Header Page 1 of 148.

i

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng
dẫn của PGS. TS

và PGS. TS

. Các số liệu trình

bày trong luận án là trung thực.
Một số kết quả đã đƣợc công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chƣa
đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này!
0

Hoàng Phú Hiệp

Footer Page 1 of 148.

03 năm 2014


Header Page 2 of 148.

ii

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS


Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2

3.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
1.1.

VI KHUẨN E. COLI O157:H7 ........................................................................ 3

1.1.1. Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 .................................... 3
1.1.2. Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất và tác hại .................................................... 7
1.1.3. Nguyên nhân và diễn biến khi ngộ độc .......................................................... 11
1.1.4. Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ở Việt Nam ................................. 13
1.2.

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN

E. COLI O157:H7 ..................................................................................................... 14
1.2.1. Phƣơng pháp PCR dựa trên DNA .................................................................. 14
1.2.2. Kỹ thuật LAMP .............................................................................................. 18
1.2.3. Sử dụng kháng thể tái tổ hợp trong phát hiện E. coli O157:H7 ..................... 19
1.3.

KHÁNG THỂ ................................................................................................. 23

1.3.1. Mảnh kháng thể .............................................................................................. 25
1.3.2. Kháng thể tái tổ hợp ....................................................................................... 26

2.3.2. Kỹ thuật bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display) ..................................... 43
ứu protein ................................................................... 45

2.3.3.

2.3.4. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ......................................................... 51
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................................... 52
: .................................................................................. 52
3.1. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E. COLI O157:H7 BẰNG KỸ THUẬT GEN ......... 52
3.1.1. Xác định chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng kỹ thuật phân tích
gen mã hóa 16S rRNA .............................................................................................. 52
3.1.2. Sử dụng đoạn gen Stx1 và Stx2 để xác định E. coli O157:H7 ....................... 58
3.1.3. Sử dụng kỹ thuật LAMP xác định vi khuẩn E. coli O157:H7 ....................... 63
3.2.

NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỐI VỚI

VI KHUẨN E. COLI O157:H7 VÀ TÁCH DÒNG XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ
GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ ................................................................................. 69
3.2.1. Sàng lọc kháng thể từ thƣ viện Griffin.1 ........................................................ 70
3.2.2. Chọn dòng phage kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157: H7 ........... 72
3.2.3. Nhân bản gen mã hóa kháng thể bằng PCR ................................................... 74
3.2.4. Giải trình tự gen mã hoá kháng thể ................................................................ 75
3.3. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ......... 79
3.3.1.

.................................................... 79

3.3.2. Thiết kế vector pET28a-TRX biểu hiện gen mã hóa kháng thể..................... 80


................................................................................... 93

....................................................................................................... 94
......................................................................................... 95
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 108

Footer Page 5 of 148.


iv

Header Page 6 of 148.

vi

THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
STT
1
2

Ký hiệu
Amp
bp

3

CDC

4
5

36
37
38

CDR
Cfu
ddNTP
DNA
dNTP
E. coli
EDTA
EHEC
ELISA
EtBr
FDA
HRP
HC
HUS
IPTG
Kana
Kb
kDa
LAMP
LB
mAb
OD
PBS
PCR
PEG
rRNA

Hemolytic Uremic Syndrome- Hội chứng dung huyết và suy thận
Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside
Kanamycin
Kilo base pair
Kilo Dalton
Loop-mediated Isothermal Amplification
Lauria Bertani
Monoclonal antibody- kháng thể đơn dòng
Optical Density
Phosphate buffer saline
Polymerase Chain Reaction
Polyethylene Glycol
Ribosomal RNA
Sodium Dodecyl Sulphate
SDS- Polyacrylamide gel electrophoresis
Shiga-like toxin producing Escherichia coli
Tris - Acetate – EDTA
Tris – EDTA
N, N, N’, N’- Tetramethyl ethylenediamine
Vòng/phút
Variable heavy - Vùng biến đổi chuỗi nặng
Variable light - Vùng biến đổi chuỗi nhẹ


Header Page 7 of 148.

Số hiệu
bảng
1.1



40

2.4

Thành phần phản ứng nối ghép

40

2.5

Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng LAMP

42

2.6

Thành phần gel polyacrylamide

46

3.1

3.2

3.3

3.4

Footer Page 7 of 148.


03

1.2

Hình ảnh vi khuẩn E. coli O157:H7 trên môi trƣờng có MUG

04

1.3

Bản đồ

05

1.4

Cấu trúc độc tố Shiga-like toxin

07

1.5

Nguyên lý gây chết tế bào của Shiga-like toxin

08

1.6

Nguyên lý gây bệnh của E. coli O157:H7


3.4

Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách chiết DNA plasmid

54

3.5

Hình ảnh điện di kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI

55

Tên hình

Trang

(genome) của vi khuẩn E. coli O157:H7

ẩn E. coli O157:H7

53

Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa E. coli O157:H7 với chủng
khác đƣợc xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự gen 16S RNA của chủng
3.6

E. coli O157:H7 nghiên cứu (mã số HQ658163) và các chủng khác trên

57

64

3.12

Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng LAMP

65

3.13

Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP xác định hàm lƣợng DNA

66

3.14

Sản phẩm LAMP khi nhuộm

68

SYBR Green I

Khả năng gắn kết của hỗn hợp phage thu đƣợc sau mỗi vòng sàng lọc
3.15

với dòng tế bào E. coli O157:H7

71

Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật ELISA dùng trong xác định ái lực của phage

3.20

Cấu trúc 3D kháng thể tái tổ hợp

77

3.21

Hình ảnh điện di sản phẩ

80

3.22

Thiết kế vector pET28a-TRX biểu hiện gen mã hóa kháng thể

81

-PAGE

3.23

82

3.24

kháng thể tái tổ hợp

83



3.29
3.30

Footer Page 9 of 148.

89

thể chuẩn mã số AB75244 (Hãng Abcam).
Hình ảnh phức

kháng thể- silica bắt

tế bào E. coli O157:H7

91


Header Page 10 of 148.

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi chúng ta sử dụng thức ăn, nƣớc uống không
đƣợc bảo quản đúng cách dẫn đến sản phẩm bị hƣ thối do nhiễm khuẩn hoặc hóa
chất độc hại... Các nghiên cứu gần đây đã xác định một trong những nguyên nhân
của nhiều trƣờng hợp ngộ độc thức ăn là do vi khuẩn E. coli.
E. coli thuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong
tự nhiên, trong ruột của ngƣời và gia súc. Trong đƣờng ruột, chúng hiện diện chủ

vào năm 2005 [63], tiếp đó đã có những nghiên cứu về E. coli O157:H7 [7], [9], [92].
Trong các vụ dịch gây tiêu chảy ở nƣớc ta hiện chƣa tìm thấy sự hiện diện của chủng
E. coli O157:H7, tuy nhiên những vi khuẩn thuộc các nhóm khác gây ngộ độc và các
bệnh liên quan đã đƣợc phát hiện trong nhiều trƣờng hợp [35]. Trong sinh hoạt hàng
ngày, không ngoại trừ trƣờng hợp chúng ta bị nhiễm E. coli O157:H7 thông qua tiếp
xúc hay phơi nhiễm với phân ngƣời, động vật và gia cầm.
Việc xác định nhanh, chính xác sự có mặt của vi khuẩn E. coli O157:H7
trong các mẫu thực phẩm góp phần bảo vệ sức khỏe cho con ngƣời là cần thiết.
Việc sử dụng kháng thể kháng E.coli O157:H7, một trong những yếu tố quan trọng
để phát hiện E. coli O157:H7 vẫn còn chƣa đƣợc nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng
tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn
Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu các kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 và tạo
kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E. coli O157:H7.
3. Nội dung nghiên cứu
(i) Xác định chủng E. coli O157:H7 bằng các kỹ thuật di truyền: (1) Tách dòng
và xác định trình tự gen 16S rRNA; (2) Tách dòng và xác định trình tự gen
mã hóa cho các độc tố Stx1, Stx2 và (3) Kỹ thuật LAMP.
(ii) Tạo dòng gen mã hóa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn E. coli
O157:H7 bằng kỹ thuật phage display;
(iii) Thu nhận kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7;
(iv) Xác định độ nhạy, tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp.

Footer Page 11 of 148.


Header Page 12 of 148.

3


Enterobacteriales

Họ (familia):

Enterobacteriaceae

Chi (genus):

Escherichia

Loài (species):

E. coli

Chủng:

O157: H7

Hình 1.1. Hình ảnh vi khuẩn E. coli
O157:H7 trên kính hiển vi điện tử [104]

E. coli O157:H7 thuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, thuộc
loại trực khuẩn Gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, có
vỏ ngoài (capsule) và có lông bám (pili) (Hình 1.1). E. coli O157:H7 có cấu tạo đơn

Footer Page 12 of 148.


Header Page 13 of 148.

Header Page 14 of 148.

5

Fluorocult có bổ sung sorbitol và MUG do không có khả năng lên men đƣờng
sorbitol, khuẩn lạc có màu xanh nhạt phân biệt với các vi khuẩn E. coli khác khuẩn
lạc có màu vàng do lên men đƣợc đƣờng sorbitol. Đây là đặc điểm đƣợc sử dụng
trong xét nghiệm để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này [60].

Hình 1.3. Bản đồ hệ gen (genome) của vi khuẩn E. coli O157:H7 [105].

DNA của vi khuẩn E. coli O157:H7 gồm hệ gen vùng nhân có kích thƣớc
khoảng 5,5 triệu bp, gồm 5483 gen và 2 plasmid: plasmid lớn (pO157) có kích
thƣớc 9,3 kb và plasmid nhỏ (pOSAKI) kích thƣớc 3,3 kb, 7 chuỗi rRNA (16S, 23S,
5S); số chuỗi của tRNA và mRNA là 102 (Bảng 1.1). Tỷ lệ G+C là 50,5 %. Chủng
E. coli O157:H7 là loại vi khuẩn sinh độc tố, trong hệ gen vùng nhân chứa 2 gen mã
hóa cho độc tố đặc trƣng của vi khuẩn này là Stx1 và Stx2 [62], đƣợc sử dụng nhƣ là
những marker cho việc phân loại và phát hiện. Mặt khác các phƣơng pháp này cho
thấy các chủng là thể liên tục chứ không phải phân thành các chủng khác nhau.
Tên của vi khuẩn bắt nguồn từ 2 loại kháng nguyên quan trọng nhất của E.
coli là kháng nguyên O (Ohne- kháng nguyên soma) và kháng nguyên H (Hauchkháng nguyên lông) [33], ngoài ra còn có kháng nguyên K (capsular) và kháng
nguyên F (fimbriae). Kháng nguyên soma O đƣợc xác định bởi phần polysaccharide
của thành thế bào lipopolysaccharide, còn kháng nguyên H đƣợc xác định bởi

Footer Page 14 of 148.


Header Page 15 of 148.

6

5361

83

3

Vùng mã hóa protein (%)

88,1

82,5

52,8

Chiều dài trung bình của các ORF (bp)

904

922

579

7

0

0

103



7

nhƣ O91:H21 và O113:H21. Type gây bệnh D gồm một số type liên quan tới bệnh
tiêu chảy và type E gồm nhiều chủng STEC không gây bệnh ở ngƣời.
1.1.2. Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất và tác hại
Theo CDC (Centers for Disease Control and Prevention-Trung tâm Kiểm
soát và Phòng chống Dịch bệnh Mỹ), E. coli O157:H7 là một trong bốn chủng vi
khuẩn gây bệnh tiêu chảy sau các chủng Campylobacter sp., Salmonella sp.và
Shigella sp. Bốn chủng này nằm trong nhóm độc tố Shiga toxin đƣợc sản xuất bởi
E. coli (shiga toxin-producing E.coli, STEC). Nhân tố gây bệnh chính của STEC là
prophage mã hóa cho độc tố Shiga. Độc tố này gây bệnh tiêu chảy và cả hội chứng
HC và HUS [86]. STEC sinh ra hai loại độc tố gọi là Shiga toxin 1 và Shiga toxin 2.
Các yếu tố gây độc khác bao gồm một protein màng ngoài gọi là intimin (protein
quan trọng giúp vi khuẩn tồn tại trong ruột) và enterhemolysin mã hóa bởi một
plasmid đƣợc gọi là pO157. Enterohemolysin góp phần gây độc bằng cách phân hủy
tế bào hồng cầu giúp tạo ra nguồn cung cấp sắt cho vi khuẩn.

Shiga- like toxin

Tiểu phần B

Hình 1.4. Cấu trúc độc tố Shiga-like toxin [104].

Độc tố Shiga toxin đƣợc xác định lần đầu tiên bởi Kiyoshi Shiga vào năm
1898 do vi khuẩn Shigella dysenteriae tiết ra. Vài năm sau ngƣời ta nhận thấy mối
liên quan giữa độc tố này với các bệnh tiêu chảy, hội chứng HUS và một số bệnh
khác. Độc tố Shiga toxin có hai họ là Shiga toxin I và Shiga toxin II đƣợc mã hóa
bởi 2 gen tƣơng ứng là Stx1 và Stx2. Hai độc tố này có thể phát hiện trong E. coli
O157:H7 và các type huyết thanh STEC độc lập hoặc cùng với nhau [15]. Loại độc

Footer Page 17 of 148.


Header Page 18 of 148.

9

có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của độc tố bởi tất cả các tế bào dễ bị
nhiễm Shiga-like toxin thì đều có Gb3 trên bề mặt tế bào, trong khi đó những tế bào
không có Gb3 trên bề mặt thì có khả năng kháng lại độc tố (Hình 1.5).
Năm 1977, Konowalchuk và cộng sự đã báo cáo rằng chủng gây bệnh E. coli
O26:H11 thuộc nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli- E. coli gây bệnh đƣờng ruột)
sản xuất một chất độc tác động trên tế bào Vero và đặt tên là Vero toxin [46]. O'Brien
và cộng sự (1987) cho rằng, độc tố Vero toxin mà Konowalchuk nghiên cứu rất giống
với độc tố Shiga toxin đƣợc sản xuất bởi Shigella dysenteriae type 1, và nó có thể bị
vô hiệu hóa bằng anti-Shiga toxin, do đó một tên mới đƣợc đƣa ra là Shiga-like toxin
[69]. Độc tố Vero toxin do Konowalchuk và cộng sự mô tả giống với độc tố Shiga
toxin về đặc điểm di truyền và protein. Do vậy, các tên Shiga-like toxin, Shiga toxin
và Vero toxin đƣợc sử dụng thay thế cho nhau, kết quả là tên các chủng VTEC
(verotoxin producing E. coli), SLTEC (Shiga-like toxin producing E. coli) và STEC
đều đƣợc sử dụng. Các bệnh nhƣ HC, HUS thƣờng gây ra bởi nhóm STEC hoặc
EHEC (Enterohemorrhagic Escherichia coli). Tất cả các chủng EHEC đều đƣợc cho
là gây bệnh, tuy nhiên không phải tất cả các chủng STEC đều gây bệnh HC hoặc
HUS. Nhóm vi khuẩn E. coli O157:H7 thuộc nhóm EHEC. Nếu xét về độc tố của nó,
E. coli O157:H7 phải thuộc về nhóm VTEC, SLEC hoặc STEC. Điều này có thể
đƣợc khẳng định khi cơ chế gây bệnh của vi khuẩn đƣợc mô tả đầy đủ.
Shiga-like toxin I
Shiga-like toxin I là một nhân tố độc lực của E. coli O157:H7 gây bệnh ở
ngƣời. Giống nhƣ các độc tố khác của họ Shiga toxin, nó bao gồm một tiểu phần
(A) có chức năng enzyme và năm bản sao của một tiểu đơn vị liên kết (Bpentamer). Shiga-like toxin 1 đƣợc mã hóa bởi gen Stx1. Các gen Stx1 có cấu trúc

STEC tạo Stx2 (Stx2a, 2c và 2d) có liên quan chặt chẽ với hội chứng HUS hơn các
chủng vi khuẩn chỉ sinh ra Stx1 [29]. Shiga-like toxin II không giống hoàn toàn với
Shiga-like toxin I. Shiga-like toxin II có nhiều đặc tính sinh học giống với Shiga
toxin đặc biệt là trình tự nucleotide và protein, Shiga-like toxin II có cùng điểm
đẳng điện và độ bền nhiệt với Shiga toxin, cùng bị trung hòa bởi huyết thanh. Các
kỹ thuật giải trình tự nucleotide và so sánh amino acid cho thấy Shiga-like toxin I
và Shiga-like toxin II có tỷ lệ tƣơng đồng về gen là 99% và chỉ khác nhau một
amino acid trong tiểu phần “A”. Tuy nhiên Shiga-like toxin II lại có tính kháng
nguyên khác với Shiga-like toxin I bên cạnh đó Shiga-like toxin II không bị vô hiệu
bởi anti-Shiga-like toxin hoặc kháng thể kháng Shiga-like toxin I. Shiga-like toxin
II có nhiều trình tự và tính kháng nguyên đa dạng hơn Shiga-like toxin I [27], [33].
Shiga-like toxin 2 có liên quan với HUS. Stx1 và Stx2 có độc tính khác nhau
đối với từng loại tế bào. So với Shiga-like toxin 1, Shiga-like toxin 2 độc hơn gấp
1000 lần đối với tế bào nội mô mao mạch thận của ngƣời [11]. Siegler và cộng sự

Footer Page 19 of 148.


Header Page 20 of 148.

11

(2003) đã thử nghiệm và so sánh ảnh hƣởng của Shiga-like toxin 1 và Shiga-like
toxin 2 trên mô hình động vật linh trƣởng [85]. Siegler đã tiêm Shiga-like toxin 2
vào tĩnh mạch dẫn tới biểu hiện lâm sàng và bệnh đặc trƣng cho HUS, trong khi tiến
hành tƣơng tự đối với Shiga-like toxin 1 thì không thấy có sự phát triển bệnh. So
sánh cấu trúc tinh thể của Shiga-like toxin 2 và Shiga toxin cho thấy có 4 điểm cấu
trúc khác biệt lớn có thể giải thích cho sự liên quan giữa Shiga-like toxin 2 với
HUS. Sự khác biệt lớn nhất là do vị trí hoạt động của Shiga-like toxin 2, sự tăng
cƣờng khả năng gây độc có thể do tiểu đơn vị A của Shiga-like toxin 2 hình thành

ngƣng kết này chính là nguyên nhân gây ra HUS vì chúng làm nghẽn các mạch máu
nhỏ, khiến máu không đi hết đƣợc tới các tế bào làm giảm chức năng của các cơ
quan gây suy tạng đặc biệt là thận.

Hình 1.6. Nguyên lý gây bệnh của E. coli O157:H7.

Triệu chứng điển hình nhất khi bị nhiễm vi khuẩn E. coli O157:H7 là: tiêu
chảy, ói mửa, đau bụng quặn thắt, sốt nhẹ, mệt mỏi, đôi khi đi ngoài có máu. Tiếp
theo là một số vấn đề sức khỏe gồm các triệu chứng sau: (i) Viêm đại tràng xuất
huyết có triệu chứng là đau bụng, đi ngoài có thể đi ngoài ra máu. Viêm đại tràng
xuất huyết đƣợc coi là biểu thị đặc trƣng cho việc nhiễm E. coli O157:H7 hoặc là sự
phát triển của HUS. 38-61% trƣờng hợp nhiễm E. coli O157:H7 đều có triệu chứng
này. Thời kỳ ủ bệnh thƣờng từ 1-9 ngày trong các đợt dịch. Đối với trẻ em hiện
tƣợng tiêu chảy kéo dài lâu hơn (9,1 2 ngày) so với ngƣời trƣởng thành (6,6 1,1
ngày) và cuối cùng thƣờng là triệu chứng đi ngoài ra máu [16], [20]; (ii) Hội chứng
dung huyết suy thận (HUS) đƣợc đặc trƣng bởi các dấu hiệu nhƣ: thiếu máu do dung
huyết, tiểu cầu vón cục và suy thận, hội chứng này xuất hiện chủ yếu xuất hiện ở trẻ
dƣới 10 tuổi và ngƣời cao tuổi. Các triệu chứng đầu tiên của HUS là: ngƣời bệnh
xanh xao, thiếu máu, bí tiểu, phù và suy thận cấp, các triệu chứng này bắt đầu từ
khoảng một tuần sau khi nhiễm vi khuẩn. Một nửa bệnh nhân HUS phải lọc thận và tỉ
lệ tử vong của số bệnh nhân này là 3-5%. Một số biến chứng khác của HUS có thể
gồm tai biến, hôn mê, đột quỵ, tăng huyết áp, khoảng 15% trƣờng hợp bệnh nhân gặp
các biến chứng nhƣ trên sẽ bị suy thận mãn tính [16], [20]; (iii) Tử vong: các trƣờng

Footer Page 21 of 148.


Header Page 22 of 148.

13

thành viên Wondo Vina (trụ sở tại xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo tỉnh Tiền
Giang) làm 1200 công nhân phải nhập viện. Nguyên nhân đƣợc xác định là do thức
ăn nhiễm vi khuẩn Salmonella. Ngày 16/10/2013 gần 400 ngƣời bị ngộ độc khi sử
dụng bánh mỳ ở Quảng Trị, trong đó 382 ngƣời phải nhập viện. Nguyên nhân cũng
đƣợc xác định do vi khuẩn Salmonella gây ra. Tiếp theo ngày 17/10/2013, 113 công
nhân ở Bình Dƣơng ngộ độc do ăn thịt bò, trong đó có 47 công nhân có triệu chứng
điển hình ngộ độc thực phẩm. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm đƣợc xác định
là do thịt bò xào thập cẩm bị nhiễm vi khuẩn lostridium perfringens. Trƣa 16/11 tại

Footer Page 22 of 148.


Header Page 23 of 148.

14

gia đình bà Lê Thị Thêm (Đông Châu, Thạch Văn, Thạch Hà, Hà Tĩnh), có hơn 58
ngƣời dân đa phần ở xã Thạch Văn bị ngộ độc thực phẩm, trong đó 43 ngƣời phải
chuyển vào Trạm Y tế xã nằm lại để thăm khám, trong đó có đến 15 ngƣời ở thể
nặng phải chuyển tiếp lên Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hà Tĩnh cấp cứu, chăm sóc.
Ngay sau khi vụ ngộ độc xảy ra, Chi Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm tỉnh Hà Tĩnh
đã phối hợp với Trung tâm Y tế Dự phòng huyện Thạch Hà và Trạm Y tế xã Thạch
Văn tổ chức thực hiện điều tra để xác định nguyên nhân. Kết quả điều tra cho thấy
nguyên nhân ngộ độc là do nhiễm khuẩn.
Hàng năm trên cả nƣớc xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng,
tuy nhiên chƣa có vụ ngộ độc thực phẩm nào gây ra bởi E. coli O157:H7. Mặc dù
vậy, không thể loại trừ khả năng vi khuẩn này sẽ bùng phát thành dịch bệnh trên
diện rộng. Trong nhiều nghiên cứu [7], [9] các nhà nghiên cứu đã phát hiện đƣợc vi
khuẩn này nhiễm trong thịt lợn, thịt bò tại các cửa hàng tạp hóa. Do vậy, việc đƣa ra
các phƣơng pháp phát hiện,chẩn đoán nhanh và kháng thể đối với vi khuẩn E. coli

truyền học phân tử, phƣơng pháp phân loại vi khuẩn đã đƣợc bổ sung nguồn đặc
điểm phân loại theo genotype. Các kết quả nghiên cứu so sánh sinh hóa đã chứng
minh đƣợc rằng thành phần và trình tự nucleotide của DNA và rRNA, các loại gen
điều khiển trao đổi chất, thành phần và cấu tạo các bào quan là những bằng chứng
đáng tin cậy để xác định loài. Kết hợp với phƣơng pháp phân loại theo đặc điểm
hình thái (phenotype) thì phƣơng pháp phân loại dựa vào những phân tích, so sánh
trình tự gen đang đƣợc coi là công cụ để xác định vi khuẩn ở nhiều bậc định loại
loài. Đặc biệt phân tích trình tự của rRNA còn là phƣơng tiện để điều tra và định
danh những loài vi khuẩn không thể nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo [3]. Hiện
nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm 2 chủng đƣợc coi là 2 loài
riêng biệt nếu chúng giống nhau dƣới 70% khi tiến hành lai DNA. Keswani và cộng
sự (2001) đã chứng minh rằng nếu sự tƣơng đồng giữa hai trình tự gen 16S rRNA
thấp hơn 98,6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai DNA thấp hơn
70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tƣơng đồng 98,6% của trình tự gen 16S rRNA đƣợc
coi là ngƣỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa
học lấy giá trị này là 98% [43].
Phân loại vi khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử là sự phát hiện, mô tả,
và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài và các chủng
trong phạm vi một loài. Có thể dựa trên sự nghiên cứu so sánh các gen trong hệ gen
nhân, hệ gen các bào quan (ty thể và lục lạp) hoặc các sản phẩm của gen (protein,
enzyme). Trong các bào quan, ribosome là bào quan có vai trò sản xuất protein từ
những phân tử mRNA. Về cấu tạo, ribosome gồm có protein và rRNA. rRNA của
ribosome thƣờng bảo thủ giữa các loài và là vùng ít bị biến đổi. Những gen này tiến
hóa chậm hơn so với các gen khác, do vậy, chúng đƣợc sử dụng nhƣ những công cụ
để phân loại. Các rRNA thƣờng giống nhau. Khác với các vi khuẩn, ribosome nhân
chuẩn (Eukaryotes) chứa 4 loại phân tử rRNA là: 5S, 5,8S, 18S và 28S. Đối với các
vi sinh vật nhân sơ (Prokaryotes), ribosome chỉ chứa 3 loại phân tử rRNA là: 5S,
16S và 23S. Trong đó, gen 16S rRNA mã hóa cho phân tử rRNA loại 16S đƣợc xem
là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại các vi sinh vật nhân sơ. Gen mã hóa
cho 5S rRNA có kích thƣớc khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự,

Bên cạnh các gen rRNA, các gen độc tố cũng đƣợc sử dụng trong phân loại
học phân tử. Các gen này thƣờng là những gen gây độc nằm trong các vi khuẩn gây
bệnh ở các loài. Ví dụ, đối với E. coli O157:H7 các gen độc tố thƣờng đƣợc sử dụng
nhƣ gen Stx1, Stx2, eae, ehxA, saa... Hầu hết các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc sử
dụng để phát hiện và phân loại vi khuẩn đều là những phƣơng pháp hiện đại nhƣ
PCR, Real-time PCR, kỹ thuật LAMP...Mỗi phƣơng pháp có ƣu điểm và nhƣợc
điểm riêng phù hợp với từng đối tƣợng và các gen nghiên cứu. Việc sử dụng các
gen độc tố để phát hiện các vi khuẩn độc trong các mẫu nghiên cứu hoặc mẫu thực

Footer Page 25 of 148.