ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

HOÀNG HẢI YẾN

Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI CELLULOSE
TRONG DẠ CỎ ĐỘNG VẬT NHAI LẠI VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƢỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH - CNTP
: 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

HOÀNG HẢI YẾN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Văn Chí,
giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại
học Nông Lâm Thái Nguyên, đã tạo điều kiện, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ
em hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời tri ân tới các thầy cô giáo trong và ngoài khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên đã ân cần dạy dỗ, truyền đạt kiến thức chuyên môn cũng như kinh
nghiệm trong cuộc sống.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã
tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Thái Nguyên, ngày

tháng

Sinh viên

HOÀNG HẢI YẾN

năm 2015


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose ............................. 13
Bảng 3.1: Môi trường CMC ............................................................................ 21
Bảng 3.2: Môi trường thử hoạt tính cellulose ................................................. 22
Bảng 4.1: Thử sơ bộ hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn ................... 36

: Cellulose binding domain

CMC

: Careboxymethyl cellulose

HEC

: Hydroxyethyl cellulose

OD

: Optical density


v

MỤC LỤC
Trang
Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu của đề tài ...................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................... 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
2.1. Giới thiệu chung về vi sinh vật và vi khuẩn phân giải cellulose ............... 3
2.1.1. Giới thiệu về vi sinh vật ......................................................................... 3
2.1.2. Vi khuẩn phân giải cellulose ................................................................... 4

3.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn .................................................................................... 30
3.4.7. Định danh vi khuẩn ............................................................................... 32
3.4.8. Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng
vi sinh vật (nấm mốc) ...................................................................................... 32
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 34
4.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
cellulose ........................................................................................................... 34
4.1.1. Phân lập các chủng vi khuẩn ................................................................. 34
4.1.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose ........ 37
4.2. Kết quả tối ưu hóa điều kiện môi trường ................................................ 41
4.2.1. Thử khả năng đồng hóa nguồn cacbon ................................................. 41
4.2.2. Thử khả năng đồng hóa nguồn nitơ ...................................................... 43
4.3. Định danh sơ bộ vi khuẩn. ....................................................................... 46


vii

4.4. Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng vi
sinh vật khác (nấm mốc) ................................................................................. 47
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 48
5.1. Kết luận .................................................................................................... 48
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 48
PHỤ LỤC


1

Phần 1
MỞ ĐẦU

1.2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu những loài vi khuẩn có khả năng
phân giải cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại, ứng dụng sản xuất chế phẩm
sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ dịch dạ cỏ
động vật nhai lại.
- Tối ưu hóa điều kiện lên men để thu sinh khối và thu chế phẩm
enzyme.
- Định danh sơ bộ về chủng vi khuẩn mà mình phân lập được dựa vào
đặc điểm hình thái, màu sắc, độ phân giải…
- Thử khả năng khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
với các chủng vi sinh vật khác.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào
nghiên cứu khoa học.
- Củng cố cho sinh viên tác phong cũng như kỹ năng làm việc sau này.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân
tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất chế
phẩm sinh học trong bảo vệ môi trường.
- Là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

- Trong lĩnh vực bảo quản chế biến: hệ vi sinh vật trong thực phẩm và
công nghệ bảo quản chế biến thực phẩm.
- Trong lĩnh vực công nghiệp: ứng dụng vi sinh vật lên men, nhân sinh
khối tế bào sản phẩm như sản xuất protein đơn bào, sản xuất bột ngọt, bia,
rượu, cồn, nước ngọt có ga.
- Trong vấn đề năng lượng và bảo vệ môi trường: sản xuất cồn làm
nguồn năng lượng thay xăng dầu chạy xe các loại, tạo khí sinh học (biogas),
trong bảo vệ môi trường công nghệ vi sinh đã tham gia tích cực trong xử lý
phế thải công nghiệp, nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước thải, làm sạch môi
trường.
Trong vấn đề bảo vệ môi trường công nghệ vi sinh đã tham gia tích cực
trong việc xử lý phế thải công nghiệp, nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước
thải, làm sạch môi trường. Đây là vấn đề cấp thiết trên toàn cầu hiện nay.
2.1.2. Vi khuẩn phân giải cellulose
2.1.2.1. Dạ cỏ động vật nhai lại
Dung tích dạ cỏ khoảng 60÷100 lít, niêm mạc dạ cỏ có nhiều gờ nổi lên
làm tăng thêm diện tích. Dạ cỏ không có tuyến bài tiết HCL và dịch vị mà
chỉ tiết dịch nhày. Tiêu hóa trong dạ cỏ chủ yếu nhờ enzyme của vi sinh
vật cư trú trong đó.
Môi trường dạ cỏ với các đặc điểm thiết yếu cho sự lên men vi sinh vật
đó là: có độ ẩm cao (80-90%), độ pH cao (6,4-7,5), độ pH dạ cỏ tương đối ổn
định, luôn luôn được đệm bởi bicarbonate và phosphates của nước bọt, nhiệt
độ khoảng 39-410C, luôn luôn được nhào trộn bởi sự co bóp của dạ cỏ, dòng
dinh dưỡng lưu thông liên tục. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men ra
khỏi dạ cỏ và các cơ chất được nạp vào thông qua thức ăn ăn vào hàng ngày,


5

có sự chế tiết vào dạ cỏ những chất cần thiết cho vi sinh vật phát triển và

loài vi khuẩn dạ cỏ đã được mô tả (Theodorou và France, 1993). Tổng số vi
khuẩn có trong dạ cỏ thường vào khoảng 109-1010 tế bào/g chất chứa dạ cỏ.
Trong dạ cỏ vi khuẩn ở thể tự do chiếm khoảng 25-30%, số còn lại bám vào
các mẩu thức ăn, trú ngụ ở các nếp gấp biểu mô và bám vào protozoa.
Sự phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể được tiến hành dựa vào cơ chất mà
vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng. Sau đây là một
số nhóm vi khuẩn dạ cỏ chính:
- Vi khuẩn phân giải cellulose.
- Vi khuẩn phân giải hemixenlulose.
- Vi khuẩn phân giải gluxit.
- Vi khuẩn phân giải ure và vi khuẩn sử dụng NH3.
- Vi khuẩn sử dụng các axit hữu cơ tạo ra trong dạ cỏ.
- Vi khuẩn phân giải protein và dẫn xuất của protein.
- Vi khuẩn tạo metan (CH4).
- Vi khuẩn tổng hợp vitamin (B12).
Sự phân chia cũng chỉ là tương đối vì nhiều loại vi khuẩn có khả năng
phân giải nhiều cơ chất khác, ngoài khả năng phân giải chúng còn tổng hợp
chất dinh dưỡng khác nhau cho bản thân chúng mà cuối cùng là nguồn dinh
dưỡng cho động vật nhai lại [1].
Vi khuẩn phân giải cellulose là nhóm có số lượng rất lớn trong dạ
cỏ của những gia súc sử dụng khẩu phần giàu cellulose. Những loài vi khuẩn
phân giải cellulose như là:
Vi khuẩn hảo khí:
- Bacillus criculans
- Bacillus subtilis
- Cellulomonas fimi
- Cellvibrio gilvus


7


+ Hemicellulose do các đường đơn arabinose, galactose, ksilose, axit
glucoronic, manose và ramnose tạo thành. Vi sinh vật có enzyme cellulase
phân giải xơ (các vật nuôi khác không có enzyme này).
+ Hệ enzyme phân giải xơ gồm: enzyme nội bào phân giải xơ tự nhiên,
enzyme ngoại bào phân giải xơ hòa tan
Quá trình phân giải xơ gồm 3 giai đoạn chính:
Cellulose => cellobiose
Cellobiose => glucose
Glucose => axit béo bay hơi (axit axetic, propionic, butyric và valeric)
Tỉ lệ tiêu hóa xơ trong dạ cỏ từ 30÷80%. Tùy thuộc vào mức độ lignin
hóa của thức ăn. Cỏ non có tỉ lệ tiêu hóa cao, rơm rạ, cỏ già hàm lượng lignin
cao thì tỉ lệ tiêu hóa thấp hơn.
2.2. Enzyme từ vi sinh vật
2.2.1. Giới thiệu chung về cellulose
Trong tự nhiên, cellulose là một pholysaccarit có số lượng nhiều nhất,
chiếm ½ tổng lượng hydrocacbon hữu cơ trong sinh quyển, gặp phổ biến ở
thực vật là thành phần chủ yếu của tế bào thực vật. Thông thường cellulose
của thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái đất chúng ta. Hàng
ngày hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy lại trong đất do các sản
phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống. Một
phần không nhỏ là do con người thải ra dưới dạng rác rưởi, giấy vụn, mùn
cưa…Nếu không có quá trình phân giải của vi sinh vật thì lượng chất hữu cơ
khổng lồ này sẽ tràn ngập trái đất [8].
Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật cellulose có cấu tạo dạng
sợi, các sợi cellulose trong tự nhiên thường chứa khoảng 10.000-12.000 gốc
gluco, các sợi này liên kết thành bó sợi gọi là microfibrin [6].


9

mì, mạch đen…
- Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…
Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật.
Các chủng vi sinh vật thường sử dụng:
- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae…
- Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticul…
- Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis…
Cellulase thủy phân cellulose (liên kết 1,4 - β-D-glucoside) tạo ra sản
phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides.
2.2.2.3. Phân loại enzyme cellulase.
Có 3 loại enzyme cellulase chính: [20, 21, 22]
- Cellulobiohydrolase: enzyme này cắt đầu không khử của chuỗi
cellulose để tạo thành cellobiose. Khối lượng phân tử của các enzyme thuộc
nhóm này trong khoảng 53-75 kDa. Các enzyme này không có khả năng phân
giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng.
- Endo- β-D-cellulase: có khối lượng phân tử trong khoảng 42-49 kDa.
Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4
glucoside trong cellulose trong lichenin và β-D-glucan. Sản phẩm của quá
trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose.
- β-glucosidase: có khả năng hoạt động ở PH rất rộng (pH 4,4-4,8),
khối lượng phân tử trong khoảng 50-98 kDa. β-glucosidase tham gia thủy
phân cellobiose tạo thành glucose.


11

Cellulose có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự
nhiên, trong đó có nguồn gốc từ vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc
và một số loại nấm men. Do ưu điểm về thời gian sinh trưởng, kích thước,
hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất

cellubiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế
bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng thay đổi từ 30-110 KDa
(Begunin, 1990, Gilkes và cộng sự, 1991).
2.2.2.6. Sinh tổng hợp cellulase ở vi sinh vật
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong
điều kiện hiếu khí và yếm khí, bình nhiệt hoặc ái nhiệt. Các loài vi sinh vật
thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Số
lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện
tự nhiên rất phong phú, chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn được tìm
thấy nhiều trong đất, nước, đường tiêu hóa một số động vật và trong một số
trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình
phân giải cellulose [4].
Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose đã được nghiên cứu
được trình bày ở bảng sau:


13

Bảng 2.1: Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose [7]
Nấm mùn mềm

Vi khuẩn hảo khí

Aspergillus niger

Bacillus circulans

Chaetomium cellulolyticum

Bacillus subtilis


Clostridium thermocellum

Tyromyces palustris
Nấm mùn trắng

Vi khuẩn ở dạ cỏ

Phanerochaete chrysosporium

Butyrivibrio fibrisolvens

Sporotrichum thermonphile

Fibrobacter succinogenes

Coriolus versicolor

Ruminococcus albus

Nấm kỵ khí ở dạ cỏ

Xạ khuẩn

Caecomyces communis

Streptomyces lividans

Neocallimastix patriciarum



Cellobiose

β-glucosidase

Glucose [8]

(vô định hình)

Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme
cellulase endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Thiếu một trong ba
loại enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng. Từ
những nghiên cứu riêng lẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác
động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đều đưa
ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy
cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Có nhiều cách giải
thích khác nhau về cơ chế tác động của cellulose, nhiều tác giả đã trình bày sơ
đồ quá trình phân giải cellulose nhờ men (Mandes và Recse (1964); Ogawa,
Toyam (1964); Iwasaki, Hayoshi, Walabayais, Nisizwa (1964); Funata
(1965); King (1965) và Srinivasan (1973) [6].


15

Hình 2.2: Sơ đồ phân giải cellulose của Srinivasan, 1973 [6].
- A: ở nấm Trichodesma viride
- B: ở vi khuẩn Cellvibriofuvus
- C: ở nhiều vi sinh vật khác
2.3. Ứng dụng của công nghệ vi sinh vật trong xử lý rác thải
Hiện nay rác thải sinh hoạt và phế thải, nước thải nông nghiệp, công

- Protein: là hợp chất hữu cơ cao phân tử chứa nitơ, thường chứa 15% 17% nitơ, là phần quan trọng trong cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật.
- Lipit: lipit là các chất sáp có nhiều trong cơ thể sinh vật [8, 11, 13].