3.2. Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp) của phương pháp
phân tích.............................................................................................63
3.3.4. Độ ổn định.................................................................................................66
Độ ổn định trong thời gian phân tích...............................................................66
3.4. Phân tích mẫu PQ trong huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng
bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ..........................................66
3.4.1. Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu:....................................................66
3.4.2. Nồng độ Paraquat huyết tương trong tiên lượng bệnh nhân và đánh giá
hiệu quả lọc máu hấp phụ.........................................................................68
KẾT LUẬN............................................................................................................76
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................77

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Vũ Anh Phương

RP-HPLC
SD
SIPP

Vũ Anh Phương

Tên tiếng anh
% Relative standard deviation
% Reproducibility standard

Tên Tiếng việt
% Độ lệch chuẩn tương đối
% Độ lệch chuẩn tái lặp

deviation
Acetonitrile
Asymmetry factor
Adenosin Triphophate
Patient
diode-array detector
Diquat
Ethylparaquat
Gas chromatography - Mass

tương đối
Acetonitril
Hệ số đối xứng pic
Adenosin Triphophat
Bệnh nhân
detector mảng diode

Đường cong ROC
Sắc ký lỏng pha đảo
Độ lệch chuẩn
Chỉ số độ nặng của ngộ độc

Trường ĐHKH Tự nhiên


Tên viết tắt
TCA
tR
UV-VIS

Vũ Anh Phương

Tên tiếng anh
Poisoning
Trichloroacetic acid
Retention time
Ultraviolet-Visible

Tên Tiếng việt
Paraquat
Acid Tricloacetic
Thời gian lưu
Tử ngoại và khả kiến

Trường ĐHKH Tự nhiên



8

Trường ĐHKH Tự nhiên


định tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc
PQ mà chưa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độ PQ
máu với kết quả đáng tin cậy. Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn
đoán, tiên lượng cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu làm cho
việc điều trị ngộ độc PQ tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên
cả nước gặp rất nhiều khó khăn.
Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phương
pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ
(LC-MS)... Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy
sắc ký lỏng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình
chuẩn định lượng PQ huyết tương. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu:
1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người
và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat.
2. Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat
trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc
bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.

Vũ Anh Phương

9

Trường ĐHKH Tự nhiên



Trường ĐHKH Tự nhiên


hàm lượng khác nhau, nói chung thường đều ở dạng dung dịch màu xanh. Một số
tên gọi thường gặp của PQ như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone,
Owen... [42].
Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các nước phát triển đều đã cấm
sử dụng PQ như là một loại hóa chất bảo vệ thực vật (Mỹ và các nước Châu Âu).
Một số nước như Nhật Bản chỉ cho phép lưu hành PQ dạng dung dịch với hàm
lượng thấp 4,5% sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ nếu bị ngộ độc. Thực tế hiện nay trên
thế giới vẫn có gần 130 nước cho phép sử dụng PQ trong đó có Việt Nam [42].
Hiện ở Việt Nam thuốc từ cỏ PQ được lưu hành dạng dung dịch 20% do đó nguy cơ
ngộ độc cấp tính rất lớn.
Một điều đáng nói là công ty sản xuất PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là
Syngenta hay còn gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc và Anh. Trên đất nước
họ đã cấm hoàn toàn PQ, hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nước
thứ ba [39].
1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat
Cơ chế gấy độc của PQ được mô tả theo sơ đồ sau [37]:

Hình 1.2. Cơ chế gây độc của
paraquat [15]
Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ 2+ cùng với NADPH trải qua
một phản ứng tạo ra ion paraquat bị khử (PQ +) và NADP+. PQ+ phản ứng hầu như
ngay lập tức với oxy tái tạo lại PQ2+ và gốc superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu
trình oxy hoá - khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và
không ngừng tạo ra gốc superoxid. Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bản
thân nó để tạo ra peroxid hydro (H2O2), và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự do
hydroxyl [18] [31]. Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy hoá - khử

hoặc liên quan đến thải trừ PQ thì tổn thương đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là
nguyên nhân hàng đầu gây tử vong như tổn thương phổi gây suy hô hấp, suy thận,
viêm gan, loét niêm mạc đường tiêu hóa và biến chứng nhiễm trùng [6][13][37].
Việc tiếp xúc với lượng PQ ít hơn sẽ làm chậm nguy cơ tử vong do xơ phổi tiến
triển và suy thận [33]. Một số nghiên cứu gần đây còn cho thấy phơi nhiễm PQ có
liên quan với hội chứng Parkinson [21][23].
Trong ngộ độc cấp PQ, có thể tiên lượng bệnh dựa trên nồng độ PQ trong
huyết tương. Một số báo cáo cho thấy nồng độ PQ huyết tương vượt qua 2 µg/ml thì
hầu hết tử vong, tuy nhiên một vài trường hợp bệnh nhân vẫn hồi phục khi nồng độ
trong máu cao hơn 2 µg/ml [7][10][22].

Vũ Anh Phương

12

Trường ĐHKH Tự nhiên


1.1.4. Dược động học paraquat
1.1.4.1. Hấp thu
Ở đường tiêu hoá PQ được hấp thu rất nhanh nhưng ít (5-10%). Hấp thu chủ
yếu ở ruột non. Khi dạ dày ruột bị tổn thương lan rộng, số lượng chất độc được hấp
thu sẽ tăng lên. PQ không gắn với protein huyết tương. Nồng độ đỉnh của PQ trong
huyết tương đạt được trong vòng 2 giờ sau uống [6] [37]. Tiếp xúc qua da, hấp thu
vào cơ thể nói chung chỉ xảy ra khi tiếp xúc kéo dài hoặc da bị tổn thương. Tiếp xúc
với PQ qua đường hô hấp không làm cho lượng PQ được hấp thu đến mức đủ để
gây nhiễm độc. Bởi vì kích thước các hạt chứa PQ lớn (hầu hết trên 100 µm) làm
cho PQ không đi sâu được xuống đường hô hấp để hấp thu [11]. Mắt tiếp xúc với
PQ sẽ bị tổn thương, nhưng không đủ để gây nhiễm độc toàn thân.
1.1.4.2. Phân bố

giảm nồng độ PQ (dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…). Proudfoot và cộng sự [29]
lần đầu tiên trình bày biểu đồ tiên lượng khả năng sống từ kết quả định lượng nồng
độ PQ huyết tương tại nhiều thời điểm khác nhau trên 79 bệnh nhân. Những BN
sống có nồng độ dưới 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/l tương ứng ở 4, 6, 10, 16, và 24
giờ sau uống PQ. Schermann và cộng sự [35] mở rộng đường cong tiên lượng BN
này lên đến ngày thứ 7 sau nhiễm độc, và nghiên cứu này cho thấy những BN nồng
độ PQ huyết tương trên 10 mg/l (định lượng trong vòng 8 giờ), thường chết vì sốc
tim trong 24h, trong khi những BN có nồng độ thấp hơn (nhưng vẫn trên đường tiên
lượng), chết vì xơ phổi và suy hô hấp muộn hơn 24 giờ sau uống. Suzuki và cộng sự
(1991) [36] đã kết hợp dữ liệu của Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann
(1987), Sawada (1988) và thêm một nhóm 78 BN, kết luận rằng đồ thị tiên lượng
chính xác 101 trong 102 trường hợp tử vong và 61 trong 63 BN sống được đánh giá
trong vòng 24 h sau uống PQ. Mặc dù đồ thị khá chính xác, giúp xác định mức độ
nặng và tiên lượng tử vong nếu định lượng được PQ ngay lập tức, đồ thị này cũng
đôi khi tiên đoán sai. Nguyên nhân do ước tính thời gian từ khi uống PQ dễ sai, đặc
biệt trong vài giờ đầu tiên nồng độ PQ huyết tương giảm nhanh sai số về thời gian
thậm chí 0,5 đến 1h có thể thay đổi hoàn toàn mối quan hệ nồng độ và tiên lượng.
Ngoài ra, nồng độ PQ trong huyết tương có thể không hoàn toàn chính xác vì được
phân tích bằng một số phương pháp khác nhau và các nghiên cứu thường không
trình bày rõ nồng độ của ion hay là muối PQ, và thực tế có thể có khác biệt giữa
các bệnh nhân về mức độ nhạy cảm với tác dụng độc của PQ, tuy khác biệt này
chưa được nghiên cứu.

Vũ Anh Phương

14

Trường ĐHKH Tự nhiên



15

Trường ĐHKH Tự nhiên


1.2. Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương
1.2.1. Phương pháp quang phổ
Rai M.K và cộng sự [30] định lượng PQ sử dụng NaBH4 để khử PQ trong
môi trường kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 600nm
trong khi Kato K. và cộng sự [20] lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester
(TBPE) phản ứng với PQ để tạo ra dung dịch hữu cơ PQ-TBPE màu xanh da trời,
có thể chiết được bằng dichloromethane. Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định
lượng PQ trong huyết tương dựa bằng đo quang phổ của dẫn xuất khi phản ứng với
Na2S2O4 10% và NaOH 5M.
Ưu điểm của phương pháp khử PQ bằng NaBH 4 là độ nhạy cao, với các điều
kiện khử PQ là nhiệt độ 35-40°C, pH 10-11 thì màu có độ ổn định lên đến 12h và
không cần đệm để ổn định màu, khoảng nồng độ 0,05 - 0,5 µg/ml tuân theo định
luật Lambert – Beer, trong khi giới hạn phát hiện là 0,03 µg/ml. Trong khi đó,
phương pháp sử dụng TBPE thì mẫu được phép để tối đa trong 20 phút. Cả 2
phương pháp này đều đề cập đến DQ, trong khi Rai M.K [30] loại bỏ DQ thì Kato
K. [20] lại định lượng đồng thời cả PQ và DQ.
Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã loại được sự ảnh hưởng của các
thuốc trừ sâu thông thường và các ion kim loại khác. DQ, có cấu trúc gần giống PQ,
sẽ gây ảnh hưởng khi định lượng PQ. Tuy nhiên DQ, nếu có, sẽ bị loại khi thêm
NaOH 0,2 N, trong khi PQ không bị mất đi. Các ion kim loại như Fe 3+ và Al3+, có
thể ảnh hưởng do làm kết tủa hydroxide, sẽ bị loại đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5%
trước khi thêm dung dịch NaOH [30]. Còn theo Kato K [20], DQ cũng có thể chiết
được với TBPE trong dichloromethane cũng giống như PQ nhưng PQ-TBPE có
quang phổ hấp thụ hơi khác với DQ-TBPE. Đo độ hấp phụ của PQ ở bước sóng 603
nm & DQ ở bước sóng 608 nm với dãy nồng độ (4,5 - 45,0)×10-7 M. Giới hạn phát

hai nghiên cứu, các tác giả đã sử dụng hệ thống chọn lọc ion (selected ion
monitoring – SIM) để nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn,
khí He được dùng như là khí mang để đưa chất phân tích vào cột. Dung dịch mẫu
phân tích đều được khử bằng NaBH4 trước khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí.
Tuy nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau.
Tác giả L. Gao và cộng sự [16] lại sử dụng cột mao quản (10 m 0,18 mm, độ
dày màng 0,25 µm). Nhiệt độ của bơm tiêm, interface và nguồn ion lần lượt là 280,
280, 200oC. Khí mang được bơm đẳng dòng với tốc độ là 1,01 ml/phút. Mẫu được
đưa vào bằng chế độ tiêm chia dòng (10:1) và nhiệt độ giải hấp phụ lúc đầu là 70 oC
trong 1 phút và tăng đến 295oC với tốc độ 25oC/phút. Nhiệt độ 295oC được duy trì
trong 10 phút. Trong đó các mảnh ion 196 và 224 được dùng để định lượng PQ &

Vũ Anh Phương

17

Trường ĐHKH Tự nhiên


EPQ. Độ thu hồi của mẫu máu và nước tiểu lần lượt là 94,00 - 99,85% và 95,00 100,34%, khoảng tuyến tính 0,1 - 50 µg/ml. Giới hạn phát hiện (S/N = 3) là 0,01
µg/ml đối với cả máu và nước tiểu. Phương pháp này đã được áp dụng để phân tích
các mẫu sinh học thu được từ các nạn nhân chết do uống PQ.
Trong khi đó, Almeida R. M. và cộng sự [5] sử dụng trên hệ máy sắc ký GCMS (Gas chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972)
với cột mao quản fused-silica HP-5MS (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,1
µm) và chế độ đẳng dòng với tốc độ 0,6 ml/phút. Nhiệt độ của bơm và interface (bộ
phận ghép nối giữa GC và MS) là 270 oC. Bơm hoạt động ở chế độ chia dòng. Nhiệt
độ cột duy trì 80oC trong 1 phút, tăng nhiệt 10oC/phút đến 200oC và 20oC/phút đến
270oC và duy trì 270oC trong 4 phút. Số khối của các mảnh ion được chọn cho các
hợp chất là: m/z 108, 135, 190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220
(EPQ), trong đó các mảnh ion 192 và 162 được dùng để định lượng PQ & EPQ.

mM (40:60, v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc độ dòng khí làm khô là 651 l/h
ở 350oC. Điện áp mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là
4,0 V và điện áp thấu kính RzFl à 0,5 V. Định lượng bằng kỹ thuật quét ion (multireaction monitoring, MRM), bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sản
phẩm có m/z 155 và 171 đối với PQ; mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sản
phẩm có m/z 158 và 185 đối với chuẩn nội ethyl viologen [41].
Còn với tác giả Proenca P [28] phát hiện phổ (MS) được thực hiện trên máy
khối phổ tứ cực Water ZQ 2000. Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120 oC; nhiệt
độ làm khô 400oC; tốc độ dòng khí cone (N2) 0 l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N2)
600 l/h. Điện thế capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lượng
ion 0,5 V; Quét phổ từ m/z 130-500, thời gian quét 0,5 s và thời gian trễ (interscan)
0,1s. Đường chuẩn độ PQ trong máu tuyến tính từ 0,010-2,0 µg/ml trong máu
(y=0,0142x+0,1497 với r2=0,9994) và tuyến tính từ 0,025-10,0 µg/ml trong nước
tiểu (y = 0,0141x + 1,347 với r2 = 0,9994). Giới hạn phát hiện của PQ trong máu và
nước tiểu lần lượt là 0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml (LOD, S/N = 3) và giới hạn định
lượng (LOD, S/N = 10) là 0,0012 µg/ml trong máu và 0,024 µg/ml trong nước tiểu.
Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng không có pic nào trùng thời gian lưu
với PQ và chất chuẩn nội
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ trong
dịch sinh học [7][17][26].
Arys K. và cộng sự [7] sử dụng hệ thống HPLC. Gồm bơm model 126 và

Vũ Anh Phương

19

Trường ĐHKH Tự nhiên


tiêm mẫu type 210A với vòng tiêm mẫu 50 µl. Bước sóng hoạt động là 230 nm.


Trường ĐHKH Tự nhiên


sodium 1-heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). Tốc độ dòng của pha động 0,5
ml/phút và nhiệt độ cột trong khoảng từ 15-20oC. Dịch rửa từ cột HPLC được trộn
với dung dịch kiềm của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn. Tốc độ dòng 0,4
ml/phút. Hỗn hợp được dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và được làm ấm trong bể
nước SB-9 (EYELA, Tokyo, Nhật) ở nhiệt độ 20oC và đo ở bước sóng 391 nm bằng
detector UV Hitachi L- 7405. Độ cao của pic được dùng để định lượng bằng máy CR6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật). Giới hạn phát hiện của PQ và DQ là
50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết tương.
Định lượng PQ trong huyết tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
cặp ion đã được Brunetto M.R. thực hiện trên hệ thống sắc ký được sử dụng có 2
bơm, 1 bơm 2 nòng để chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model
64 để chuyển pha động vào cột chiết. Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100
hoặc 200 µl để đưa mẫu vào cột chiết. Sử dụng các cột 25 - 4 mm được lấp đầy các
hạt LiChrospher RP-18 ADS (kích thước hạt 25 µm) và cột VARIAN ODS C-18
(25 cm × 4,6 mm, hạt 5 µm) lần lượt là cột chiết và cột phân tích. Cột chiết và cột
phân tích được gắn với van xoay 6 cửa Rheodyne được điều khiển bằng bơm 2
nòng. Sử dụng detector UV-DAD Perkin-Elmer LC 235 ở bước sóng 258 nm với
flowcell 12 µm để phát hiện các tín hiệu.

Các pha động:
-

Pha động để chiết (Pha động 1): chứa natri octane sulfonate (SOS) 10mM
và acid orthophosphoric 0,05 M được pha bằng nước cất 2 lần, và lọc
màng 0,45 µm. Điều chỉnh pH đến 2,8 bằng TEA và thêm 2-propanol
nồng độ 3% (v/v).


1.3. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat
Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định
lượng đó là phương pháp xử lý mẫu.
Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu sinh
học trong phân tích PQ [5][16][20][28][41]. Một số tác giả dùng đệm phosphate để
thêm vào mẫu thử trước khi cho qua cột chiết pha rắn [5][16][41].
Cột chiết pha rắn C18 thường được dùng để chiết PQ & DQ trong mẫu thử
[20]. Dung dịch mẫu đã loại protein được chỉnh pH đến 11 bằng NaOH. Cột được
hoạt hóa bằng 5 ml nước, 5 ml methanol và 20 ml nước trước khi bơm mẫu vào cột.
3 ml nước cất được bơm qua cột để loại bỏ hoàn toàn các hợp chất khác trong máu.
Sau đó, 3 ml acid hydrochloric 0,2 M và 1 ml × 3 nước khử khoáng được cho qua
cột để rửa giải PQ & DQ. Với dịch thu được thêm 3 ml dung dịch NaOH 0.2 M.
Mẫu này được mang đi đo quang [20].

Vũ Anh Phương

22

Trường ĐHKH Tự nhiên


Chang-bin Li [5] cũng dùng cột C18 để chiết PQ, cột được rửa với 2 ml
methanol và 2 ml đệm phosphate (pH 8,0). Dung dịch mẫu được đưa qua cột rồi rửa
với 2 ml nước khử khoáng. Cuối cùng, rửa giải với 2 ml methanol và dịch rửa giải
được bay hơi ở nhiệt độ phòng dưới dòng khí nitrogen. Hòa tan cắn trong 100 µl
methanol và bơm 1 µl vào hệ thống GC-MS.
Zhaohong Wang [41] xử lý 1,0 ml máu, thêm 3 ml đệm phosphate 0,1M (pH
7) và dung dịch chuẩn nội 100 ng/ml. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút. Các cột
Waters Oasis WCX 3 ml được cho chạy qua lần lượt 3 ml methanol, 3 ml nước khử
khoáng và 1 ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7). Sau khi cho mẫu chạy qua cột, rửa cột