ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÙI KHÁNH LY
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI
(Stephania rotunda Lour) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2012-2016

Thái Nguyên, năm 2016

Thái Nguyên, 2015



Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập em đã
tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên khả năng nhân giống cây Bình Vôi
(Stephania rotunda Lour) bằng phương pháp in vitro”.
Kết thúc thời gian thực tập tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh họcCông nghệ Thực phẩm, đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Để đạt đƣợc kết
quả nhƣ ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu
Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh
học-Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện cho
em trong suốt thời gian thực tập.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Ngô Xuân Bình, ThS. Nguyễn
Thị Tình và ThS. Ma Thị Hoàn đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hƣớng dẫn em trong
thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể
và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập; cảm ơn bạn bè đã giúp
đỡ em trong thời gian vừa qua.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận không thể tránh khỏi những
thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn
để đề tài đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Bùi Khánh Ly


ii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [2] ................................4
Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất....................................................................25
Bảng 3.2: Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ, thời gian chất khử trùng HgCl2 đến khả

Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến
khả năng nhân giống invitro cây Bình Vôi. ..............................................................26
Biểu đồ 4.1: Biểu diễn ảnh hƣởng nồng độ, thời gian khử trùng của HgCl2 đến khả
năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro. (sau 7 ngày) .................................34
Biểu đồ 2: Biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi của cây
Bình Vôi sau 20 ngày nuôi cấy .................................................................................36
Hình 4.1: Chồi cây Bình Vôi trong MT bổ sung nồng độ BA kết hợp với các nồng
độ GA3 khác nhau sau 20 ngày nuôi cấy...................................................................38
Hình 4.2: Chồi cây Bình Vôi trong MT bổ sung tổ hợp BA với các nồng độ khác
nhau đến khả năng nhân nhanh sau 30 ngày nuôi cấy. .............................................40
Hình 4.3: Chồi cây Bình Vôi trong MT MS bổ sung nồng độ Kinetine khác nhau
đến khả năng nhân nhanh sau 30 ngày nuôi cấy. ......................................................42
Hình 4.4: Rễ cây Bình Vôi trong MT MS bổ sung than hoạt tính (0,5 g/l) và NAA ở
các nồng độ khác nhau sau 40 ngày nuôi cấy. ..........................................................44
Hình 4.5: Rễ cây Bình Vôi trong MT MS bổ sung than hoạt tính (0,5 g/l) và IBA ở
các nồng độ khác nhau sau 40 ngày nuôi cấy. ..........................................................46


iv
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

BA

: 6-Benzylaminopurine

GA3

: Gibberellic Acid

IBA


MT

: Môi trƣờng

NAA

: α-Naphthalene acetic acid

WHO

: World Health Organization


v
MỤC LỤC
Trang
Phần 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài .............................................................................2
1.2.1. Mục tiêu đề tài ...................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu đề tài ....................................................................................................3
1.3. Ý nghĩa của đề tài .................................................................................................3
1.3.1. Ý nghĩa trong khoa học: ....................................................................................3
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn: ....................................................................................3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................4
2.1. Giới thiệu chung về chi Bình vôi .........................................................................4
2.1.1. Nguồn gốc .........................................................................................................4
2.1.2. Phân loại Chi .....................................................................................................4
2.1.3. Đặc điểm hình thái và phân bố ..........................................................................4

3.1.2. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................25
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ......................................................25
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất .............................................................................25
3.4. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................26
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................26
3.5.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy invitro .............................................................26
3.5.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................26
3.5.3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................27
3.5.4. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm........................................................................30
3.6. Xử lí số liệu ........................................................................................................31
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................32
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ và thời gian sử dụng chất khử trùng
HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro. ..............................32
4.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của Cytokinine và Gibbererllin đến khả năng tái sinh
chồi cây Bình Vôi ......................................................................................................34


vii
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi
cây Bình Vôi từ đoạn thân mang chồi ngủ. ..............................................................34
4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với GA 3 đến khả
năng tái sinh chồi cây Bình Vôi từ đoạn thân mang chồi ngủ ..................................36
4.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số cytokinine đến khả năng nhân nhanh chồi
cây Bình Vôi. ............................................................................................................39
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh
chồi cây Bình Vôi .....................................................................................................39
4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ Kinetine đến khả năng nhân
nhanh chồi cây Bình Vôi ..........................................................................................41
4.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng một số Auxin đến khả năng ra rễ của cây Bình Vôi.....43
4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

0,3%. Roemerin có tác dụng gây tê niêm mạc, giãn mạch, hạ huyết áp.
Cepharanthin đƣợc coi là một chất có tác dụng kích thích miễn dịch và làm giảm
nhẹ một cách hữu hiệu những tác dụng phụ của các thuốc chống ung thƣ. Ngoài ra,
Bun Sok-Siya và cs (2009) đã chiết xuất cepharanthin có tác dụng ức chế 2 dòng tế
bào ung thƣ đại trực tràng và ung thƣ gan [40]. Mặt khác, còn ức chế sự phát triển
của trực khuẩn lao. Ngoài công dụng điều trị bệnh, củ Bình Vôi còn dùng làm vật
trang trí đẹp và đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng [5].


2

Ở Việt Nam củ Bình Vôi đƣợc tìm thấy ở những vùng có núi đá nhƣ: Hà
Giang, Tuyên Quang, Ninh Bình, Hòa Bình, Hà Tây, Hà Nam, Hải Phòng, Cao
Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Thanh Hóa. Tuy nhiên giá trị dƣợc liệu của củ Bình vôi
lại phụ thuộc rất nhiều vào vùng phân bố và điều kiện sinh thái.
Hiện nay, nguồn củ Bình vôi chủ yếu đƣợc khai thác từ tự nhiên mà ít có các
nghiên cứu về trồng trọt và nhân giống. Bình vôi nhân giống bằng hạt đƣợc tạo ra từ
quá trình thụ phấn giữa hoa đực và hoa cái [5]. Tuy nhiên cây cho hoa đực và cây
cho hoa cái nằm khác gốc vì vậy việc thụ phấn gặp nhiều khó khăn [46]. Với
phƣơng pháp cắt phần củ thành từng mảnh đem trồng không đem lại hiệu quả cao
do điều kiện thời tiết nóng ẩm mƣa nhiều của nƣớc ta, vi sinh vật hoạt động mạnh
dẫn đến thối củ. Vì vậy hiện nay củ Bình vôi đang rất khan hiếm trong tự nhiên và
đã đƣợc đƣa vào danh mục cần bảo tồn. Theo Nghị định số 32/2006, NĐ-CP ngày
30 tháng 3 năm 2006 của Chính phủ, trong danh mục “Thực vật rừng nguy cấp, quý
hiếm” thì các loài Bình vôi (Stephania sp.) đƣợc xếp trong nhóm IIA (Thực vật
rừng hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thƣơng mại) [5].
Phƣơng pháp nhân giống in vitro với những ƣu điểm là tạo ra những giống
cây trồng sạch bệnh, chất lƣợng tốt, đồng đều và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn.
Nhận thức đƣợc việc bảo tồn và phát triển loài cây thuốc quý tiềm năng, chúng
tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Bình Vôi

Góp phần nhân nhanh tạo số lƣợng lớn cây giống phục vụ mục tiêu bảo tồn
loài dƣợc liệu quý theo Nghị định số 32/2006, NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm 2006
của Chính phủ, đảm bảo nguồn nguyên liệu chất lƣợng cung cấp cho ngành y dƣợc.


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về chi Bình vôi
2.1.1. Nguồn gốc
Chi Bình vôi (Stephania) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) có nguồn
gốc ở miền Đông, Nam Châu Á và Australia [16]. Ở Việt Nam, cây mọc hoang
tại nhiều vùng rừng núi.
2.1.2. Phân loại Chi
Bảng 2.1: Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [2]
Giới (regnum)

Plantae

Ngành

Magloliophyta

Phân lớp

Magloliosida (Dicotyedones)

Bộ (ordo)


lƣợng mƣa 2000 – 2500 mm, ƣa đất nhiều mùn, thoát nƣớc, độ pH = 6,5-7.
Các loại Bình vôi có đặc điểm chung nhƣ sau: dây leo, thân nhẵn hơi xoắn vặn,
thƣờng xanh, sống lâu năm. Rễ củ đa dạng, có thể rất to và nặng tới gần 20kg, vỏ ngoài xù
xì màu nâu - nâu đen. Lá mọc so le, cuống lá dài, đính vào trong phiến lá khoảng 1/3;
phiến lá mỏng, hình tim, gần hình tròn, có cạnh hoặc tam giác tròn, hai mặt nhẵn; gân lá
xuất phát từ chỗ đính của cuống lá, nổi rõ ở mặt dƣới lá. Cụm hoa hình xim tán mọc ở kẽ
lá hoặc những cành già đã rụng lá; hoa đực và hoa cái khác gốc, hoa đực có 6 lá đài xếp
thành hai vòng, 3 cánh hoa màu vàng cam; nhị: 2-6, thƣờng là 4; hoa cái có 1 lá đài, 2 cánh
hoa; bầu hình trứng. Quả hạch hơi dẹt, mọng nƣớc màu đỏ hoặc da cam; hạt cứng, hình
móng ngựa, hình trứng hoặc gần tròn mang 4 hàng vân dạng gai, hai mặt bên lõm ở giữa
có lỗ thủng hoặc không. Mùa hoa: tháng 4-6; mùa quả: tháng 8-10 [11],[26].
Đặc điểm hình thái của một số loài Bình vôi [26], [43]:
Củ Bình vôi (Stephania rotunda Lour): Dây leo có rễ củ vùi dƣới đất một
nửa giống hình củ bình vôi, ruột màu vàng, thơm. Lá hình khiên, mọc cách. Phổ
biến ở các rừng thƣa Phú Thọ, Vĩnh Yên, Ninh Bình,…
Stephania pierrei Diels: Ngọn non có nhiều chấm màu tím hồng. Lá có kích
thƣớc nhỏ hơn tất cả các loài khác. Hoa đực không có cánh hoa.
S. hainanensis H.S. Lo et Y. Tsoong: Cành non và cuống lá có dịch màu
trắng hoặc vàng nhạt.


6

S. cambodia Gagnep: Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài khác.
S. dielsiana Y.C.Wu: Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt sau
có màu tím hay tím hồng.
S. excentria H.S.Lo: Cuống lá rất dài, có khi đến 14cm, giá noãn có lỗ
lệch một bên.
S. cepharantha Hay: Giá noãn không có lỗ.
S. sinica Diels: Giá noãn không có lỗ.

Liều dùng: 3 - 6 g/ngày. Thuốc ngâm rƣợu gồm bột Bình Vôi (1 phần) với rƣợu 40°
(5 phần); mỗi ngày uống 5 - 15 ml, có thể thêm đƣờng cho dễ uống. Để tránh bị ngộ
độc, chỉ nên sử dụng với liều nhỏ: Ngƣời lớn ngày uống 3 – 6g. Trẻ nhỏ dùng với
liều lƣợng 0,02 – 0,025g đối với trẻ 1 – 5 tuổi; 0,03 – 0,05g đối với trẻ 5 – 10 tuổi
[28]… Trong y học hiện đại, rotundin đƣợc dùng làm thuốc an thần, giảm đau, điều
trị một số trƣờng hợp rối loạn tâm thần chức năng, trạng thái căng thẳng thần kinh,
mất ngủ dai dẳng do nguyên nhân tâm thần [10]. Liều dùng: 0,05 - 0,10g/ngày, dƣới
dạng viên L - tetrahydropalmatin clorhydrat, mỗi viên 0,05g [28], [41].
Trong củ bình vôi chứa một lƣợng chất alkaloid bao gồm Ltetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Những hợp chất này
đƣợc sử dụng nhiều để điều chế thuốc, đặc biệt là thuốc an thần. Chất quan trọng
nhất là rotundin.
Các công trình khẳng định vai trò của Rotundin trong củ Bình vôi đã đƣợc
công bố nhƣ sau:
Năm 1941, DS.Trần Xuân Thuyết cùng với GS.TS Đỗ Tất Lợi, Bonnet và
Bùi Đình Sang đã chiết xuất từ củ bình vôi Stephania. Rotunda một hợp chất thuộc
nhóm alcaloid và đặt tên là rotundin. Năm 1965, chất này đƣợc xác định là L.
tetrahydropalmatin. Đƣa Việt Nam trở thành nƣớc đầu tiên trên thế giới chiết xuất
đƣợc rotundin.
Năm 1962, Fakhrutdinov Sf xác định roemerin gây tê niêm mạc và phong bế.
Đối với tim ếch cô lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số co bóp,
với liều cao tim ếch ngừng đập ở thời kỳ tâm trƣơng. Roemerin đối kháng với tác


8

dụng tăng co bóp ruột của acetylcholine. Đối với hệ thần kinh trung ƣơng với liều
thấp roemerin có tác dụng an thần gây ngủ, liều cao kích thích gây co giật dẫn đến
tử vong. Roemerin còn có tác dụng dãn mạch hạ huyết áp [37].
Theo kết quả nghiên cứu của Mutsuo Kozuka và cs (1984), Cepharanthin có tác
dụng dãn mạch nhẹ trên những mạch vi tuần hoàn, tăng cƣờng sinh sản kháng thể nên

2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nhu cầu sử dụng thuốc cho điều trị bệnh trên thế giới ngày càng tăng. Theo
thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) đánh giá cho đến nay 80% dân số thế giới
dựa vào nền y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu, trong đó
chủ yếu là thuốc từ cây cỏ. Thế giới hiện nay có hơn 35000 loài thực vật dùng làm
thuốc, trong đó có khoảng 2500 cây thuốc đƣợc buôn bán trên thế giới. Ở Châu Âu, có
ít nhất 2000 cây thuốc đƣợc sử dụng. Ở Châu Á, có khoảng 5000 loài ở Trung Quốc,
1700 loài ở Ấn Độ, trong đó có đến 90% thảo dƣợc thu hái hoang dại [1].
Năm 1944, Kondo (Nhật) đƣa ra công thức khai triển của rotudin với công
thức thô là C13H19(OCH3)3CH3N.
Năm 1950 và 1952 Qiaudry G. R và Siddiqui (Ấn Độ) đã nghiên cứu và
chiết từ củ cây Stephania Glabra (Roxb). Miers nhiều alkaloit và đặt tên là
hyndarin C23H25O4N, Stefarin C18H9O3N và cyckanin C 38H42O6N trong đó
hyndarin chiếm thành phần chủ yếu (chừng 30% hyndarin, 15-18% stefarin và
rất ít cyckanin). Nghiên cứu cấu tạo hyndarin ngƣời ta thấy rằng hyndarin thực ra
cũng chỉ là một alkaloit đã biết có tên là tetrahydropanmatin [11].
Trƣớc năm 1965, ngƣời ta vẫn cho rằng hyndarin và rotundin là hai alkaloit
khác nhau vì chiết từ hai cây khác nhau, mọc tại hai nƣớc khác nhau. Nhƣng đến
năm 1965, Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có tinh dầu toàn liên bang Xô Viết cũ
(VILAR) có dịp so sánh hai cây, một di thực từ Ấn Độ, một di thực từ Việt Nam,
thấy rằng hai cây chỉ là một loài nên đã kiểm tra lại tính chất của rotundin và đã xác
định rotundin và hyndarin chỉ là một chất và có cấu tạo của tetrahydropanmatin.
Năm 1965 tại Liên Xô cũ, Phan Quốc Kính và cs cũng chiết từ củ Bình vôi
mang từ Việt Nam sang một số alkaloit và đặt tên là alkaloit A, alkaloit C và D với
tỷ lệ 0,08% mỗi thứ (Hoá học các hợp chất thiên nhiên, 6-1965) [11].


10

2.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

11

S.cambodia Gagnep (thu ở Lâm Đồng), 0,29% ở loài S.cepharantha (thu ở Hà Sơn
Bình), 0,21% ở loài S.peirrei Diels (thu đƣợc ở Tây Nguyên) [4].
Năm 2007, Thủ tƣớng chính phủ ra quyết định phê duyệt "Chƣơng trình
nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hoá
dƣợc đến năm 2020" nhiệm vụ đề ra trong Lĩnh vực 1: Kế thừa và phát huy các kết
quả nghiên cứu khoa học công nghệ trƣớc đây để sản xuất các hoạt chất thiên nhiên
từ thanh hao hoa vàng, hoa hoè, chè xanh, gấc,...Chiết tách, bán tổng hợp một số
hoạt chất chính sau đây để làm nguyên liệu sản xuất thuốc, có đề cập tới Nội dung :
Sản xuất L-rotundin và L-rotundin sulfat từ củ Bình Vôi (stephania rotunda) và
D,L-rotundin sulfat từ palmatin hydrochlorid chiết xuất từ cây hoằng đằng
(Fibraurea tinctoria) [29]
Năm 2010, Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn Vinh đã tiến hành nghiên cứu
nhân giống in vitro và khảo sát hợp chất anlkaloid rotudine từ cây Bình vôi
(Stephania rotunda Lour) [15].
Nghiên cứu bảo tồn và phát triển cây dƣợc liệu tạo ra các sản phẩm hàng
hóa có sức cạnh tranh trên thị trƣờng. Phát triển các giống cây đẳng sâm, hoàng
đằng, thạch hộc, kê huyết đằng, cẩu tích, sa nhân, thiên niên kiện, thổ phục linh, lan
kim tuyến, trà hoa vàng, cây mật nhân, Sâm Cau, Bình Vôi, Gấc [3].
2.4. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật
2.4.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi
cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trƣờng nhân tạo trong điều kiện vô trùng [14].
Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thƣờng sử dụng cho việc
ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận
khác nhau của thực vật với kích thƣớc nhỏ [14].
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thƣờng dùng thuật ngữ nuôi cấy mô và
nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các phƣơng thức
nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau [15].

vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trƣởng, chồi nách, đoạn thân…
Sharma G.J. (2005) [36] đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt thân rễ cây
địa liền và cây ngải máu. Sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl 2 0,2% trong 15


13

phút để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu. Dƣơng Tấn Nhựt và cs (2011) [33]
tiến hành khử trùng lá cây Sâm Ngọc Linh bằng cồn 70% trong 30 giây và HgCl2
trong 5 phút thu đƣợc tỷ lệ mẫu sạch cao.
2.5.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy
Là giai đoạn khử trùng đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trƣởng tốt.
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mô đƣợc đƣa vào nuôi cấy. Quá trình này
đƣợc điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trƣởng (tỷ lệ
auxin/cytokinin) đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Nayak S. và cs (2011) [32]
nghiên cứu nhân giống cây riềng in vitro cho thấy: Khi thử nồng độ BA từ 1 - 3
mg/l đến khả năng bật chồi thì cho thấy ở nồng độ BA 3mg/l cho kết quả tốt
nhất. Behera K.K. và cs (2010) [30] sử dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để
cảm ứng chồi cây nghệ vàng. Bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu
đem vào nuôi cấy. Thƣờng các mô non, chƣa phân hoá có khả năng tái sinh cao
hơn những mô đã chuyển hoá.
2.5.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lƣợng
thông qua các con đƣờng: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô
tính. Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Để tăng hệ số nhân chồi
ngƣời ta thƣờng đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy các chất điều h ̣a sinh trƣởng
(auxin, cytokinin,…), các chất bổ sung khác nhƣ nƣớc dừa, dịch chiết nấm
mem,…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp. Chế độ nuôi cấy
thƣờng là 25-27ºC, có 16 giờ chiếu sáng/ngày, cƣờng độ ánh sáng 2000 - 4000

Theo Goer (1993) để đƣa cây từ ống nghiệm ra vƣờn ƣơm với tỉ lệ sống
cao, cây sinh trƣởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,
số rễ, chiều cao cây).
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nƣớc.
- Phải chủ động điều chỉnh đƣợc độ ẩm, sự chiếu sáng của vƣờn ƣơm cũng
nhƣ có chế độ dinh dƣỡng phù hợp.


15

2.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.6.1. Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực
vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay
bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), các cấu trúc của phôi (lá mầm,
trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…) [24].
Tuy mang cùng lƣợng thông tin di truyền nhƣng các cấu trúc mô khác nhau trên
cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc
lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lƣợng
cây lấy mẫu, kích thƣớc và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy [24].
Mẫu nuôi cấy trƣớc khi đƣa vào nuôi cấy phải đƣợc vô trùng. Phƣơng pháp
phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu
diệt vi sinh vật. Hóa chất đƣợc lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện:
Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu quả vô
trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật
của hóa chất. Một số hóa chất thƣờng đƣợc sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là:
Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2-thủy ngân
clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin…) [24].
2.6.2. Điều kiện nuôi cấy

sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng
thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày [23].
Cƣờng độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy.
Theo Ammirato (1986): Cƣờng độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trƣởng
của mô sẹo. Ngƣợc lại, cƣờng độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn
chung cƣờng độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux, ngoài ra
chất lƣợng ánh sáng cũng ảnh hƣởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật
in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng
trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vƣơn cao nhƣng lại có
ảnh hƣởng tốt tới sự sinh trƣởng của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí