MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt
với tỷ lệ tử vong lên đến 30%. Bệnh do L. monocytogenes gây ra được gọi chung là
listeriosis. Đối tượng có nguy cơ bị nhiễm bệnh này thường là những người có hệ thống
miễn dịch bị suy yếu như trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người lớn tuổi. Nếu không được
điều trị kịp thời bằng kháng sinh, bệnh nhân có thể bị nhiễm trùng máu, viêm màng não,
sẩy thai và tử vong.
Vi khuẩn L. monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh. Chúng được tìm thấy ở nhiều nơi
như đất, nước, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân người hoặc phân động vật.
Chúng có thể sống và tăng trưởng chậm ở các điều kiện kh c nghiệt về nhiệt độ, hàm
lượng khí oxy, pH và hoạt độ nước. Đặc biệt loài vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng ở
nhiệt độ lạnh (0-10oC). Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L. monocytogenes
trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm được bảo quản lạnh trong thời gian dài.
Nhiều loại thực phẩm được bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn. Thêm
nữa càng ngày người ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản
hoặc không bị gia nhiệt để giữ được nguyên vẹn hương vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu.
Những sản phẩm như vậy thường được bảo quản lạnh trước khi sử dụng. Vì vậy, các sản
phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cao. Rất nhiều các vụ
ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L. monocytogenes trên kh p thế giới đã
được thông báo.
Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được từ các
vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L. monocytogenes có khả năng gây
bệnh và gây bùng phát dịch rất lớn, bên cạnh đó cũng có những kiểu huyết thanh hầu như
không có khả năng gây bệnh và gây dịch. Cho đến thời điểm này chưa có công bố nào về
dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm tại Việt Nam. Khả
năng gây bệnh và gây dịch của L. monocytogenes nhiễm trong các thực phẩm tại Việt Nam
vẫn là một ẩn số.
Phương pháp ISO 11290-1:1996 phát hiện L. monocytogenes là phương pháp nuôi cấy.
Một số các phương pháp sinh học phân tử như PCR, real-time PCR hoặc các phương pháp
miễn dịch (ELISA) cũng đã được tiêu chuẩn hóa. Mấy năm trở lại đây, cùng với sự ra đời




Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L.
monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam
Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển k thuật
LAMP cho phát hiện L. monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân
tích

4. Bố cục của luận án
Luận án bao gồm 123 trang trong đó có 2 trang mở đầu, 38 trang tổng quan, 9 trang
vật liệu và phương pháp nghiên cứu, 56 trang kết quả.
NỘI DUNG CHÍNH
Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1

Tổng quan về L. monocytogenes.

Luận án đề cập đến các vấn đề liên quan đến đặc điểm sinh lý, sinh hóa của loài L.
monocytogenes, từ đó cho thấy đây là một loài có khả năng phân bố rộng trong thực phẩm
môi trường. Các thống kê cũng cho thấy có rất nhiều các công bố về các vụ gây dịch bệnh
listeriosis do L. monocytogenes gây lên có liên quan đến các loại thực phẩm khác nhau
trong đó chủ yếu là các loại thực phẩm có bảo quản lạnh trong thời gian dài. Chính vì vậy
trong luận án này phần phân lập cũng được tiến hành chủ yếu trên các mẫu thực phẩm có
quá trình bảo quản lạnh trước khi sử dụng.
1.2 Tổng quan về các phƣơng pháp phân loại dƣới loài L. monocytogenes
Các phương pháp phân loại dưới loài dựa theo kiểu hình như enzyme hoặc kháng thể
thường cho độ phân loại không cao, nên không phù hợp trong các nghiên cứu dịch tễ học
các chủng L. monocytogenes gây dịch bệnh. Các phương pháp phân loại dưới loài dựa trên
kiểu gen hiện nay khá phổ biến. Tuy nhiên kết quả phân loại phụ thuộc rất lớn vào cơ sở

cấy vi khuẩn
Môi trường: Môi trường cơ bản cho tăng sinh; môi trường phân lập L. monocytogenes
Các cặp mồi cho PCR, real time PCR, LAMP
2.2.

Các thiết bị sử dụng chủ yếu

Một số thiết bị sử dụng cho PCR, real-time PCR, điện di, siêu âm, ly tâm, bảo quản lạnh và
lạnh đông, nuôi cấy vi sinh vật
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
 Phân lập L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm
 Phản ứng PCR khẳng định L. monocytogenes và khuếch đại các gen giữ nhà cho
giải trình tự
 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh sạch
GeneJETTM PCR Purification (Fermentase) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
 Các phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại
dưới loài MLST và cơ sở dữ liệu của viện Pasteur Pháp ( www.pasteur.fr/mlst)
 Giải trình tự gen: Tiến hành tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Mỗi trình tự gen
được giải trình tự 2 chiều.
 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4
 Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy của phản ứng LAMP
 Phản ứng Real-time PCR
 Các phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn
 Kiểm định bộ sinh phẩm
 Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm
 Phương pháp phát hiện L. monocytogenes theo TCVN 7700-1: 2007 và ISO 112901:1996
3


Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

tr n môi trường RAPID’L.mono
: Mẫu dương t nh , , : a khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu cá hồi , ,7: a khuẩn lạc nghi ngờ từ một
mẫu c ch v i khuẩn lạc giếng 7 được khẳng định là L. monocytogenes , , 0, : n khuẩn lạc nghi
ngờ từ một mẫu sushi : mẫu âm t nh
: thang chuẩn 00 bp O’GeneRuler TMcủa Fermentas

4


Tổng hợp các kết quả phân tích phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm đã
phân tích từ năm 2011 đến 2015 được trình bày trong Bảng 3-1 sau.
Bảng 3-1 Tổng hợp kết quả phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Việt Nam
trong khoảng thời gian từ 0

Loại thực phẩm

đến 0

Số lƣợng
mẫu thực
phẩm

Số lƣợng chủng
phân lập đƣợc

Tỷ lệ nhiễm
(%)

Xúc xích


Bơ, sữa thanh trùng

45

1

2,22

Rau ăn sống

37

0

0

Sushi

52

1

1,92

Bánh mỳ kẹp thịt, hoa quả dầm

29

0


trên ngân hàng dữ liệu được các kiểu trình tự tương ứng của từng gen. Tổ hợp kiểu trình tự
7 đoạn gen của từng chủng phân lập là một kiểu trình tự (ST), một dòng phức hợp (CC) và
thuộc một dòng giống. Từ các kiểu ST này phân loại 48 chủng phân lập được thành 16
nhóm có kiểu ST khác nhau. Nối 7 đoạn gen giữ nhà của mỗi nhóm với nhau, so sánh trình
tự 7 đoạn gen của 16 nhóm này với 25 trình tự 7 đoạn gen tương ứng của các chủng đã
từng gây dịch bệnh listeriosis trên thế giới. Sử dụng phần mềm clustal W thông qua mô
5


hình NJ (Neighber joining) với độ lặp lại (bootstrap) 1000. Xây dựng được cây phân loại
như Hình 3-3.

Hình 3-3 Cây phân loại các nh m chủng L. monocytogenes đã phân lập được từ thực phẩm
Chữ đ : T n các nh m và ký hiệu các chủng, dự đoán kiểu serotype của các chủng L. monocytogenes phân
lập được từ thực phẩm Việt Nam
Chữ đen: Các chủng L. monocytogenes đã từng gây ra các vụ bùng phát dịch bệnh tr n thế gi i đã công b
trình tự 7 đoạn gen giữ nhà tr n ngân hàng dữ liệu MLST

Kết quả cho thấy, đã xuất hiện dòng L. monocytogenes (chủng ký hiệu M49 phân lập từ
thịt ba rọi xông khói) có trình tự các gen cấu trúc giống hệt các chủng có tần suất cao gây
các vụ dịch lớn trên thế giới. Nhóm 1 chiếm 17 48 chủng có trình tự 7 đoạn gen giống hệt
với trình tự các đoạn gen tương ứng của một số chủng gây ra vụ thai lưu năm 2005 tại
Nga, vụ dịch tại Italia năm 1997. Và gần giống trình tự các đoạn gen tương ứng từ chủng
phân lập từ vụ dịch tại Pháp năm 1993. Đa số các chủng còn lại, trình tự gen giống các
chủng phân lập từ thực phẩm và gần giống các trình tự phân lập từ người hoặc gây ra các
vụ dịch nhỏ trên thế giới.
3.2.

Xây dựng quy trình phân tích nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm
dựa trên kỹ thuật LAMP

3-FIP
3-BIP
4-F3
4-B3
4-FIP
4-BIP
5-F3
5-B3
5-FIP
5-BIP
6-F3
6-B3
6-FIP
6-BIP
7-F3
7-B3
7-FIP
7-BIP
8-F3
8-B3
8-FIP
8-BIP

3.2.1.2.

Trình tự (5’-3’)
CATGGTTTCAAACCCGCT
AATGCTGCTGCTACCTCT
GTTGGTTGAGTTGAGCTTGTTTCTT-TTTAACATTCGCAGCAACG
ACACACTCAAAGCCGGTCAA-TTTT-AGCAAAATTGTCATCAGGAA


Thực hiện các phản ứng LAMP với từng bộ mồi và sử dụng DNA khuôn là DNA tổng số
tinh khiết của L. monocytogenes EGD-e với lượng là 20, 2, 0,2 và 0 pg phản ứng. Sau đó,
điện di 10 l sản phẩm trên gel agarose. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-4.

7


Hình 3-4. Kết quả sàng l c các bộ mồi LAMP dựa tr n khả n ng khuếch đại DNA của L.
monocytogenes
Trong đ
, , ,
, 7, ,
0, ,
, ,
, 0,
, ,
7, ,
, ,

: , , , : DNA chuẩn GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific)
: Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,
0 pg phản ứng
: Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,
0 pg phản ứng
, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,
0 pg phản ứng
7, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,
0 pg phản ứng
, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,


Số lƣợng
allele

Trình tự mồi sau thay
thế nucleotide suy biến

2

CATTACYACYCTTGATCTTAGC

1

CCACAAACTCAATTAACAACCT

2

CAAACCTTGAYGTAACCCCGC

CATTACCACCCTTGATCTTAGC
B3C

CCACAAACTCAATTAACAACCT

F2

CAAACCTTGACGTAACCCCGC

Mồi B3c nằm trong vùng bảo thủ
hoàn toàn

GCGCAACACCCTAACCGAAA

3.2.1.3.

2

GCGCAACACCYTAACCGAAA

T i ưu phản ứng LAMP

8


Ảnh hƣ ng của nhiệt độ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng
LAMP
Khảo sát đồng thời ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và nồng độ betaine đến hiệu quả khuếch đại
của phản ứng LAMP. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-5.
Từ kết quả này, chúng tôi đã lựa chọn điều kiện nhiệt độ ủ 65 oC với nồng độ betain là 0,9
M (giếng 13) cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3-5 nh hư ng của nhiệt độ ủ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP.
Trong đ :
: DNA chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder (Thermo Scientific)
o
, : Sản phẩm LAMP
C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng
o
, : Sản phẩm LAMP
C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng
o

, , : Sản phẩm LAMP v i lượng DNA khuôn là 0, pg phản ứng, thời gian ủ l n lượt là , 0, 7 ph t

9


Kết quả cho thấy kết quả khuếch đại thực sự bão hòa sau 60 phút phản ứng (đường chạy số
4). Do vậy, chúng tôi lựa chọn thời gian ủ là 60 phút cho phản ứng LAMP ở điều kiện tối
ưu là 65oC và nồng độ betain là 0,9 M.
3.2.1.4. Kiểm tra độ đặc hiệu, độ bao trùm của phản ứng LAMP
Xác định tính bao trùm của phản ứng với một tập hợp 16 chủng L. monocytogenes. Kết quả
điện di sản phẩm LAMP (Hình 3-7) cho thấy độ bao trùm của phản ứng LAMP với DNA
của các chủng thuộc loài L. monocytogenes là 100%.

Hình 3-7 ộ bao trùm của phản ứng LAMP v i các chủng L. monocytogenes
Trong đ :
: Thang chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific);
: Mẫu kiểm chứng âm t nh
, , , và 7: Sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L. monocytogenes ATCC
19117, L. monocytogenes EGD-e, L. monocytogenes LO28; L. monocytogenes CIP7835; L. monocytogenes
DSM20750;
đến : sản phẩm LAMP v i DNA khuôn của các chủng L. monocytogenes được phân lập từ thực phẩm

Hình 3-8 ộ ch n l c của phản ứng LAMP v i các loài Listeria khác và các vi khuẩn thường
nhi m tạp trong thực phẩm
Trong đ :
: thang chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mi Thermo Scientific : âm t nh
, , , và 7: sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L. monocytogenes ATCC
19117, L. monocytogenes EGD-e, L. monocytogenes LO28; L. monocytogenes CIP7835; L. monocytogenes
DSM20750
đến : sản phẩm LAMP v i 0 ng DNA khuôn của l n lượt các chủng L. innocua ATCC 0

fg 1, fg DNA

Hình 3-10 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu v i HN
Trong đ :
7,6,5,4,3 Ống phản ứng LAMP v i l n lượt 0 fg

fg

fg

fg

fg

u

hu g L. monocytogenes

EGD-e

Kết quả trên cho thấy độ nhạy của hai phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP nghiên cứu
tương đương nhau.
3.2.1.6.

So sánh độ nhạy bộ mồi LAMP thiết kế v i các bộ mồi LAMP đã công b

Tiến hành phản ứng LAMP với 4 bộ mồi, 1 bộ mồi LAMP đã thiết kế được với 3 bộ mồi
tham chiếu đã được công bố trình tự. Kết quả thể hiện trên Hình 3-10.

11


Loại
môi
trƣ ng
cơ bản

TSBYE TSBYE
có
không
Kháng
có
sinh
kháng
sinh

BLEB
có
kháng
sinh

BLEB
không
có
kháng
sinh

Half
fraser
có
kháng

14,26
± 1,16

21,47
± 2,01

18,29
± 1,45

25,77
± 1,78

24,57
± 1,13

12


Kết quả cũng cho thấy môi trường HF và BLEB cho giá trị Ct thấp nhất và gần ngang
nhau. Trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành tăng sinh mẫu xúc xích trên môi
trường BLEB với nồng độ kháng sinh như ở môi trường Half Fraser (acriflavin và nalidixic
acid lần lượt là 12,5 mg l và 10 mg l) trong 12 giờ, được kết quả như Bảng 3-5.
Bảng 3-5

nh hư ng của hai loại môi trường cơ bản LE và HF đến sự sự t ng sinh của L.
monocytogenes trong canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm

Loại
trƣ ng
Ct

nồng độ từ 0,6 đến 1,6 g l với mật độ nhiễm là 2,7 x 102 CFU ml, sau 3 giờ nuôi, lấy canh
trường đo độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 600 nm. Kết quả cho thấy mật độ vi khuẩn đạt
cao nhất là tại giá trị nồng độ pyruvate đạt 1,2 và 1,4 g l. Qua thí nghiệm này chúng tôi lựa
chọn nồng độ pyruvate cần bổ sung vào môi trường BLEB là 1,2 g l.
3.2.2.3.

nh hư ng của nalidi ic acid và acriflavin đến sự sinh trư ng của L.
monocytogenes

Vi khuẩn được nuôi trong những môi trường có nồng độ kháng sinh khác nhau, sau 4
giờ, xác định giá trị OD 600 nm thu được kết quả như Hình 3-14 sau:
13


Hình 3-13 nh hư ng của nồng độ acriflavin và axít nalidi ic đến sự sinh trư ng của L.
monocytogenes trong môi trường LE

canh trường thu n

Khi nồng độ hai loại kháng sinh trên giảm xuống 5 mg l, thì sự sinh trưởng của L.
monocytogenes là tương đương với mẫu không có kháng sinh (sự sai khác không có ý
nghĩa). Do vậy, trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành xem xét khả năng ức chế
của các kháng sinh ở nồng độ thấp.
3.2.2.4.

nh hư ng của kháng sinh đến sự sinh trư ng của một s loài vi khuẩn khác

Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng của acriflavin và acid nalidixic lên ba loài vi khuẩn
E. coli, Staphylococcus aureus và Lactobacillus plantarum ở 3 nồng độ 2,5; 5 và 10 mg l
trong môi trường BLEB đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy, với nồng độ kháng sinh 5

0,655

Acriflavin (2,5 mg/l)

0,116

0,105

0,096

0,231

Acriflavin (5 mg/l)

0,124

0,144

0,138

0,138

Acriflavin (10 mg/l)

0,115

0,105

0,103


0,109

Không kháng sinh

0,031

0,596

2,357

4,5

Acriflavin (2,5 mg/l)

0,03

0,039

0,034

0,045

Acriflavin (5 mg/l)

0,039

0,041

0,037


0,036

0,037

Nadilixic (10 mg/l)

0,025

0,036

0,036

0,047

Không kháng sinh

0,144

ND

2,254

2,959

Lactobacillus

14


plantarum


Nadilixic (2,5 mg/l)

0,118

ND

0,541

0,943

Nadilixic (5 mg/l)

0,117

ND

0,142

0,055

Nadilixic (10 mg/l)

0,123

ND

0,138

0,052

Ct

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Kết quả trên thêm một lần nữa kh ng định ở nồng độ kháng sinh 5 mg l cho khả năng
tăng sinh L. monocytogenes tốt hơn so với nồng độ kháng sinh 10 mg l.
3.2.3. Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA
Tro g ội du g ày á phươ g pháp tá h hiết
đượ đá h giá thô g qu giá trị
Ct ủ phả ứ g re l-time PCR, giá trị Ct à g hỏ hiệu suất tá h hiết
à g lớ .
3.2.3.1. Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng triton X 00 kết
o
hợp si u âm và gia nhiệt
C
Mỗi thí nghiệm được tiến hành tách chiết với các lượng sinh khối tế bào như nhau. Lần
lượt thay đổi từng yếu tố: Nồng độ triton X100 trong đệm chiết (0,6% đến 2,4%), thời gian
gia nhiệt ở 95 °C (2-15 phút); thời gian siêu âm (0-4 phút), ly tâm thu dịch nổi có chứa
DNA cho phản ứng Real-time PCR. Kết quả được trình bày trong các bảng sau.
Bảng 3-8 nh hư ng của nồng độ Triton X 00 đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes.

Nồng độ triton X100 (%)
Ct

0,6

1,2

1,8


15,92± 0,51

15,56 ± 1,04

15,61 ± 1,12

15,73 ± 0,75

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Bảng 3-10 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X 00.

Th i gian siêu âm
(phút)

Không
siêu âm

0,5

1

2

4

Ct


monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH.

Th i gian (phút)

5

10

15

20

Ct

21,53 ± 1,12

21,86 ± 0,45

21,13 ± 1,21

21,89 ± 1,04

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Bảng 3-12 nh hư ng của nồng độ NaOH đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes

Nồng độ NaOH (mM)
Ct


Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

16


Bảng 3-13 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH.

Th i gian siêu âm (phút) 0
Ct

20,72
± 1,12

0,5

1

2

3

4

19,46 ± 17,72 ± 16,35 ± 16,81 ± 18,93
0,71
1,04
0,54
0,84
± 0,97


33

Ct
30
27
24
21
18
15
NaOH

Tri ton

Ki t

Thông thường

Hình 3-15 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường t ng sinh
mẫu

c ch khi sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X 00, sinh phẩm thương mại GeneJET
Genomic DNA Purification Kit và quy trình tách chiết thông thường.

Kết quả phân tích cho thấy khả năng tách chiết DNA từ mẫu xúc xích bằng phương
pháp sử dụng kít cho kết quả tách chiết tốt nhất. Hai phương pháp sử dụng NaOH và
phương pháp sử dụng Triton X100 cho kết quả tách chiết tương đương nhau. Phương pháp
tách chiết DNA thông thường làm sạch DNA rất tốt, tuy vậy qúa trình tách chiết khá phực
tạp mất nhiều thời gian và sử dụng nhiều dung môi độc hại, không phù hợp cho phân tích
trong thực tế khi số mẫu lớn.


nh hư ng của lượng mẫu l y tách chiết DNA cho phản ứng LAMP

Nhiễm chủ động lượng tế bào vi khuẩn 6 CFU/25 g, tăng sinh 12 giờ, tách chiết DNA cho
phản ứng real-time PCR và LAMP. Kết quả thể hiện ở Bảng 3-14 sau:
Bảng Error! No text of specified style in document.-14 nh hư ng của thể t ch mẫu canh
trường t ng sinh được sử dụng đến khả n ng phát hiện L. monocytogenes bằng kỹ thuật LAMP và
real-time PCR

Thể tích mẫu (ml)
Real time PCR

1

10
ức chế

+

20

30

ức chế

ức chế

LAMP (quan sát kết tủa sản Khó phát
phẩm phụ bằng m t thường)
hiện

Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng 3 loại mẫu, nhiễm chủ động, tăng sinh 10, 12, 14
giờ, lấy mẫu cho tách chiết thu DNA cho phản ứng LAMP. Kết quả thể hiện trên Hình 319

19


Hình 3-17 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh và nền mẫu đến khả năng phát hiện L.
monocytogenes dựa trên kỹ thuật LAMP khuếch đại gen inlJ
Trong đ :
(- Mẫu âm t nh phản ứng LAMP
, , : L n lượt là mẫu c ch, mẫu mayonair và mẫu sữa không nhi m L. monocytogenes.
, , : L n lượt là mẫu c ch nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh 0, , giờ. 7, , : l n lượt là mẫu
c ch nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh 0, , giờ.
0, : L n lượt là mẫu mayonair nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh , giờ.
, : L n lượt là mẫu sữa nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh , giờ

Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn thời gian tăng sinh cho mẫu thịt là ≥ 10 giờ, cho mẫu
sữa và mayonair là ≥ 12 giờ.
3.2.4. Đề xuất quy trình phân tích
Từ những kết quả thu được ở trên chúng tôi đề xuất quy trình phân tích L. monocytogenes
dựa trên phản ứng LAMP như sau:
Tăng sinh chọn lọc
37oC/12 gi

Lấy mẫu tách chiết DNA (ly tâm 10.000 g/3 phút, gia nhiệt 95 oC/5
phút, siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g/2 phút)

thực hiện 1 mẫu dương tính (thay DNA mẫu bằng DNA tách chiết từ L. monocytogenes
EGD-e với nồng độ bản sao l), 1 mẫu âm tính phản ứng LAMP (thay DNA từ mẫu bằng
nước cất). Các hóa chất yêu cầu ở mức tinh khiết và phù hợp cho sinh học phân tử.
Đọc kết quả:
Sau phản ứng LAMP, quan sát màu dung dịch phản ứng, mẫu chuyển dung dịch phản ứng
từ màu xanh tím than sang màu xanh da trời là mẫu dương tính (Hình 3-10).
3.2.5.

n

n

n

n

Để xác định độ nhạy toàn bộ quy trình phân tích, chúng tôi nhiễm mẫu ở các mật độ khác
nhau dao động trong khoảng xấp xỉ 1-10 CFU/ 25 g mẫu bình 225 ml môi trường. Tăng
sinh 12 giờ lấy mẫu xác định sự có mặt của L. monocytogenes. Xác định mật độ chính xác
đã nhiễm vào mẫu bằng hậu kiểm canh trường giống đã sử dụng để nhiễm mẫu bằng
phương pháp trải trên đĩa môi trường O.A Listeria, sau đó quy ngược lại ra mật độ nhiễm
ban đầu. Sau tăng sinh 12 giờ, lấy mẫu xác định sự có mặt của L. monocytogenes bằng
phương pháp LAMP và cấy trải đĩa sau đó lấy khuẩn lạc đặc trưng chạy real-time PCR.
Những mẫu dương tính với phản ứng real-time PCR mới được coi là mẫu đã được nhiễm.
Kết quả thí nghiệm này được trình bày ở bảng sau:

21


Bảng 3-15 ộ nhạy quy trình phát hiện L. monocytogenes theo kỹ thuật LAMP

Thành phần bộ kít
Bộ kít được thiết kế gồm hai hợp phần cho hợp lý về mặt k thuật, bảo quản và tiện về mặt
sử dụng.
Thành ph n cho t ng sinh LAMP-L’MONO – M)
Gồm 10 túi mỗi túi chứa 10,83 g môi trường BLEB
Thành ph n cho tách chiết DNA và phản ứng LAMP LAMP-L’MONO – D)
- Dung dịch số 1: Đệm Glycine 0,1 M, pH 8,3. Thể tích 2 x 1,5 ml
- Dung dịch A: 33,33 mM Tris-HCl; 16,66 mM KCl; 13,33 mM MgSO4; 0,16 %
Triton X-100; 1,66 mM dNTP, 2 M betain, 2,66 M các mồi FIP và BIP; 0,33 µM
các mồi F3 và B3; 200 µM HNB. Thể tích 12 l, số lượng 10 ống eppendorf 0,5
ml
- Dung dịch B: Bst 120 U (1 ống x 15 l)
- Dung dịch C: Nước (ultrapure, DNAse, RNAse free) (1 ống x 50 µl)
- Dung dịch D: Kiểm chứng dương tính: 20
monocytogenes với nồng độ 1000 bản sao l
3.2.5.2.

l dung dịch DNA Listeria

iều kiện bảo quản bộ sinh phẩm

Bộ sinh phẩm được thiết kế gồm 2 phần riêng biệt là phần môi trường tăng sinh (LAMPL’MONO – M) được bảo quản ở 4 oC, và phần các loại hóa chất cho tách chiết và phản
ứng LAMP (LAMP-L’MONO – D) được bảo quản ở điều kiện - 20 oC. Theo các hướng
dẫn sử dụng và bảo quản các hóa chất ở thể chưa trộn lẫn thành hỗn hợp thì các hoá chất
cho phản ứng LAMP và tách chiết DNA hoàn toàn bền ở nhiệt độ - 20 oC.
3.2.5.3.

Sản u t thử nghiệm bộ sinh phẩm

Bộ sinh phẩm được sản xuất thử nghiệm quy mô phòng thí nghiệm.

cấy theo TCVN 7700-1:2007.
Kết quả trên cho thấy trong 30 mẫu thực phẩm lấy trên thị trường có 10 mẫu cho kết quả
dương tính cả 3 phương pháp. Phương pháp sử dụng bộ sinh phẩm có độ tương đồng 100%
với hai phương pháp tham chiếu là PCR và TCVN 7700-1:2007.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Luận án đã thu đƣợc những kết quả chính sau:
1.
Đã phân lập được 59 chủng L. monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với
tỷ lệ nhiễm chung là 10,87 %. Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất là xúc
xich và thịt hun khói c t lát.
2.
Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được cho thấy:
48 chủng L. monocytogenes phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và
lineage II có 8 chủng. Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn lineage
II. Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV và 1 chủng
thuộc ECI có nguy cơ gây bùng phát dịch bệnh cao. 48 chủng có tất cả 16 ST trong đó có
ST1 đặc biệt nguy hiểm vì ST1 đã từng gây ra nhiều vụ bùng phát dịch lớn trên thế giới.
3.
Đã thiết kế được phản ứng LAMP cho phát hiện nhanh L. monocytogenes, bao
gồm: thiết kế bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ, điều kiện tối ưu cho phản ứng LAMP
là nhiệt độ 65oC, thời gian 40-60 phút, nồng độ betain 0,9 M.
4.
Đã tối ưu được quy trình phân tích trực tiếp L. monocytogenes từ thực phẩm dựa
trên phản ứng LAMP, bao gồm: tăng sinh mẫu trong môi trường BLEB ở 37oC, tốc độ l c
150 vòng/phút trong thời gian 10 giờ cho sản phẩm thịt và 12 giờ cho sản phẩm sữa và
mayonair; cải tiến phương pháp tách chiết nhanh thu DNA từ canh trường tăng sinh mẫu
thực phẩm. Quy trình phân tích đạt độ nhạy 1 CFU/25 g với tổng thời gian phân tích 12-14
giờ.
5.

Phát triển mẫu nội chuẩn

Từ đó có thể đưa phương pháp này thành một phương pháp thay thế các phương pháp nuôi
cấy tốn nhiều thời gian và nhân công, nhằm góp phần kiểm soát sự nhiễm tạp loài vi khuẩn
nguy hiểm này dễ dàng hơn.

24