ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HOÁ HỌC

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - năm 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR

Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH

nhận đ-ợc những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn.
Hà nội ngày 12 tháng 12 năm 2012
Học viên

Nguyễn Tiến Dũng


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH ................................................................................................. 1
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ........................................................................................................ 2
MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................................... 5
1.1. BETA LACTAM ............................................................................................................. 5
1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM ........................................................................................ 6
1.2.1. Phản ứng Staudinger ................................................................................................. 6
1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể ................................................. 7
1.3. PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ......................................................... 10
1.3.1. Phƣơng pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym ...................................... 10
1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ .................................. 11
1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại ........................ 11
1.3.4. Phân tích các đối quang nhờ phƣơng pháp NMR ................................................... 12
1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) .............................................................. 20
1.4.1. Khái niệm ............................................................................................................... 20
1.4.2. Phân loại ................................................................................................................. 20
1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ................................................................................. 20
1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo ............................................................................... 21
1.4.5. DETECTOR DAD.................................................................................................. 22
1.4.6. DETECTOR MS .................................................................................................... 23
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM ................................................................................................ 25
2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu và trang thiết bị. ................................................................... 25

DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam .............................................................................. 3
Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và (R)-1phenylbutan-1-ol............................................................................................ 10
Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1phenylbutan-1-ol............................................................................................ 10
Hình 1.4. Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA ........... 12
Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trƣờng hợp .............................. 13
Hình 1.6. Cặp tín hiệu Fiedel.................................................................................... 14
Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phƣơng pháp X-Ray ..... 14
Hình 1.8. Phổ CD của hợp chất A và B .................................................................... 16
Hình 1.9. Cấu trúc của cột ODS ............................................................................... 18
Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang ............................................................... 19
Hình 1.11. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell). .... 20
Hình 3.1. Phổ 1H của hợp chất 9a ............................................................................ 32
Hình 3.2. Phổ 1H của hợp chất 9b ............................................................................ 33
Hình 3.3. Phổ 1H của hợp chất 9c............................................................................. 33
Hình 3.4. Phổ 1H của hợp chất 9d ............................................................................ 34
Hình 3.5. Phổ 1H của hợp chất 9e............................................................................. 35
Hình 3.6. Phổ 1H của hợp chất 9f ............................................................................. 35
Hình 3.7. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9a ....................................................... 37
Hình 3.8. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9b ...................................................... 38
Hình 3.9. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9c ....................................................... 38
Hình 3.10. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9d .................................................... 38
Hình 3.11. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Positive..................................... 40
Hình 3.12. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Negative ................................... 40
Hình 3.13. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 1 ............... 42
Hình 3.14. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 2 ............... 42
Hình 3.15. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 3 ............... 42
Hình 3.16. Sắc ký đồ của hợp chất 9a ...................................................................... 43

Hình 3.17. Phổ MS của pic 1 (hợp chất 9a) .................................................... 44

Chú thích

1

SKPB

Sắc ký phân bố

2

SKPD

Sắc ký pha đảo

3

SKPT

Sắc ký pha thuận

4

HPLC

High-performance liquid chromatography

5

MS


4


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. BETA LACTAM
β-lactam đƣợc phân loại dựa theo cấu trúc vòng cơ sở và đƣợc chia thành
4 nhóm:








β-lactam kết hợp với vòng 5 cạnh bão hòa.
o

β-lactam có chứa vòng thiazolidine đƣợc gọi tên là penams (A)

o

β-lactam có chứa vòng pyrrolidine đƣợc gọi tên là carbapenams (B)

o

β-lactam hợp nhất để oxazolidine vòng đƣợc gọi tên là oxapenams
hoặc clavams (C)

β-lactam kết hợp với vòng năm cạnh không bão hòa:



Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam
Hợp chất chứa vòng β-lactam đƣợc ứng dụng chủ yếu trong thực tế là làm
thuốc kháng sinh.
1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM
Azetidin-2-ones(β-lactams) đại diện cho một nhóm các hợp chất rất quan
trọng do hoạt tính sinh học nổi tiếng của chúng [9] và là hợp chất trung gian
trong tổng hợp hữu cơ [13]. Nhiều phƣơng pháp tổng hợp β-lactam đã đƣợc phát
triển nhƣ: phản ứng cộng vòng [2+2], phản ứng tạo vòng, phản ứng gắn thêm
carbene, và phản ứng sắp xếp lại các hợp chất dị vòng [14],[9].
1.2.1. Phản ứng Staudinger
Phản ứng Staudinger, phản ứng của ketene với các hợp chất chứa chức
imine, là phƣơng pháp tổng hợp quan trọng nhất điều chế β–lactam. Kể từ khi
đƣợc phát hiện ra bởi Staudinger [15], phản ứng này từ lâu đã đƣợc nghiên cứu
thực nghiệm và lý thuyết để hiểu cơ chế của nó và là cơ sở cho việc chọn lọc lập
thể. Nó đƣợc áp dụng để tổng hợp một loạt các cấu trúc β-lactam (Sơ đồ 1.1).
Hiện nay phản ứng này vẫn là một trong những phƣơng pháp tốt nhất cho quá
trình tổng hợp β –lactam [14].

Sơ đồ 1.1. Phản ứng Staudinger
6


1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể
Cơ chế của phản ứng Staudinger đƣợc đƣa ra bởi Hegedus là cơ chế mô tả
tốt nhất [15]. Imine, tác nhân nucleophile tấn công orbital nguyên tử trống
(LUMO) của nhóm đồng phẳng carbonyl ketene tạo ketene thế. Quá trình tấn
công xảy ra ở bên phía ít cản trở (cách tiếp cận exo), với mặt phẳng của imine
vuông góc với ketene, tạo ra các trung gian zwitterion (5) (sơ đồ 1.2).

thể xảy ra dễ dàng hơn khi thêm vào một tác nhân nucleophile của một enolate
nhóm chức của imine hơn là quá trình electrocyclic. Tăng mật độ điện tử cho
ketene thế và giảm mật độ điện tử cho imine thế làm tăng phản ứng đóng vòng
(tăng k1), dẫn đến hình thành chủ yếu cis- β –lactam. Mặt khác, làm giảm mật độ
electron của ketene thế và làm tăng mật độ electron imine sẽ làm giảm giá trị k1
và có lợi cho phản ứng đồng phân hóa, dẫn đến hình thành chủ yếu trans- β –
lactam. Các hiệu ứng điện tử của các nhóm thế trên đồng phân là một yếu tố nhỏ
trong chọn lọc lập thể. Cuối cùng, sau khi so sánh các phản ứng tƣơng tự thực
hiện trong các điều kiện khác nhau, các tác giả cũng thừa nhận rằng không có
ảnh hƣởng của sóng viba [15] hoặc ánh sáng trong độ chọn lọc lập thể của phản
ứng Staudinge [21].
Độ chọn lọc lập thể cũng chịu ảnh hƣởng bởi tính chất của dung môi, các
dung môi không phân cực có lợi cho sự hình thành cis- β –lactam, trong khi
dung môi phân cực thuận lợi cho sự hình thành trans. Ngoài ra, cách ketene
8


đƣợc hình thành và thứ tự của bổ sung các tác nhân, cũng ảnh hƣởng đến độ
chọn lọc lập thể của sản phẩm [27]. Sự xuất hiện của các orbital liên hợp giữa
ketene và tác nhân imine ảnh hƣởng đến độ chọn lọc lập thể của sản phẩm tƣơng
tự nhƣ nhiệt độ [19].
Một phƣơng pháp rất hiệu quả để thu đƣợc trans- β -lactam đƣợc phát
triển bởi Lectka và đồng nghiệp bằng cách sử dụng muối (12) nhƣ một anion
xúc tác ái nhân (Sơ đồ 1.4). Trên thực tế, biện pháp này không hiệu quả với acyl
clorua béo [28].

Sơ đồ 1.4. Sử dụng muối 12 tổng hợp β-lactam
Việc sử dụng sorbyl clorua (16) nhƣ một một tiền chất của
butadienylketene thu đƣợc một số kết quả thú vị liên quan đến đồng phân lập thể
không đối quang. Khi phản ứng Staudinger đƣợc thực hiện với N-aryl imine, thu



1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ
Hỗn hợp raxemic hoặc hai đồng phân của các hợp chất đối quang có một
tâm bất đối thƣờng không thể tách ra khỏi nhau. Tuy nhiên, khi tham gia phản
ứng với các chất bổ trợ chiral có từ một hoặc nhiều tâm bất đối, tạo thành sản
phẩm có từ hai tâm bất đối trở lên, có thể tách đƣợc bằng các phƣơng pháp hóa
lý khác nhau. Dựa vào tính chất quan trong này năm 1953, Pasteur đã tách đƣợc
đôi đồng phân đối quang của axit tactaric nhờ sự tạo muối “dia” của hỗn hợp hai
đối quang với (+)-cinchotoxin, có độ tan khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau
bằng phƣơng pháp kết tinh. Phƣơng pháp này vẫn đƣợc sử dụng hiệu quả để
tách hỗn hợp hai đồng phân đối quang ra khỏi nhau.

Ngoài ra, có thể chuyển hóa các đối quang của các hợp chất có một tâm
bất đối thành các đồng phân “dia” nhờ phản ứng với tác nhân bất đối bổ trợ
khác. Các đồng phân “dia” nhận đƣợc có thể tách ra bằng các phƣơng pháp hóa
lý khác nhau. Cuối cùng các tác nhân bất đối bổ trợ đƣợc loại bỏ, thu đƣợc các
đồng phân đối quang tinh khiết.

1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại
Các đối quang có thể đƣợc tách nhờ các phƣơng pháp sắc ký khí (GC),
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có sử dụng các cột chiral. Bản chất của các
phƣơng pháp này là các hỗn hợp đối quang tƣơng tác với pha tĩnh (tâm bất đối
trên cột chiral), nghĩa là chỉ một trong các đối quang có tƣơng tác mạnh hơn với
11


tâm bất đối của cột. Đối quang có tƣơng tác yếu sẽ đƣợc rửa giải nhanh nhờ pha
động, kết quả là hai đối quang đƣợc tách ra khỏi nhau. Phƣơng pháp này thƣờng
đƣợc sử dụng để xác định độ chọn lọc đối quang trong của các phản ứng. Nếu

nghiên cứu thành đồng phân dia. Cơ sở của phƣơng pháp Mosher là chuyển hợp
chất có một tâm bất đối thành đồng phân dia bằng cách thực hiện phản ứng của
hợp chất nghiên cứu với axit R-Mosher để tạo thành este hoặc thành amit… Sau
đó, nghiên cứu cấu hình của các hợp chất dia này sẽ đƣa ra đƣợc cấu hình của
chất ban đầu. Ví dụ, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan12


1-ol có một tâm bất đối, Mosher đã tổng hợp este của nó với axit R-Mosher để
tạo ra hai đồng phân dia nhƣ mô tả trong sơ đồ dƣới đây.

Hai đồng phân dia này sẽ đƣợc phân biệt rõ trên phổ cộng hƣởng từ hạt
nhân proton. Tín hiệu của proton bậc ba tại trung tâm bất đối của dẫn xuất este
Mosher của (R)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch chuyển về phía trƣờng cao, trong khi
tín hiệu proton bậc ba tại tâm bất đối của dẫn xuất (S)-1-phenylbutan-1-ol sẽ
dịch chuyển về phía trƣờng thấp. Nhƣ vậy, ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu
hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-1-ol ban đầu.

Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và
(R)-1-phenylbutan-1-ol

Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1phenylbutan-1-ol
13


Ngoài axit R-Mosher, hiện nay ngƣời ta đang nghiên cứu sử dụng một số
tác nhân bổ trợ khác để xác định cấu hình tuyệt đối của một số hợp chất ancol,
amin và axit cacboxylic có một tâm bất đối, ví dụ nhƣ các tác nhân bổ trợ sau.

b). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Chiral Pirkle ancol (CSA)
Chiral aryltrifluorometyl carbinol (chiralPirkle ancol) là những tác nhân

đƣợc trong từ trƣờng. Tuy nhiên, khi đƣợc tạo phức với tác nhân chuyển dịch
Eu(hfc)3 thì có sự tách tín hiệu. Nhóm metyl (triplet) đƣợc tách thành hai triplet
có cƣờng độ tƣơng đƣơng nhau. Sự tách tín hiệu của proton trong từ trƣờng phụ
thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu và nồng độ của tác nhân chuyển dịch.
Qua ví dụ trên ta thấy, tín hiệu proton ở nhóm CH3 của hỗn hợp (R,S)-1axetyl-1-phenylbutan khi tạo phức với Eu(hfc)3 đều đƣợc tách ra và có độ
15


chuyển dịch hóa học chuyển về phía trƣờng thấp. Sự tách tín hiệu và độ chuyển
dịch hóa học proton ở nhóm CH3 của hai đối quang có sự khác biệt rõ ràng. Đối
với (R)-1-axetyl-1-phenylbutan, tín hiệu proton của nhóm CH3 đƣợc chuyển
dịch về phía trƣờng cao so với (S)-1-axetyl-1-phenylbutan. Nhƣ vậy, có thể phân
biệt và xác định đƣợc tỷ lệ hai đồng phân (R)-1-axetyl-1-phenylbutan và (S)-1axetyl-1-phenylbutan nhờ 1H-NMR của chúng khi tạo phức với tác nhân chuyển
dịch Eu(hfc)3 (xem hình 5).

Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trƣờng hợp
1.3.5. X-ray tinh thể
a. Giới thiệu chung
Phƣơng pháp X-ray phân tử là phƣơng pháp hiện đại nhất để xác định cấu
trúc phân tử của một hợp chất hữu cơ. Từ phƣơng trình Bragg, ngƣời ta tính toán
độ dài của các cạnh tế bào cơ sở (a,b,c), chỉ số Miler (h,k,l), góc giữa các trục
tinh thể (α,β,γ), thể tích tế bào tinh thể cơ sở (V) và số lƣợng phân tử (n) xây
dựng nên tế bào cơ sở.
Phƣơng trình Bragg: 2d.sin(θ) = nλ
Thể tích tế bào cơ sở: V = abc(1-cos2α-cos2β-cos2γ+2cosαcosβcosγ)1/2
Số lƣợng phân tử trong một tế bào cơ sở n = V.d.6,023.1023 (d: tỷ trọng
g/cm3)
Mặt khác, khi chiếu bức xạ tia X vào phân tử, ở mỗi trung tâm liên kết sẽ
phát ra một cặp tín hiệu Friedel phản xạ theo hai hƣớng (h,k,l) và hƣớng ngƣợc
lại (-h,-k,-l). Cƣờng độ của tín hiệu Friedel (Fhkl, F-h,-k-l) đƣợc tính toán nhờ

Phƣơng pháp Bijvoet: Do mỗi trung tâm bất đối khi đƣợc chiếu bức xạ tia
X sẽ phát ra một cặp tín hiệu bất thƣờng Friedel, lợi dụng nguyên tắc này
Bijvoet đã so sánh tín hiệu tán xạ của một nguyên tử đánh dấu với tín hiệu của
cặp bức xạ Friedel ở trung tâm bất đối phản xạ theo hƣớng (h,k,l) và hƣớng
ngƣợc lại (-h,-k,-l), để xác định cấu hình tuyệt đối.
Phƣơng pháp so sánh chỉ số R: Chỉ số R đƣợc xây dựng trên cơ sở hàm
thống kê Hamilton từ toàn bộ dữ liệu của các cặp đồng phân đối quang và đƣợc
so sánh với các tính toán Bijvoet để xác định kiểu đồng phân đối quang. Nếu giá
trị của chỉ số R có sự sai khác, dù rất nhỏ (±0,1%) thì phải đánh giá lại các giá
trị này bằng phƣơng pháp thống kê.
Nhƣ vậy, cả hai phƣơng pháp này chỉ dựa vào tia phản xạ đặc biệt có
cƣờng độ cao do ảnh hƣởng của cấu trúc ở những trung tâm bất đối của phân tử
mà chƣa so sánh đƣợc những tia tán xạ yếu. Những yếu tố tán xạ yếu chỉ đƣợc
sử dụng khi dữ liệu X-ray có số lƣợng lớn. Phƣơng pháp X-ray tinh có thể sử
dụng hữu hiệu nhất đối với các hợp chất không chứa nguyên tử nặng hơn oxi.
Với những chất quang hoạt không tồn tại ở dạng đơn tinh thể, ngƣời ta có
thể xác định cấu hình tuyệt đối của chúng bằng cách cho chúng phản ứng với
một chất khác có chứa một hay nhiều trung tâm bất đối đã biết cấu hình tuyệt
đối. Các hợp chất có cấu hình tuyệt đối đã biết đƣợc chọn để nghiên cứu trong
phƣơng pháp này là những chất có khả năng dễ kết tinh để nhận đƣợc dạng đơn
tinh thể. Việc xác định cấu hình tuyệt đối của các hợp chất quang hoạt bằng
phân tích X-ray đƣợc thực hiện dựa vào phần cấu hình tuyệt đối của chất gắn kết
với chất nghiên cứu. Ngoài ra, việc đƣa nhóm nguyên tử nặng nhƣ halogen (Cl,
Br, I) vào phân tử hợp chất quang hoạt cũng cho ph p xác định cấu hình tuyệt
đối của chất đó nhờ phƣơng pháp Bijvoet ở trên.

Ví dụ hidroxy lacton chƣa biết cấu hình tuyệt đối đƣợc chuyển thành este
với axit Mosher để tạo thành đồng phân dia. Trong trƣờng hợp chất tạo thành
thu đƣợc dƣới dạng đơn tinh thể, cấu hình tuyệt đối của hydroxy lacton đƣợc
18



1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
1.4.1. Khái niệm
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968
trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một
phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột
là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên
một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến bằng liên kết hóa học với
các nhóm chức hữu cơ. Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và
phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lƣợng tốt, thích hợp tách
các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp HPLC rất rộng, nhƣ phân tích các
hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh
vực thực phẩm, dƣợc phẩm, môi trƣờng…
1.4.2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngƣời ta
chia HPLC thành 4 loại:


Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).



Sắc ký phân bố (partition chromatography).



Sắc ký ion (ion chromatography).