BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HUỲNH THỊ ANH BẢO

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH SỰ PHÂN BÀO CỦA
YẾN SÀO TẠI KHÁNH HÒA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA –2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HUỲNH THỊ ANH BẢO

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH SỰ PHÂN BÀO CỦA
YẾN SÀO TẠI KHÁNH HÒA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngành đào tạo:

Công nghệ sinh học

Mã số:


và được chỉ rõ nguồn gốc.
Khánh Hòa, ngày tháng năm 2016
Tác giả luận văn

iii


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường,
Khoa Sau đại học, Trường Đại học Nha Trang đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa đã tận tình
hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện
luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quý thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi
trường và tập thể lớp CHSH-2013 đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ, động viên trong quá
trình học tập, nghiên cứu và các hoạt động khác tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Ræder Inger Lin Uttakleiv, Đại học
Tromsor, Na Uy đã giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu hoàn thành đề tài.
Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Công ty TNHH NN MTV
Yến Sào Khánh Hòa đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực
hiện đề tài, đã tạo điều kiện về nguyên vật liệu và những ý kiến đóng góp quý báu để tôi
thực hiện tốt đề tài tốt nghiệp của mình.
Khánh Hòa, ngày tháng năm 2016
Tác giả luận văn

iv


MỤC LỤC

1.3.5.2. Enzym Alcalase ...................................................................................15
v


1.3.5.3. Enzyme Flavourzyme ..........................................................................15
1.4. Tổng quan về nấm men và Saccharomyces cerevisiae ......................................15
1.4.1. Đặc điểm chung của nấm men ....................................................................15
1.4.2. Quá trình phân bào của nấm men Saccharomyces cerevisiae ....................17
1.4.2.1. Hình thức sinh sản ...............................................................................17
1.4.2.2. Chu trình sinh sản của nấm men Saccharomyces cerevisia ................18
1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men ............................ 18
Chương 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......21
2.1. Nội dung nghiên cứu .........................................................................................21
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................21
2.3. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................21
2.4. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 21
2.4.1. Mẫu nghiên cứu ..........................................................................................21
2.4.2. Enzyme sử dụng trong nghiên cứu ............................................................. 21
2.4.3. Nấm men sử dụng trong nghiên cứu ........................................................... 22
2.4.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu ..........................................22
2.4.4.1. Dụng cụ, trang thiết bị .........................................................................22
2.4.4.2. Hóa chất ............................................................................................... 22
2.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................23
2.5.1. Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu ........................................................... 28
2.5.2. Phương pháp xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng khoáng ....................28
2.5.3. Phương pháp xác định hàm lượng protein ..................................................29
2.5.4. Phương pháp xác định protein hòa tan bằng phương pháp Biuret .............30
2.5.5. Phương pháp xác đinh hàm lượng carbohydrate ........................................31
2.5.6. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo ................................................31
2.5.7. Phương pháp xác định hàm lượng acid sialic .............................................33


Mẫu yến nhà được trích ly bằng enzyme α-Amylase 1,5% và enzyme
Alcalase 1,5%

C

Cacbon

Ca

Canxi

ĐC

Đối chứng

DNA

Deoxyribonucleic acid

F1

Mẫu yến thiên nhiên được trích ly bằng enzyme α-Amylase 1,5% và
enzyme Flavourzyme 1,5%

F2

Mẫu yến nhà được trích ly bằng enzyme α-Amylase 1,5% và enzyme
Flavourzyme 1,5%


Magie

Neu5Ac

Acid sialic

P

Phosphor

rpm
V
YPD
YPDA

revolutions per minute
Thể tích
Yeast Pepton D-glucose
Yeast Pepton D-glucose Agar

viii


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình1.1. Một số loài đại diện của các họ Apodidae (Aerodramus fuciphagus),
Hemiprocnidae (Hemiprocne coronata), Trochilidae (Archilochus alexandri) (theo
thứ tự từ trái sang phải) ....................................................................................................

3



Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của nấm men khi bổ sung nồng độ dịch
yến F1 khác nhau ........................................................................................................... 51
Hình 3.16. Khuẩn lạc giữa mẫu F1 1% so với mẫu đối chứng ............................................ 53
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae khi bổ
sung dịch yến H1 có nồng độ khác nhau...................................................................... 54
Hình 3.18. Khuẩn lạc giữa mẫu H2 2% so với mẫu đối chứng ........................................... 56
Hình 3.19. Hình thái của khuẩn lạc ........................................................................................ 57
Hình 3.20. Hình thái của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae ................................ 58
Hình 3.21. Kích thước tế bào mẫu A1 so với kích thước tế bào mẫu đối chứng ................ 58

x


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Thành phần hóa học của yến thiên nhiên và yến nhà.......................................36
Bảng 3.2. Hàm lượng protein tổng của yến thiên nhiên và yến nhà................................ 38
Bảng 3.3. Hàm lượng carbohydrate của yến thiên nhiên và yến nhà .............................. 42
Bảng 3.4. Hàm lượng lipid của yến thiên nhiên và yến nhà ............................................43
Bảng 3.6. Tốc độ phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae ở mẫu A1 bổ sung
nồng độ yến khác nhau .........................................................................................49
Bảng 3.7. Số lượng tế bào nấm men ở mẫu A1 và A2 khi bổ sung với nồng độ khác nhau
............................................................................................................................... 50
Bảng 3.8. Tốc độ phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae ở mẫu F1 bổ sung
nồng độ yến khác nhau .........................................................................................52
Bảng 3.9. Số lượng tế bào nấm men ở mẫu yến F1 và F2 khi bổ sung dịch yến với nồng
độ khác nhau .........................................................................................................53
Bảng 3.10. Tốc độ phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae ở mẫu F1 bổ sung
nồng độ yến khác nhau .........................................................................................55
Bảng 3.11. Số lượng tế bào nấm men ở mẫu yến H1 và yến H2 khi bổ sung dịch yến được

dựng đường cong sinh trưởng, nuôi cấy nấm men đếm khuẩn lạc và quan sát kích thước
tế bào dưới kính hiển vi quang học.
Kết quả nghiên cứu xác định được thành phần hóa học của yến thiên nhiên cao hơn
so với yến nhà và so sánh thành phần hóa học của yến sào tại Khánh Hòa với các khu
vực khác. Xây dựng đường cong sinh trưởng của tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisiae từ các mẫu bổ sung dịch yến có nồng độ khác nhau. Sau 19 giờ bắt đầu từ
thời gian nuôi cấy, mẫu đối chứng không bổ sung dịch yến tốc độ sinh trưởng của nấm
xii


men đã kết thúc pha log, bắt đầu vào pha cân bằng và các mẫu có bổ sung dịch yến thì
khoảng từ 15 -19 giờ. Số khuẩn lạc của mẫu đối chứng khoảng 26 khuẩn lạc, mẫu bổ
sung dịch yến từ 26 – 55 khuẩn lạc. Hiệu suất trích ly bằng phương pháp nhiệt độ cao
hơn so với phương pháp trích ly bằng enzyme, và giữa hai loại enzyme thì hiệu suất
trích ly bằng enzyme α – Amylase kết hợp với enzyme Alcalase cao hơn so với α –
Amylase kết hợp với enzyme Flavourzyme. Với các nồng độ thì 1,5% hoặc 2% dịch yến
thì đem lại hiệu quả tốt nhất. Tuy nhiên kích thước của tế bào nấm men giữa mẫu đối
chứng và mẫu bổ sung dịch yến không có sự khác nhau rõ ràng.
Các thành phần hóa học của yến thiên nhiên và yến nhà được xác định và có nhận
định ban đầu yến sào có ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisiae. Kết quả nghiên cứu này làm cơ sở nghiên cứu ảnh hưởng
của yến sào tới các tế bào khác, các nghiên cứu chuyên sâu về các thành phần amino
acid, glucan có trong tổ yến và so sánh thành phần của yến ở Khánh Hòa với các khu
vực khác trong nước và ngoài nước. Và kết quả nghiên cứu này làm cơ sở khoa học cho
các ứng dụng của yến sào vào trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm.
Từ khóa: yến sào, thành phần hóa học, phân bào, nấm men Saccharomyces
cerevisae, đường cong sinh trưởng.

xiii


-

Xác định thành phần cơ bản của yến nuôi (yến nhà).

-

So sánh thành phần của yến thiên nhiên, yến nhà và các loại yến trong khu vực

Đông Nam Á.

1


-

Ảnh hưởng của tổ yến tới sự phân bào của tế bào nấm men Saccharomyces

cerevisiae.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
 Ý nghĩa khoa học
- Xác định được thành phần cơ bản có trong tổ yến thiên nhiên và yến nhà ở
Khánh Hòa.
- Ảnh hưởng của yến sào tới sự phân bào của tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisiae.
 Ý nghĩa thực tiễn
- Làm tiền đề cho các ứng dụng của yến sào trong các sản phẩm thực phẩm, mỹ
phẩm và thuốc.

2


1.1.2. Vị trí địa lý và phân bố
Hầu hết các loài yến trong giống Aerodramus phân bố ở các vùng nhiệt đới thuộc
khu vực Ấn Độ Dương – Thái Bình Dương và không di cư. Loài Aerodramus fuciphagus
phân bố ở phía đông, từ các quần đảo Andaman và Nicobar ở Ấn Độ Dương đến Đông
Nam Á và các quần đảo Lesser Sunda (Glenister và cs., 1971)

Hình 1.2. Phân bố của các loài yến Aerodramus fuciphagus, Aerodramus maximus,
Collocalia spp. tại các khu vực địa lý khác nhau.
(Nguồn: />
Theo hình trên có thể thấy loài yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus phân bố tại
các quốc gia: Việt Nam (từ khu vực miền trung đến miền nam), Campuchia, Malaysia,
Singapore và Indonesia. Loài chim yến tổ đen Aerodramus maximus phân bố trong phạm
vi hẹp hơn: Malaysia và một phần của lãnh thổ Indonesia. Riêng giống Collocalia lại có
phạm vi phân bố rộng hơn cả, bao gồm phần lãnh thổ của Malaysia, Indonesia,
Philippines.

4


1.2. Tổng quan về tổ chim yến
1.2.1. Hình dạng
Tổ yến bao gồm nhiều phiến mỏng được dệt từ nhiều sợi tơ bằng nước bọt chim
yến và bện vào nhau, nó bị đông cứng lại sau khi tiếp xúc với không khí. Là một vật
chất hữu cơ thiên nhiên và dễ hấp thụ. Tổ yến hình dạng như cái bát do chim trống xây
trong khoảng thời gian 35 ngày và các tổ dính vào các thành hang động hoặc vách đá.
Hình dáng ưa thích nhất của tổ yến là hình nửa cái ly nhưng mà rộng, không dày
và không có lỗ.
Hầu hết tổ chim yến được chia thành ba loại: loại A, loại B và loại C như hình 1.3.
Hình dạng của tổ hạng A tương tự như hình nửa cái cốc với 1800. Hạng B hình dạng
tương tự như hạng A nhưng nó tạo góc 1350 khi đặt trên mặt phẳng nằm ngang. Hạng C

có màu đỏ tươi và là loại có giá cao nhất trong tất cả các loại yến. Mỗi năm loại yến

6


huyết này thu hoạch 1- 2 lần với tỉ lệ rất nhỏ. Số lượng yến này chưa chiếm tới 10%
tổng lượng tổ yến trên thị trường thế giới.
Nghề khai thác yến tại Việt Nam những người thợ yến và buôn bán yến chuyên
nghiệp thường phân biệt theo đẳng cấp như:
Huyết (đỏ, do vị trí chim yến làm tổ, tổ dần dần chuyển sang màu đỏ)
Hồng (Màu hồng, do vị trí chim yến làm tổ, tổ dần dần chuyển sang màu hồng)
Quan (to, tổ yến có trọng lượng khoảng 10g trở lên)
Thiên (ở trên cao, tổ trắng, từ 8 – 10g)
Bài (yến nhỏ hơn 6- 7g)
Địa (nằm dưới cùng của vách núi, đen, bẩn)
Vụn (tổ yến bị vỡ do khai thác hoặc vận chuyển).
1.2.4. Thành phần hóa học của yến sào
Thành phần hóa học của yến sào (Marcone và cs., 2005) bao gồm
- Lipid: 0,14 – 1,28%
- Tro: 2,1%. Hàm lượng khoáng chiếm lượng nhiều nhất là canxi từ 503,5 – 2071,3
mg/g và natri chiếm từ 39,8 – 509,6% (Norhayati và cs.,2010)
- Carbohydrate: 25,62 – 27,26%
- Protein: 62,0 – 63,0%.
- Một trong thành phần chính của glyconutrients trong yến sào là acid sialic: 9%
(Colombo và cs., 2003)
1.2.5. Cấu trúc và tính chất của các glucan trong Yến sào
Bên cạnh các thành phần trên, yến sào còn có một số hợp chất thiết yếu cho cơ
thể như 9% N-acetylneuraminic acid (NeuAc) hay là acid sialic (Colombo và cs., 2003),
7,2% N-acetylgalactosamine (galNAc), 5,3% N-acetylglucosamine (glcNAc), 16,9%
galactose và 0,7% fucose (Dhawan và cs., 2002).


Thành phần chính của khớp sụn.

-

Bổ sung glucoamin có thể giúp ngăn ngừa sự thoái hóa sụn và làm một số
triệu chứng liên quan chứng viêm khớp.
8


1.2.5.3. Cấu trúc và tính chất của N-acetylneuraminic acid

hay acid sialic

(Neu5Ac)
 Cấu trúc

Hình 1.7. Cấu trúc của Neu5Ac
(Nguồn: />
 Chức năng (Isafumi, 2002)
- Acid sialic là dẫn xuất của acid neuraminic, một monosaccharide với chuỗi
gồm 9 cacbon và là một phân tử quan trọng trong hệ thống nhận dạng sinh học.
- Có ích cho hệ thần kinh và có lợi cho não của trẻ em (Chau và cs., 2003).
- Là chất điều tiết tốt cho hệ thống miễn dịch , axit sialic tăng sức đề kháng của
chất nhầy, làm giảm mật độ lipoprotein, ngăn chặn virus cúm chủng A và B (Chao-Tan,
2006), gia tăng khả năng phát triển tế bào và ức chế sự đông máu (Biddle và cs., 1962).


Bên cạnh đó cả ba hợp chất trên đều ảnh hưởng tới khả năng phát triển


hình nữa cái cốc, dạng mảnh vụn và dạng ép thành bánh.
1.2.7. Công dụng của yến sào
Yến sào là tổ dạng khô của chim yến Collocalia được làm từ nước bọt của nó.
Hiện nay người ta tìm thấy chất chiết xuất từ tổ yến có thể trung hòa sự nhiễm trùng của
virus cúm trong các tế bào MDCK và ức chế sự ngưng kết hồng cầu của hồng cầu người
bởi virus cúm A có nguồn gốc từ các vật chủ khác nhau như người, các loài chim và lợn
(Chao -Tan và cs., 2006). Yến sào kích thích hocmon cho quá trình phân bào nguyên
nhiễm và yếu tố tăng trưởng cho sự tăng trưởng biểu bì dẫn tới sự phục hồi của các tế
bào và kích thích hệ thống miễn dịch (Kong và cs., 1987; Ng và cs., 1986).
Có khoảng 200 hợp chất đường tự nhiên nhưng trong đó có 8 hợp chất là thiết
yếu cho cơ thể. Các hợp chất này được biết như là glyconutrient và cần thiết cho các
chức năng của cơ thể. Bao gồm xylose, fucose, galactose, glucose, mannose, N10


acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylneuraminic acid (sialic acid). Bảy
trong tám chất dinh dưỡng này được tìm thấy trong yến sào. Trong đó acid sialic chiếm
9% (Colombo và cs., 2003), nó có ích cho hệ thần kinh và có lợi cho não của trẻ em
(Chau và cs., 2003), là chất điều tiết cho hệ thống miễn dịch tuyệt vời, acid sialic tăng
sức đề kháng của chất nhầy, làm giảm mật độ lipoprotein, ngăn chặn virus cúm chủng
A và B, gia tăng khả năng phát triển tế bào và ức chế sự đông máu (Biddle và cs., 1962).
Các thành phần khác của gluconutrient bao gồm 7,2% N-acetylgalactosamine (galNAc),
5,3% N-acetylglucosamine (glcNAc), 16,9% galactose và 0,7% fucose (Dhawan và
Kuhad, 2002). GalNAc liên quan tới chức năng của synapse, cầu nối giữa các tế bào
thần kinh và sự thiếu hụt có thể ảnh hưởng tới trí nhớ (Argueso và cs., 2003). GlcNAc
là một axit amin và thành phần chính của khớp sụn. Glucoamin bổ sung có thể giúp ngăn
ngừa sự thoái hóa sụn và làm một số triệu chứng liên quan chứng viêm khớp (Pasztoi
và cs., 2009). Galactose và fucose là glyconutrient ảnh hưởng tới phát triển não, truyền
thông tin tế bào và có khả năng kháng khuẩn. Bên cạnh đó, axit sialic, galNac, glcNac
còn ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào. Với hàm lượng axit sialic 2%, sự phát triển
sinh sôi của tế bào tăng 50%, với hàm lượng 10%, tế bào tăng hơn 100%, tương tự lượng

ngoài, nghĩa là đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống.
Enzym có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn. Nó có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn, hàng
triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác. Ví dụ: Dùng saccarasa làm chất xúc tác
cho phản ứng thủy phân saccaroza thì tốc độ phản ứng tăng nhanh gấp 2*1012 lần so với
khi dùng axid làm xúc tác. Enzym có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện
nhẹ nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thế, pH môi trường gần pH sinh lý.
Enzym có tính đặc hiệu cơ chất cao, đó là khả năng lựa chọn cao đối với kiểu phản ứng
mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng
 Đặc hiệu cơ chất tuyệt đối: enzyme chỉ xúc tác cho một kiểu liên kết nhất định
và đòi hỏi rất khắt khe các nhóm nguyên tử xung quanh liên kết mà enzyme tác dụng.
 Đặc hiệu cơ chất tương đối: enzyme chọn một kiểu liên kết để xúc tác nhưng
đòi hỏi không quá khắt khe với nhóm nguyên tử xung quanh liên kết mà nó tác dụng.
Do những đặc điểm trên, việc nghiên cứu và ứng dụng của enzym có ý nghĩa rất to lớn
về mặt lý thuyết cũng như về mặt thực tế áp dụng.
1.3.2. Tính ưu việt của enzym so với các chất xúc tác vô cơ khác (Nguyễn Đức
Lượng, 2008)
Enzym hoạt động trong điều kiện nhiệt độ bình thường, không quá cao hay quá
thấp, pH môi trường không quá khắt khe. Cho nên trong các quá trình công nghệ không
phải sử dụng các thiết bị chịu lực, không cần các thiết bị chịu acid hay kiềm. Vì tính đặc
hiệu của enzym cao nên lượng enzym dùng so với cơ chất rất thấp, và enzym có bản
chất protein nên sản phẩm tạo ra có độ tinh khiết cao. Người ta có thể tổng hợp enzym
12