Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

Lời cảm ơn
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy h ớng dẫn PGS.TS Cao Văn Thu, ngời đã hớng tận tình và giúp đỡ tôi hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này. Đồng cảm ơn các thầy cô giảng dạy tại Khoa
Công nghệ Sinh học - Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt
quá trình học tập.
Xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những ngời đã giúp đỡ và động viên
tôi trong thời gian qua. Với khát vọng thì nhiều nhng thời gian và kiến thức của
bản thân có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong sự chỉ
bảo của thầy cô và sự góp ý của các bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2006
Sinh viên
Phạm Thị Ngọc

Chú giải chữ viết tắt
ADN
: axit Deoxyribonucleic
B.cereus
: Bacillus cereus ATCC 9946
B.pumilus : Bacillus pumilus ATCC 10441
B.subtilis : Bacillus subtilis ATCC 6633
D
: Đờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Dmhc
: Dung môi hữu cơ
E.Coli
: Escheriachia Coli ATCC 25922
P.aeruginosa: Pseudomonas Nhiễm sắc thể aeruginosa VM 201

VK
: Vi khuẩn

Đặt vấn đề
Hiện nay cùng với sự phát triển của công nghệ thông tin thì công nghệ
sinh học cũng đợc coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế
giới. Trong đó phải kể đến công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh,
vitamin và các hoạt chất ứng dụng trong y học cũng nh các lĩnh vực khác phục
vụ đời sống con ngời đang có những phát triển vợt bậc.
Từ những phơng pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi
sinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình. Trong số
hơn 10.000 chất kháng sinh đợc tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo
ra còn khoảng 8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ
khuẩn tổng hợp hơn 60%. Các công trình nghiên cứu đã chứng minh
Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm kháng khuẩn. Đặc biệt một số loài
trong chi này có khả năng tổng hợp các chất chống ung th và điều trị HIVAIDS.

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

Tuy nhiên có một vấn đề gây lo âu lớn đối với các nhà nghiên cứu, đó là
sự xuất hiện của các vi sinh vật kháng kháng sinh và các chất hóa trị liệu khác.
Do đó các nhà khoa học và các chuyên gia y tế đã không ngừng tìm kiếm những


Lp 02-02


Khoá luận tốt nghiệp

Phạm Thị Ngọc

Kháng sinh là những hợp chất hoá học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng
ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chän lọc một nhóm vi sinh vật xác
định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus) hay cả tế bào ung thư ở nồng
độ thấp.
1.1.3.Cơ chế tác dụng của kháng sinh.
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí
chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng
trao đổi chất. Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên
trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Có 6 mức
tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: Tác dụng lên thành tế
bào, tác dụng lên màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp
ADN, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đổi chất hô
hấp và cuối cùng là tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian.
1.1.4.Phân loại kháng sinh
Ph©n lo¹i kh¸ng sinh cã thÓ theo nhiÒu c¸ch, nhng theo cÊu tróc hãa häc
lµ khoa häc nhÊt.B¶ng 1 giíi thiÖu mét sè nhãm kh¸ng sinh quan träng.

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Lớp 02-02


Các tetracyclin
Dẫn xuất aminoacid
Kháng sinh betalactam
Kháng sinh peptid
Chromopeptid
Depsipeptid

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Kháng sinh cụ thể
Streptomycin,
neomycin
Everninomycin
Streptothricin
Vancomycin
Moenomycin
Erythromycin
Candicidin, nistatin
Rifamicin
Tetranactin
Adriamycin
Actinorhodin
Mitomycin
Tetracyclin,
teramycin
Cycloserin
Penicilin,
Cephalosporin
Bacitraxin,
polymycin

kháng sinh. Tính kháng kháng sinh được di truyền cho các thế hệ tiếp theo. Bản
chất di truyền tính kháng thuốc được khẳng định nhờ tác nhân gây đột biến vµ
plasmid. Các quá trình này lan truyÒn tÝnh kh¸ng thuèc ngoµi nhiÔm s¾c thÓ xảy
ra ở mức độ phân tử, tải nạp nhờ bacteriophage và biến nạp vào vi khuẩn vµ
tiÕp hîp.
1.1.6 Sơ đồ mô tả quy trình sản xuất kháng sinh

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Lớp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

G iố n g tru y ề n ủ tro n g p h ò n g th í n g h iệ m
B ìn h n h â n g iố n g C 1 , C 2 ,C 3
B ìn h lê n m e n tạ o k h á n g s in h
D ịc h s a u lê n m e n
Lọc
S in h k h ố i

D ịc h lọ c

S in h k h ố i k h ô

D ịc h c h iế t K S
đậm đặc
T in h c h ế

các chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minh ra và nhanh chóng được
sử dụng để diều trị bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo.
Bảng 2 :Một vài kháng sinh quan trọng có giá trị kinh tế cao
Tên kháng sinh

Vi sinh vật sản xuất kháng sinh

Hoạt phổ

Penicilin G

Penicillium chrysogenum

Kháng khuẩn

Streptomycin

S. griseus

Kháng lao

Tetracyclin

S. aureofaciens

Kháng khuẩn

Chloramfenicol

S. venezuela


Kháng ung thư

Mitomycin C

Streptomyces sp

Kháng ung thư

Kanamycin

S. kanamyceticus

Kháng khuẩn

Nistatin

S. noursei

Kháng nấm

Fumagillin

Aspergillus fumigatus

Kháng protozoa

Griseofulvin

Penicillium griseofulvum


Kháng khuẩn

Kháng sinh còn được sử dụng trong thú y để điều trị các bệnh nhiễm
trùng của động vật như viêm phổi ở trâu bò, tụ huyết trùng ở lợn, v.v…Trong
chăn nuôi kháng sinh được sử dụng làm chất bổ sung vào thức ăn nhằm kích

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Lớp 02-02


Khoá luận tốt nghiệp

Phạm Thị Ngọc

thích tăng trọng. Rất nhiều chẩt kháng sinh được ứng dụng víi mục đích này
(các kháng sinh nhóm tetracyclin, monenzin,…).
Kháng sinh còn được ứng dụng trong nông nghiệp trước hết để tiêu diệt
các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụi ở
lúa (validamyin, blasticidin S, kasugamyxin, v.v…), bệnh thối cổ rễ ở các cây
có củ,v.v…Kháng sinh còn kích thích nẩy mầm của hạt. Thường ngâm hạt
trong dung dịch kháng sinh trước khi gieo vừa để kích thích nẩy mầm, vừa tiêu
diệt mầm bệnh trong đất.
Kháng sinh còn được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảo quản
thực phẩm đóng hộp.Nếu dùng kháng sinh thực phẩm đóng hộp sẽ bảo quản
được lâu hơn, khử trùng ở nhiệt độ thấp hơn nên chất lượng thực phẩm giữ
được tốt hơn(vÝ dô nizin).
1.2.ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN [1][9][11][14][15]
1.2.1 Đặc điểm của xạ khuẩn

Actinomycetales

Actinoplanaceae

Actinomycetaceae

Nocardia

Streptomycetaceae

Streptomyces

Micromonospora

H×nh 2: S¬ bé ph©n lo¹i x¹ khuÈn
1.2.2.Đặc điểm hình thái và sinh lí của xạ khuẩn chi Streptomyces

* Đặc điểm hình thái:
- Khuẩn lạc tạo thành từng cụm, bề mặt khô ráp, xù xì, dạng phấn ,
không trong suốt, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ.
- Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi
cấy.
- Khẩn ty cơ chất tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố hoà tan
trong nước, có sắc tố chỉ hoà tan trong dung môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty cơ chất mọc trong môi trường nuôi cấy, không phân cách
trong suốt quá trình phát triển

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Lớp 02-02

Chi Streptomyces bao gồm một số lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng
sinh tổng hợp ra các kháng sinh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác
nhau .Việc phân loại và xác định tên xạ khuẩn là rất quan trọng. Có rất nhiều
khoá phân loại Streptomyces khác nhau: phân loại theo Krasillkow, Waksman,
Gauze, Shirling & Gottlieb, ngoài ra còn có thể phân loại theo kiểu gen. Hội
Khoa Công Nghệ Sinh Học

Lớp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

ngh "Vi sinh vt th gii ln X" (c t chc ti Mexico vo nm 1970) chn
khoỏ phõn loi ca E.B.Shirling & Gottlieb lm khoỏ phõn loi chớnh phõn
loi chi Streptomyces v t tờn quc t l International Streptomyces Project
(ISP)
Khoỏ phõn loi da vo cỏc c im:
- c im hỡnh thỏi hc ca x khun :
+ Mu sc ca khun ty c cht, khun ty khí sinh,
+ Hỡnh dng chui bo t,
+ B mt bo t.
- c im sinh lớ hc:
+ Kh nng to sc t ho tan,
+ Kh nng to sc t melanoid,
+ Kh nng s dng cỏc ngun ng ca x khun.
1.2.4 Kh nng sinh tổng hp khỏng sinh ca Streptomyces

Mt s khỏ ln khỏng sinh do các loi Streptomyces sinh tng hp, rất đa


A. Phơng pháp chọn lọc ngẫu nhiên:
Chọn lọc tự nhiên hay còn gọi là sàng lọc ngẫu nhiên là tuyển chọn lấy
những dạng chủng có những đặc tính sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất, xuất
hiện ngẫu nhiên do sự tác động của các điều kiện ngoại cảnh.
B.Đột biến nhân tạo
Đột biến nhân tạo là quá trình xử lý tế bào bằng các tác nhân gây đột
biến (lý, hóa, sinh học). Các tác nhân này khi sử dụng với liều lợng thích hợp
sẽ giết chết hầu hết các VSV, những cá thể sống xót sẽ có sự biến đổi ở NST,
gây ra đột biến gen liên quan đến cấu trúc gen làm thay đổi 1 hay nhiều
nucleotit trong trình tự mã hóa gọi là đột biến điểm. Đây là loại đột biến có ý
nghĩa trong công nghiệp kháng sinh, làm thay đổi tính trạng cũng có thể dẫn
đến làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính), hay tăng cờng.
*ánh sáng UV khả năng đâm xuyên kém nhng với những tế bào VSV có kích
thớc nhỏ (0,3-3 m) thì nó có thể xuyên thấu tới nhân. Vì vậy đợc dùng phố
biến trong đột biến cải tạo giống.
*Cơ chế: Tia UV tác dụng lên ADN và mạnh nhất ở vùng 260nm gây
dime hóa thymin (do làm đứt các liên kết hyđro trong mạch kép ADN của tế
bào VSV). Mà thymin gần nhau liên kết cộng hóa trị với nhau ở C 5 và C6. Hậu
quả là sao chép bị sai lầm vì ADN polymeraza dễ lắp 1 nucleotit không chính
xác vào vị trí trên. Đồng thời trên sợi AND cũng xuất hiện một dimepyrimidin
khác gọi là quang sản phẩm 6-4. ở đây C6 của 5 (thymin hoặc cytozin) đợc liên
kết với C4 của 3 (thờng là Cytozin). Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu
của đột biến gây nên bởi ánh sáng UV.
*Các yếu tố ảnh hởng đến hiệu quả gây chết vầ tần số phát sinh đột biến:

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

1.4. Dinh dỡng và môi trờng nuôi cấy [5]
Trong quá trình sống, tế bào VSV luôn luôn phải trao đổi chất với môi trờng xung quanh. Tế bào VSV tuy rất nhỏ nhng vì hấp thu các chất dinh dỡng và
thải các sản phẩm chất qua toàn bộ bề mặt, cho nên cờng độ trao đổi chất của
chúng là rất lớn. Các chất dinh dỡng qua màng vào tế bào và đợc chuyển hóa
thành những chất riêng biệt cho việc xây dựng tế bào. Nhờ quá trình đồng hóa
và dị hóa các tế bào mới có thể phát triển, sinh trởng, đồng thời tạo ra các sản
phẩm trao đổi chất.
Những VSV dùng trong công nghiệp vi sinh kháng sinh đều là các VSV
dị dỡng. Để phát triển VSV cần một lợng đầy đủ các nguyên tố C, H, O, N, P
và một trong những nguyên tố vi lợng là Mn, Mo, Zn,
Cu Môi trờng dinh
dỡng phải chứa tất cả các nguyên tố cần thiết cho sinh trởng và tạo thành sản
phẩm của VSV. Thông thờng các môi trờng nuôi cấy sử dụng nớc máy thì
không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lợng vì các chất này đã có đủ trong
các cơ chất dinh dỡng ở dạng tạp chất. Trong quá trình lên men ngời ta có thể
thêm một số nguyên tố vi lợng đặc biệt hoặc tiền chất là chất đặc hiệu cho sản
phẩm tạo thành nh tiền chất axít phenoxyacetic trong quá trình lên men sản
xuất penicillin V. ở đây cũng cần lu ý, một môi trờng nuôi cấy thuận lợi cho sự
phát triển của một VSV không nhất thiết sẽ là môi trờng đảm bảo cho sản xuất
sản phẩm trao đổi chất tốt nhất. Môi trờng lên men tốt nhất phải là môi trờng
đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn và chi phí
thấp với chủng VSV cho trớc.
Thành phần môi trờng và chế độ tối u hóa đợc xác định theo hai cách: tối
u hóa kinh điển và sử dụng phơng pháp toán học quy hoạch thực nghiệm.

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

quá sâu (5-10cm), đồng thời phải giữ độ ẩm môi trờng khoảng 60% (có trờng
hợp 90- 100%) để tránh khô bề mặt môi trờng.
Lên men bề mặt có u điểm đơn giản, dễ thực hiện, đầu t ban đầu thấp.
Nhng có nhợc điểm là đòi hỏi mặt bằng lớn, hiệu xuất sử dụng thờng thấp, khó
cơ giới hóa và tự động hóa. Chính vì lý do đó mà ngày nay, công nghiệp kháng
sinh không áp dụng lên men bề mặt trong sản xuất mà chỉ áp dụng trong các
phòng thí nghiệm để chọn giống.

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

* Phơng pháp lên men chìm:
Phơng pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong
không gian 3 chiều của môi trờng lỏng
Trớc khi lên men phải có giai đoạn tạo giống
- Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml),
- Giống cấp 2: Nuôi cấy trong bình giống 80l,
- Giống cấp 3: Nuôi cấy trong bình 1-5m3.
Tỷ lệ giống trong môi trờng là 1-10%. Tỷ lệ giống phụ thuộc vào quy mô
của bình lên men.
Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của môi trờng: thay đổi pH, nồng độ các thành phần trong môi trờng, các sản phẩm trao
đổi chất, tạo bọt trên bề mặt môi trờng. Để đảm bảo những điều kiện tối u cho
sự phát triển của VSV trong quá trình lên men ngời ta đã đa ra một số biện pháp
nh: cho thêm các chất phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật, chất điều chỉnh pH hay

Pha log

Pha suy tàn

Pha
tiềm
tàng
t(h)
Hình 3: Đờng cong biểu diễn các giai đoạn phát triển của VSV trong MT
lỏng.Với:
x: sinh khối khô VSV trong dịch lên men
t: thời gian lên men.
Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh
tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kì sinh trởng của VSV hoặc khi
việc sinh tổng hợp hoạt chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang
lại hiệu quả kinh tế.
- Lên men có bổ sung:
Lên men có bổ sung là biến tớng phát triển của lên men mẻ đống kín.
Trong khi lên men, do nồng độ cao của một số chất (glucoza, các hợp chất
nitơ) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Bởi vậy khi bắt đầu lên
men các thành phần đó đợc đa vào với một nồng độ thấp và đợc bổ sung vào hệ
thống trong quá trình lên men.
- Lên men liên tục: quá trình lên men môi trờng dinh dỡng đợc bổ sung
liên tục vào bình lên men, đồng thời lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên men.
Quá trình này xem nh một hệ mở.
- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men việc bổ sung thêm môi
trờng dinh dỡng và rút bớt dịch lên men không xảy ra liên tục mà định
kỳ sau những khoảng thời gian xác định.
1.6. Tách chiết và tinh chế [4][7]


- Chiết đơn (chiết 1 lần): Thờng cho hiệu suất thấp nhng đơn giản, tốn ít
thời gian.
- Chiết lặp (chiết nhiều lần): Hiệu suất chiết cao tuy nhiên tốn thời gian
và công sức.
- Chiết ngợc dòng cho kết quả tốt hơn.
1.6.2. Tách sản phẩm

* Định nghĩa: Là một nhóm các phơng pháp hóa học, vật lý và hóa lý
nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp
đơn giản tách riêng từng chất.
* Các phơng pháp tách hỗn hợp đồng nhất hay đợc dùng:
- Phơng pháp chia cắt pha: Là phơng pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất (một
pha) tách thành hỗn hợp không đồng nhất (hai pha).
- Phơng pháp chuyển pha: Trong nhóm này có các phơng pháp nh là:
chiết, thẩm thấu, các phơng pháp sắc ký.
* Sắc ký:
Là một nhóm các phơng pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của
hỗn hợp. Sự tách sắc kí đợc dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác
nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một
pha động.
Các phơng pháp sắc ký:
Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc


Boromycin là kháng sinh thuộc nhóm polyête-macrolit đợc STH từ
Streptomyces sp. A-3376, là kháng sinh chống HIV. Boromycin có khả năng
ngăn chặn sự phát triển HIV ở giai đoạn cuối và có thể ngăn cản quá trình sao
chép của phân tử HIV trong tiến trình trởng thành.
Trong lên men Streptomyces sp. A-3376 tạo ra một chất ký hiệu là TMC25, sau khi nghiên cứu đã chứng minh đợc TMC-25 có cấu trúc giống hệt của
Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

boromycin, kháng sinh có chứa một nguyên tử Bo. Lên men STH TMC-25 đợc
tiến hành trên máy lắc ở 270C trong 5 ngày.
Dịch lên men thu đợc lọc loại bỏ sinh khối sau đó chiết bằng n-butanol,
dịch chiết đợc tinh chế bởi phân đoạn dung môi cho ta kháng sinh ở dạng tủa
thô, tiếp tục tinh chế nhờ sắc ký cột đảo pha trên silicagel ODS và Sephadex
LH-20. Sau đó sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để thu đợc TMC-25 dới dạng
bột vô định hình màu trắng. Cứ 24,5 lít dịch lên men đã loại bỏ sinh khối sau
quá trình chiết xuất và tinh chế sẽ thu đợc 24,5mg TMC-25.
1.7.2. Tinh chế và đặc trng của serine proteinaza thuỷ phân Keratin từ
Streptomyces albidoflavus.
Streptomyces albidoflavus là một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp enzym serine proteinaza có tác dụng thuỷ phân keratin.
Streptomyces albidoflavus khi nuôi cấy ở môi trờng chứa thịt- da có thể
sinh ít nhất 6 loại proteinaza ngoại bào. Dịch lên men chủng Streptomyces
albidoflavus đợc ly tâm, lọc sơ bộ để loại bỏ sinh khối, sau đó đợc lọc qua
màng lọc có kích thớc 0,45àm( Milipore Corp., Bedford, Mass), rồi đợc cô đặc

Tinh chế hai thành phần trên bằng phơng pháp sắc ký cột HP20, dịch rửa
giải là MeOH.
Gendanamycin và 4,5-Epoxy-8-demethylgeldanamycin là những kháng
sinh có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tật hiện nay đợc sinh tổng
hợp từ Streptomyces sp.
1.7.4. Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ
Streptomyces sp.
Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase gồm
tetrapetalone B (2, C28H35NO9), C (3, C26H34NO8), D(4, C28H36NO10) từ
Streptomyces sp. USF 4227, một chủng đồng thời cũng sinh tổng hợp
tetrapetalone A. HLO (Human Lipoxygenase) và COX (cyclooxygenase) là
những enzym xúc tác đầu tiên tơng ứng tạo acid arachidonic, là sản phẩm sinh
ra một loạt các chất gây bệnh cho ngời nh leukotrien, lipoxin, prostaglandin.
Nghiên cứu đợc tiến hành trên Lipoxygenase của đậu nành (SBL: Soybean
Lipoxygenase)
Streptomyces sp. USF 4727 đợc nuôi cấy trong môi trờng thích hợp,
dịch lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 300C đợc tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửa
giải bằng MeOH và Aceton đợc gộp lại và làm bốc hơi dới áp suất giảm, sau đó
tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, dung môi rửa giả là n-hexan (1), n-hexan:
ethylacetate =3:7 (2), n-hexan: acetone = 3:7 (3), và acetone (4).
Tetrapetalone B đợc tìm thấy ở phân đoạn dung môi (1) và (2) , sau đó
sắc khí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH 20, dung môi rửa giả là MeOH,
tinh chế phân đoạn dung môi (1) thu đợc 10mg bột từ 7,2l môi trờng
Tetrapetalone A có IC50 là 190 ( M)

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02




Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

2.1.2.Các môi trờng nuôi cấy
*Môi trờng phân lập:
Chủng xạ khuẩn 40.16 đợc phân lập trên môi trờng 1 (MT1): Tinh bột
khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch
1,8g; Nớc vừa đủ 100ml.
*Môi trờng nuôi cấy và khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh:
+Môi trờng 1 (MT1): Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4
0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch 1,8g; Nớc vừa đủ 100ml; pH=6,8-7,2.
+Môi trờng 2 (MT2): Tinh bột 2g; KCl 0,05g; NaNO 3 0,2g; K2HPO4
0,1g; MgSO4,7H2O 0,01g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nớc vừa đủ 100ml.
+Môi trờng3 (MT3): Lactoza 3g; CaCO3 0,4g; K2HPO4 0,5g; NH4NO3
0,2g; MgSO4,7H2O 0,01g; Na2SO4 0,05g; Cao ngô 0,5g; Thạch 1,8g; pH=7,07,2; Nớc vừa đủ 100ml.
+Môi trờng 4 (MT4): Glucoza 2g; Cao ngô 0,5g; NH4NO3 0,2g; CaCO3
0,4g; K2HPO4 0,5g; MgSO4,7H2O 0,15g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nớc vừa đủ
100ml.
+Môi trờng 5 (MT5): Bột đậu tơng 1g; Cao thịt 2g; CaCO3 0,2g;
(NH4)2SO4 0,2g; NaCl 0,1g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nớc vừa đủ 100ml.
+Môi trờng 6 (MT6): Bột ngô 2g; CaCO3 0,2g; NaCl 0,1g; CoCl2,H2O
0,002g; K2HPO4 0,05g; Bột đậu tơng 1,5g; Cao nấm men 0,5g; Thạch 1,8g;
pH=7,0-7,2; Nớc vừa đủ 100ml.

(%)

Canh thang

0,5

0,3

0,5

-

-

Thạch thờng

0,5

0,3

0,5

-

1,8

Sabouraud lỏng

1


1,0ml; thạch 20,0g; nớc cất 1000ml; pH=7,0-7,4.

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02