ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

PHẠM THỊ LAN

ỨNG DỤNG CHẾ TẠO, THỬ NGHIỆM VACXIN ĐA GIÁ
VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH PHÙ ĐẦU, HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY
Ở LỢN DO VI KHUẨN E.COLI VÀ SALMONELLA GÂY RA
TẠI THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

PHẠM THỊ LAN

ỨNG DỤNG CHẾ TẠO, THỬ NGHIỆM VACXIN ĐA GIÁ
VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH PHÙ ĐẦU, HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY
Ở LỢN DO VI KHUẨN E.COLI VÀ SALMONELLA GÂY RA
TẠI THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60 64 01 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Nguyễn Quang Tuyên

Nguyên, phòng Quản lý đào tạo Sau đại học, khoa Chăn nuôi Thú y, trường
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được theo học
chương trình đào tạo thạc sỹ tại trường.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ khoa Chăn nuôi Thú y, trường
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; Bộ môn Vi trùng -Viện Thú y Quốc gia và
Chi cục Thú y tỉnh Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi
nhất để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy hướng dẫn
khoa học là GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên và PGS.TS. Cù Hữu Phú đã trực
tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành
luận văn.
Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè và các học viên cao học động viên và
giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn./.
Thái Nguyên, tháng
HỌC VIÊN

Phạm Thị Lan

năm 2015


iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... ii
MỤC LỤC ......................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ................................................ v
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... vi
MỞ ĐẦU............................................................................................................ 1

dịch của đàn lợn sau tiêm phòng vaccin đa giá phòng bệnh phù
đầu, tiêu chảy, phó thương hàn ở lợn do vi khuẩn E. coli và
Salmonella gây ra........................................................................... 41
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 43
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 46

3.1. Kết quả lựa chọn các chủng vi khuẩn để chế tạo vaccin ...................... 46
3.2. Kiểm nghiệm vaccin phòng bệnh phù đầu, tiêu chảy, phó thương
hàn cho lợn ................................................................................................... 47
3.2.1. Kết quả kiểm tra đậm độ của canh trùng sử dụng chế tạo vaccin........ 48
3.2.2. Kết quả kiểm tra thuần khiết của canh trùng sử dụng chế tạo vaccin .. 49
3.2.3. Kết quả kiểm tra vô trùng của 3 lô vaccin chế tạo được ............... 50
3.2.4. Kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng ........................................... 51
3.2.5. Kiểm tra hiệu lực bảo hộ của vaccin trên chuột nhắt trắng ........... 53
3.2.6. Kết quả xác định hiệu lực của vaccin trên lợn thí nghiệm ............. 55
3.3. Kết quả xác định độ dài miễn dịch và hiệu lực của vaccin .................. 58
3.3.1. Kết quả xác định độ dài miễn dịch của vaccin............................... 58
3.3.2. Hiệu lực của vaccin phòng bệnh cho lợn nuôi tại Thái Nguyên .... 64
3.3.3. Nguy cơ lợn lợn con bị tiêu chảy do không tiêm vaccin ............... 65
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 67

1. Kết luận ................................................................................................... 67
2. Đề nghị .................................................................................................... 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 68


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu
và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai

vi khuẩn Salmonella ..................................................................... 54
Bảng 3.9: Kết quả xác định hiệu lực của vaccin trên lợn thí nghiệm ............. 56
Bảng 3.10: Hiệu giá kháng thể của vaccin sau khi tiêm phòng 1 tháng ......... 60
Bảng 3.11: Hiệu giá kháng thể của vaccin sau khi tiêm phòng 2 tháng ......... 61
Bảng 3.12: Hiệu giá kháng thể của vaccin sau khi tiêm phòng 3 tháng ......... 61
Bảng 3.13: Hiệu giá kháng thể của vaccin sau khi tiêm phòng 4 tháng ......... 62
Bảng 3.14: Hiệu giá kháng thể của vaccin sau khi tiêm phòng 5 tháng ......... 63
Bảng 3.15: Tỷ lệ lợn con mắc bệnh tiêu chảy giữa vùng tiêm phòng và
vùng không tiêm phòng vaccin ..................................................... 64
Bảng 3.16: Nguy cơ lợn con bị tiêu chảy do không tiêm phòng vaccin ......... 66


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của nền kinh tế,
ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng của nước ta đã có
những bước phát triển mạnh mẽ, trở thành ngành sản xuất quan trọng, chiếm
tỷ trọng đáng kể trong xuất khẩu các sản phẩm chăn nuôi và góp phần xóa đói
giảm nghèo.
Theo định hướng được Thủ tướng Chính phủ phê duyệt trong Quyết định
số 10/2008/QĐ-TTg ngày 16/01/2008 [22] về Chiến lược phát triển chăn nuôi đến
năm 2020 [3], mục tiêu của định hướng là: Phát triển nhanh quy mô đàn lợn
ngoại theo hướng trang trại, công nghiệp ở nơi có điều kiện về đất đai, kiểm
soát dịch bệnh và môi trường; duy trì ở quy mô nhất định hình thức chăn nuôi
lợn lai, lợn đặc sản phù hợp với điều kiện chăn nuôi của nông hộ và của một
số vùng. Tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp đến năm 2020 đạt trên 42%,
trong đó năm 2010 đạt khoảng 32% và năm 2015 đạt 38%; Đảm bảo an toàn
dịch bệnh và vệ sinh an toàn thực phẩm, khống chế có hiệu quả các bệnh
nguy hiểm trong chăn nuôi; Các cơ sở chăn nuôi, nhất là chăn nuôi theo

chế tạo, thử nghiệm vaccin đa giá vô hoạt phòng bệnh phù đầu, hội chứng tiêu
chảy ở lợn do vi khuẩn E. coli và Salmonella gây ra tại Thái Nguyên”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella sử dụng chế tạo thử
nghiệm vaccin đa giá phòng bệnh cho lợn;
- Xác định hiệu lực của vaccin đa giá phòng bệnh phù đầu, tiêu chảy,
phó thương hàn ở lợn do vi khuẩn E. coli và Salmonella gây ra tại Thái Nguyên.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tế
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Nghiên cứu chế tạo vaccin đa giá từ các chủng vi khuẩn E. coli và
Salmonella phân lập được;


3
- Xác định hiệu lực của vaccin đa giá trong thực tế là cơ sở khoa học để
xây dựng các biện pháp phòng bệnh hiệu quả cho đàn lợn.
3.2. Ý nghĩa thực tế
- Sử dụng vaccin đa giá tiêm phòng cho lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên
góp phần giảm tỷ lệ lợn mắc phù đầu, tiêu chảy, phó thương hàn do vi khuẩn E.
coli và Salmonella gây ra, tăng hiệu quả và thu nhập cho người chăn nuôi.


4
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn E. coli và bệnh phù đầu, tiêu chảy ở lợn do E. coli
1.1.1. Vi khuẩn E. coli

Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) trước đây được gọi là Bacterium coli
commune hay Bacillus coli communis, lần đầu tiên phân lập được từ phân trẻ em

Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia súc rất đa dạng
và phức tạp với 4 nhóm kháng nguyên chính là các kháng nguyên O (kháng
nguyên thân), H (kháng nguyên lông), K (kháng nguyên giáp mô), và F
(kháng nguyên bám dính) (Gyles và Fairbrother.J.M, 2010) [46]. Bằng phản
ứng ngưng kết, các nhà khoa học đã tìm ra được 250 serotype O, 89 serotype
K, 56 serotype H và một số serotype F. Khi xác định serotype đầy đủ của 1
chủng vi khuẩn E. coli thì phải xác định đủ cả 3 loại kháng nguyên nói trên.
Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân - Ohne Hauch) được coi như là
một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào và có liên hệ trực tiếp với hệ
thống miễn dịch. Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ
xảy ra phản ứng ngưng kết. Ngưng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt
nhỏ, khó tan.
Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch) là thành phần lông của
vi khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O.
Kháng nguyên H không phải là yếu tố độc lực của vi khuẩn, nhưng có khả
năng tạo miễn dịch mạnh. Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng
nguyên O.
Kháng nguyên H của vi khuẩn E. coli không có vai trò bám dính,
không có tính độc và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ
nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong xác định
giống loài của vi khuẩn (Orskov.F, 1978) [58].


6
Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ bọc - Capsular), còn được gọi là
kháng nguyên bề mặt (OMP - Outer membrane protein) hoặc kháng nguyên
vỏ bọc (Capsular). Vai trò của kháng nguyên K chưa được thống nhất. Có rất
nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về độc lực của vi khuẩn, vì thấy
rằng độc lực của chủng E. coli có kháng nguyên K cũng giống độc lực của
chủng không có kháng nguyên K (Orskov.F, 1978) [58]. Tuy nhiên, có ý kiến

chương trình đào tạo thạc sỹ tại trường.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ khoa Chăn nuôi Thú y, trường
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; Bộ môn Vi trùng -Viện Thú y Quốc gia và
Chi cục Thú y tỉnh Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi
nhất để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy hướng dẫn
khoa học là GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên và PGS.TS. Cù Hữu Phú đã trực
tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành
luận văn.
Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè và các học viên cao học động viên và
giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn./.
Thái Nguyên, tháng
HỌC VIÊN

Phạm Thị Lan

năm 2015


8
chất chứa ra ngoài, gây nên hiện tượng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở
thành ruột, vi khuẩn vào hệ lâm ba, đến hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng máu.
Trong máu, vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết, làm cho
cơ thể thiếu máu. Từ hệ tuần hoàn, vi khuẩn đến các tổ chức cơ quan. Ở đây,
vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ hai, phá huỷ tế bào tổ chức, gây viêm
và sản sinh độc tố gồm Enterotoxin và Verotoxin, phá huỷ tế bào tổ chức, gây
tụ huyết và xuất huyết.
b. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli
Các yếu tố gây bệnh của E. coli bao gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố

thuộc nhóm ETEC, gây bệnh tiêu chảy ở lợn trước và sau cai sữa (Nagy và cs,
1999) [56].
F5 (K99): F5 trước kia được cho là kháng nguyên bám dính của E. coli
chỉ gây bệnh ở bê, nghé và cừu. Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng được tìm thấy
với tỷ lệ thấp ở các chủng ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy (Links và cs, 1985)
[52]. Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như: Tốc độ
sinh trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt độ và alanine trong môi trường Các gen mã
hóa cho sự tổng hợp F5 nằm trên ADN của plasmid (Isaacson, 1977) [47].
F6 (987p): Các nhà khoa học cho rằng, fimbriae này đóng vai trò quan
trọng trong việc gây bệnh của ETEC. F6 của ETEC ở lợn có thể giúp vi khuẩn
bám vào cả các receptor cấu tạo bởi glycoprotein và glycolipid trên riềm trải
của các tế bào biểu mô ruột (Dean và cs, 1989, 1994) [38, 39]. F6 bám dính ở
màng nhầy để phân phối độc tố đường ruột tối đa đến vật chủ.
F18: F18 là tên đặt cho nhân tố bám dính 8813. Bởi vậy, một loại
fimbriae mới đã được đề nghị công nhận là F18ab và F18ac (Rippinger và cs,
1995) [61]. Một nghiên cứu của Nagy và cs (1996) [55] thấy rằng F18ab và
F18ac khác nhau về mặt sinh học. F18ab ít thấy thể hiện ở cả trong điều kiện
thực tế và trong phòng thí nghiệm. Chúng thường thấy cùng với việc sản xuất
SLT-2e ở các chủng VTEC, trong khi F18ac thể hiện rất rõ ở cả trong thực tế
và trong phòng thí nghiệm, chúng mang các đặc tính của các chủng ETEC.


10
Một đặc điểm đáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải
của lợn sơ sinh trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm (Nagy và cs,
1992 ), [54] cũng không tập trung ở lớp màng nhầy của ruột ở lợn con mới
sinh (Casey và cs, 1992) [35]. Điều này ngược với F5 và F6, chúng bám vào
các tế bào biểu mô ruột. Khả năng bám này ở lợn cai sữa nhiều hơn so với lợn
sơ sinh. Lý do xác đáng để giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với bám dính
của F18ab và F18ac theo tuổi của lợn vẫn chưa được làm rõ, nhưng có thể là do

Độc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin - LT): Độc tố này bị vô hoạt
ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút. LT cũng có hai nhóm phụ LT1 và LT2,
nhưng chỉ có LT1 bị trung hòa bởi Anticholerae toxin. LT là một trong những
yếu tố quan trọng gây triệu chứng tiêu chảy (Faibrother và cs, 1992) [41]. Cả 2
loại độc tố ST và LT đều bền vững ở nhiệt độ âm, thậm chí cả ở nhiệt độ -200C.
Nhóm độc tố tế bào (Shiga /Verotoxin):
Một số tác giả đã phát hiện một loại độc tố hoạt động trong môi trường
nuôi cấy tế bào Vero (nên chúng được đặt tên là độc tố tế bào Vero), được sản
sinh bởi vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy ở người, tiêu chảy và bệnh phù đầu
ở lợn con. Ảnh hưởng gây bệnh ở tế bào của độc tố Vero rất khác so với ảnh
hưởng của độc tố đường ruột không chịu nhiệt cổ điển ở nhóm vi khuẩn E. coli
gây bệnh đường ruột (ETEC). Độc tố Vero (VTs) hay Shiga (SLTs) là thuật ngữ
được sử dụng trước đây. Gần đây, các nhà khoa học đã đề nghị sử dụng tên độc
tố Shiga (Stx) cho tất cả những độc tố tế bào này. Stx sản sinh bởi E. coli bao
gồm 2 nhóm: Stx1và Stx2. Độc tố Shiga ở lợn là một loại trong nhóm độc tố
Stx2 với một số khác biệt trong đặc tính sinh học. Stx1 và Stx2 gây độc cho tế
bào Hela. Stx2e kém độc hơn, nhưng gây độc mạnh cho tế bào Vero.
* Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên
Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù các vi khuẩn E. coli có nhiều loại
kháng nguyên, trong đó, có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại


12
không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhưng đều tham gia vào quá trình gây
bệnh bằng cách tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham
gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ. Các kháng
nguyên tham gia quá trình trên phải kể đến là kháng nguyên O, kháng nguyên K,
kháng nguyên F.
* Yếu tố dung huyết (Hly)
Để phát triển trong cơ thể, vi khuẩn E. coli cần được cung cấp sắt. Hầu


ỉa chảy ở

+

+

O9K30

lợn sơ

+

+

O9K103

sinh và

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+


L V F4 F5
F6
F41
T T
K99
987P
+
+

+

+

+

+

+

+

O141K85

VTEC

+

O45KE65

AEEC

MỞ ĐẦU............................................................................................................ 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1
2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tế .......................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4

1.1. Vi khuẩn E. coli và bệnh phù đầu, tiêu chảy ở lợn do E. coli ................. 4
1.1.1. Vi khuẩn E. coli................................................................................ 4
1.1.2. Bệnh tiêu chảy ở lợn do vi khuẩn E. coli ...................................... 12
1.1.3. Bệnh phù đầu lợn con.................................................................... 16
1.2. Vi khuẩn Salmonella và bệnh tiêu chảy, bại huyết do Salmonella ở lợn ... 19
1.2.1. Vi khuẩn Salmonella ...................................................................... 19
1.2.2. Bệnh tiêu chảy bại huyết ở lợn do Salmonella............................... 29
1.3. Vaccin phòng bệnh phù đầu, tiêu chảy, bại huyết ở lợn ...................... 33
Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................ 36

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................ 36
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................... 36
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................ 36
2.1.3. Động vật thí nghiệm ....................................................................... 36
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 36
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 37
2.3.1. Các loại hóa chất, môi trường dùng để nuôi cấy, giám định vi khuẩn ....... 37
2.3.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn ...................................... 37


15
chết do tiêu chảy thường gầy, bẩn, thân bê bết phân, mắt trũng sâu, tím tái ở
mũi, tai. Phổi nhợt nhạt và khô, hạch treo ruột bị tụ huyết tím bầm. Niêm mạc

lợn mẹ hai lần vào lúc 6 và 12 tuần tuổi trước khi đẻ để tạo kháng thể truyền
qua sữa đầu, bảo vệ lợn con trong một vài tuần lễ đầu sau khi đẻ hoặc dùng
vaccin cho lợn con uống 3 - 5 ngày, 1 lần/ngày sau khi sinh để tạo miễn dịch
chủ động ở đường ruột. Sau đó, tiêm vaccin Salco cho lợn khi được 3 tuần
tuổi để chống tiêu chảy trước và sau cai sữa. Hiện nay, trên thị trường Việt
Nam, ngoài vaccin trong nước sản xuất đang lưu hành các loại vaccin do nước
ngoài sản xuất như: Neocolipor của Nissan Chemical Industries, vaccin Litter
Guard LT-C của Embrex INC sản xuất phòng tiêu chảy do E. coli và
Clostridium perfringens, Rokovac của hãng Bioveta, A.S phòng bệnh tiêu
chảy do E. coli và Rotavirus suis ở lợn, Porcili coli của Intervet.
1.1.3. Bệnh phù đầu lợn con
Bệnh phù đầu lợn con do một số serotyp kháng nguyên O của E. coli
sau đây gây ra: O138, O139K12H1, O141K85q, O141K85ac.
Ở Việt Nam, Nguyễn Khả Ngự (2000) [18], phân lập, định typ vi
khuẩn E. coli gây bệnh phù đầu lợn ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long đã
phát hiện được 11 serotyp, nhưng chiếm tỷ lệ cao nhất là O26 và O139. Trịnh
Quang Tuyên (2004) [32] phân lập E. coli gây bệnh phù đầu ở trại chăn nuôi
tập trung các tỉnh phía Bắc, phát hiện 7 serotyp, trong đó chủ yếu là O139
chiếm 34,8% và O138 chiếm 18,5%. Để gây được bệnh, ngoài các yếu tố gây
bệnh có ở E. coli gây tiêu chảy cần phải có yếu tố bám dính F18 thay cho F4,
độc tố tế bào (Stx2e), độc tố thần kinh và các yếu tố gây dung huyết mà chủ
yếu là α-haemolytic. Nhờ các yếu tố gây bệnh, vi khuẩn vào máu gây nhiễm
trùng huyết, trong máu yếu tố dung huyết phá vỡ hồng cầu làm máu loãng,
độc tố tế bào vừa phá hủy tế bào tổ chức gây bệnh tích, vừa tăng tính thành
mạch, nước từ hệ tuần hoàn đi vào mô bào gây hiện tượng phù. Độc tố thần
kinh tác động vào trung ương thần kinh gây nên các triệu chứng thần kinh
như: run rẩy và co giật.


17